В резком контрасте к дифференцированным соматическим клеткам, в которых регуляторы клеточного цикла периодически флюктуируют, мышиные ESCs (mESCs) обнаруживают стабильные и высокие уровни активаторов клеточного цикла (высокую активность cdk2-cyclin E/A и cdk6-cyclin D3) и отсутствие ингибиторов клеточного цикла (cdk ингибиторов p21cip и p27Kip1, и из семейства INK4a члена p16INK4a) (Faast et al. 2004; Becker et al. 2010). В соматических клетках переход от G1 к S фазе нуждается в преодолении G1-to-S restriction (R) checkpoint, где клеточный цикл становится независимым от внешних факторов роста и предопределяется инактивацией pRb белка, сопровождаемого последующим высвобождением E2F факторов (Blagosklonny and Pardee 2002). В mESCs, pRb постоянно инактивирован с помощью гиперфосфорилирования, что ведет к постоянной активности E2F TFs, это, в свою очередь, делает возможным R-point-независимое быстрое прохождение через G1 фазу (Savatier et al. 1994; Stead et al. 2002). Хотя и наблюдались различия при сравнении с mESCs (Conklin and Sage 2009), сходные механизмы, по-видимому, регулируют и человеческие ESCs (hESCs). В самом деле, способность поддерживать, по крайней мере, два независимых раунда клеточных делений в отсутствие внешних ростовых факторов подтверждает существование аутокринных механизмов, поддерживающих R-point-независимые клеточные деления в hESCs (Becker et al. 2010). Следовательно, в противовес соматическим клеткам, которые зависят от передачи митотических сигналов, чтобы пройти через точку R, ESCs пролиферируют независимым от митогенов способом, приводя к короткой G1 фазе. Считается, что ESCs инициируют дифференцировку во время G1 фазы, это составляет "промежуток благоприятной возможности" ("window of opportunity"), в котором, напр., может накапливаться онтогенетический сигнал до тех пор, пока он не преодолеет пороговый уровень, который запустит путь дифференцировки. Следовательно, контроль длины G1-фазы становится способом контроля перехода к дифференцировке (Savatier et al. 1996; Burdon et al. 2002; Jirmanova et al. 2002). Эта концепция подкреплена тем фактом, что pRb, в зависимости от специфического клеточного контекста, может также действовать как транскрипционный активатор или репрессор генов, который функционируют как мастер индуктор дифференцировки. pRb, как было установлено, выполняет чёткую роль по выбору мезенхимными стволовыми клетками между адипоцитарной в противовес остеогенной судьбе; в этом случае отсутствие pRb склоняет выбор в направлении судьбы адипоцитов и, более того, восстанавливать детерминированные преостеобласты в предшественники с мультипотентным состоянием (Calo et al. 2010). Однако прямая механистическя связь между клеточным циклом и дифференцировкой всё ещё отсутствует.
Информация о роли этих ESC-специфических miRs была получена благодаря анализу Dicer-нулевых и DGCR8-нулевых линий ESC. В обоих случаях линии жизнеспособны, полностью лишены своего репертуара зрелых канонических miRs, и обнаруживают сходные фенотипы. Обе клеточные линии поддерживают экспрессию маркеров плюрипотентности и пролиферируют более медленно по сравнению с дикого типа ESCs. Они также неспособны эффективно подавлять маркеры плюрипотентности и позитивно регулировать маркеры дифференцировки, когда их заставляют дифференцироваться. Однако фенотипы не идентичны. После делеции обоих аллелей
Dicer, mESCs испытывают полный блок пролиферации (Kanellopoulou et al. 2005; Murchison et al. 2005) и напоминают фенотип, возникающий при нокауте всех четырех членов семейства Argonaut (Su et al. 2009). Длительное культивирование Dicer-нулевых клеток в конечном итоге дает колонии, которые пролиферируют со скоростью, сравнимой с той, что у DGCR8-нулевых ESCs (Murchison et al. 2005). Напротив, DGCR8-нулевые клетки не обнаруживают такого полного инициального блока пролиферации (Wang et al. 2007). Отсутствие Dicer, но не DGCR8, как было установлено, приводит к нестабильности гетерохроматина (Kanellopoulou et al. 2005), но этот результат не удалось воспроизвести др. группой исследователей (Murchison et al. 2005). Dicer также участвует в поддержании теломер и метилировании ДНК (Benetti et al. 2008), DGCR8 не был исследован в этом отношении. Некоторые из этих различий могут быть объяснены вовлечением Dicer в созревание non-Microprocessor-dependent эндогенных siRNAs и др. малых РНК (Babiarz et al. 2008). Следовательно, роль miRs в ESCs лучше всего иллюстрируется в DGCR8-нулевых линиях. Анализ клеточного цикла DGCR8
-/- клеток выявил, что они накапливаются в G1 фазе клеточного цикла, указывая на дефект перехода от G1 к S-фазе. Отборочное испытание в отношении эффекта индивидуально вносимых 461 miRs на пролиферацию DGCR8-нулевых клеток показало, что дефект может быть устранен 14 разными miRs. Эти восстанавливающие miRs относятся к нескольким разным семействам miRs (в основном к miR-290, miR-302 и к miR-17-92 кластерам), которые экспрессируются на высоком уровне в ESCs и подавляются после дифференцировки. Они коллективно были названы ESCC (ESC-specific cell cycle-regulating) miRs, и, что важно, они обладают одной и той же или очень сходной порождающей (seed) последовательностью, указывая тем самым, что они избыточно направлены на одни и те же мишени. Изучение этих мишеней открыло p21cip, Retinoblastoma-like 2 (Rbl2) белок и Lats2, все ранее известные как ингибиторы cyclinE/cdk2 пути, который регулирует G1/S переход. ESCC miRs гарантируют быстрое прохождение через точку R путем подавления этих ингибиторов и , следовательно, усиления активности cyclinE/cdk2 (Wang et al. 2008; Smith et al. 2010). По крайней мере, один член ESCC семейства, miR-106, как было установлено, независимо индуцирует прохождение клеточного цикла путем подавления p21cip (Ivanovska et al. 2008). Эти результаты оказались согласующимися с предыдущим сообщением, показавшим, что уровни белка p21cip (но не уровни мРНК) увеличиваются после дифференцировки ESCs (Sabapathy et al. 1997). Важно, что др. miRs были идентифицированы благодаря сходным ролям. miR-372 и miR-92b (обильно экспрессируемые в hESCs) нацелены на p21cip и p57 (др. ингибитор продвижения G1/S), соотв., а miR-195как было установлено, подавляет G2-M checkpoint inhibitory kinase WEE1, ингибитор G2 cyclin B-Cdk комплекса (Qi et al. 2009; Sengupta et al. 2009). Эти результаты ясно показывают, что в ESCs, miRs перекрываясь противодействуют ингибиторам клеточного цикла (Fig. 3, below), эффективно удаляя эти тормоза и играя критическую роль в становлении и поддержании специфического профиля клеточного цикла ESC.
The role of miRs in ESC differentiation
Молекулярный механизм, лежащий в основе неспособности ESCs, лишенных miRs, эффективно замалчивать маркеры плюрипотентности после дифференцировки, был исследован в дифференцирующихся Dicer-нулевых ESCs (Benetti et al. 2008; Sinkkonen et al. 2008). Две группы идентифицировали Rbl2, транскрипционный репрессор, в качестве мишени для miR-290 miR семейства, и установили. что эти клетки обнаруживают пониженные уровни ДНК метилтрансфераз Dnmt3a и Dnmt3b, участвующих в de novo метилировании ДНК. Активность de novo метилирования ДНК может быть восстановлена с помощью экзогенной экспрессии de novo метилтрансфераз или с помощью внесения членов семейства miR-290. Принимая во внимание предыдущее исследование (Feldman et al. 2006), установившего, что замалчивание маркеров плюрипотентности нуждается в метилировании de novo, Benetti et al. (2008) и Sinkkonen et al. (2008) предположили, что отсутствие miR-290 семейства ведет к активации Rbl2, который транскрипционно репрессирует de novo ДНК метилтрансферазы и вызывает наблюдаемую неспособность Dicer-/- клеток замалчивать маркеры плюрипотентности и дифференцироваться. Однако др. miRs также необходимы, чтобы полностью подавлять ключевые белки плюрипотентности для осуществления дифференцировки (Fig. 2; Wang et al. 2008). Эксперименты с потерей и избыточностью функции показали, что во время дифференцировки mESCs активируют miR-134, miR-296 и miR-470, которые находят и подавляют Nanog, Oct4, и Sox2 (Tay et al. 2008); сходным образом, miR-200c, miR-203 и miR-183 репрессируют Sox2 и Klf4 (Wellner et al. 2009). В дифференцирующихся hESCs, miR-145 репрессирует Oct4, Sox2 и Klf4 (Xu et al. 2009).
Др. пример связан с let7 семейством и иллюстрирует, как переход от недифференцированного к дифференцированному состоянию может быть изменен с помощью сложного взаимодействия между разными семействами miR. pri-let7 транскрибируется в ESCs (Thomson et al. 2006; Wulczyn et al. 2007), преобразуется в pre-let7 и экспортируется в цитоплазму (Rybak et al. 2008). Однако, зрелые члены семейства let7 по существу отсутствуют в ESCs и накапливаются только после ESC дифференцировки, что в конечном итоге заканчивается широкой экспрессией в дифференцированных типах клеток (Viswanathan et al. 2008). Это наблюдение подсказывает предположение, что let7 семейство может быть вовлечено в завершение программы плюрипотентности после дифференцировки (Melton et al. 2010). Трансфекция let7 в DGCR8
-/- клетки устраняет дефекты дифференцировки, позволяя клеткам выключать программу самообновления более эффективно. Однако трансфекция let7 в DGCR8 дикого типа клетки (или в DGCR8-нулевые клетки, которые получают членов семейства ESCC miR вместе с let7) не обнаруживает эффекта на экспрессию генов плюрипотентности. Это привело к модели, согласно которой члены семейств ESCC и let7 противодействуют др. др., при этом ESCC способствуют состоянию плюрипотентности, а семейство let7 противостоит ему (Fig. 2; Melton et al. 2010). Анализ микромассивов выявил, что механизм, лежащий в основе этого эффекта обусловлен не только воздействием каждого семейства miR на мРНК, обладающие соотв. мишенями, сайтами связывания, но и также противоположными эффектами семейств miRs на TFs c-Myc и n-Myc. ESCC члены семейства miR позитивно регулируют c-Myc посредством ещё неизвестного механизма, возможно подавляя ингибитор c-Myc. В определенных клеточных контекстах члены семейства let-7 непосредственно находят и подавляют c-Myc (Kumar et al. 2007). В ESCs, эффект let7 на c-Myc меньше, но он строго подавляет n-Myc, и, следовательно, семейство let7 подавляет набор мРНК транскриптов, которые находятся под позитивным транскрипционным регуляторным контролем с помощью c-Myc и n-Myc. Др. транскрипты, как было установлено, также являются предметом этой "решительной схватки" и среди них два выделяются существенно. Один это Sall4, TF, участвующий в плюрипотентности. Второй это Lin28, который экспрессируется на высоком уровне в ESCs и подавляется после дифференцировки (Newman et al. 2008; Viswanathan et al. 2008). Lin 28, как было установлено, соединяется pre-let7 и способствует его полиуридилированию (polyuridylation), приводя как к ингибированию активности Dicer , так и направлению pre-let7 на деградацию (Heo et al. 2008). Lin28 также регулирует сходным образом и др. miRs (miR-107, miR-143 и miR-200c) (Heo et al. 2009). Промотор Lin28 оккупируется совместно трио Oct4-Sox2-Nanog , а также Tcf3 (Marson et al. 2008), указывая тем самым, что он находится под их транскрипционным контролем. Истощение Lin28 само по себе не заставляет клетки дифференцироваться. Однако когда дифференцировка начинается, то уровни трио Oct4-Sox2-Nanog начинают падать, приводя возможно к подавлению Lin28. Это должно делать возможным накопление зрелых let7 и дальнейшее подавление экспрессии Lin28 благодаря соединению непосредственно с его мРНК (Reinhart et al. 2000; Rybak et al. 2008). Как только критический порог будет преодолен семейство let7 делает доминантным семейство ESCC и переход оказывается стабилизированным. Следовательно, взаимодействие Lin28/let7 обеспечивает соотв. степень ошибкоустойчивости при переключении дифференцировки (Melton et al. 2010). Эти результаты подчеркивают, как miRs могут быть использованы на нескольких отличающихся уровня., чтобы быстро и скоординировано обновлять белки ключевых регуляторов данного клеточного фенотипа, чтобы облегчить установление нового фенотипа (Fig. 2).
Integration of miRs into the basic molecular circuit of pluripotency
Интеграция экспрессии miR в сеть, управляющую плюрипотентностью, нуждается в картировании miR промоторов и анализе их местоположения с помощью тетрады ключевых TFs плюрипотентности (Oct4, Sox2, Nanog и Tcf3) (Marson et al. 2008). Приблизительно 20% от всех известных miRs находятся под контролем тетрады из TFs и эти miRs могут быть подразделены на две группы: одна представлена miRs, активными в ESCs , и чьи промоторы оккупируются тетрадой (большинство из которых уже участвует в поддержании плюрипотентности, такие как группа ESCC miR и семейство let7), и вторая группа miRs, неактивная в ESCs (но активируемая в дифференцированных клетках), чьи промоторы оккупируются тетрадой и и PcG-репрессивными комплексами. В др. работе было установлена прямая связь между экспрессией ESC-специфических miRs и семейством TFs Myc. И c-Myc и N-Myc, как было установлено, соединяются с промоторами кластера ESC-специфических miR-290 (Chen et al. 2008); c-Myc, как было показано, активируют экспрессию нескольких ESC-специфических miRs (Card et al. 2008; Lin et al. 2009; Smith et al. 2010), и, в свою очередь, miR-294 может косвенно активировать экспрессию c-Myc (Melton et al. 2010). Следовательно, общая стратегия транскрипционного контроля, используемого регуляторным состоянием ESC, применима в точности к белкам и miR-кодируемым генам (Fig. 3).
The role of miRs in reprogramming
Два базовых результата, на которых основывается область прямого репрограммирования, это открытие. что фибробласты могут быть репрограммированы в iPSCs путем доставки с помощью ретровирусов двух групп ESC регуляторов: Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc, с одной стороны, (Takahashi and Yamanaka 2006) и Oct4, Sox2, Nanog и Lin28, с др. стороны (Yu et al. 2007). Недавно ряд сообщений подчеркнули роль miRs в репрограммировании. Некоторые из членов репрограммирующих коктейлей имеют связи с miR ("miR connections"). Как упоминалось выше, Oct4, Sox2, Nanog и c-Myc, по-видимому, контролируют экспрессию ESC-специфических семейств miR, при этом Oct4, Sox2 и Nanog индуцируют экспрессию miR-290 и miR-302 кластеров (Barroso-delJesus et al. 2008; Card et al. 2008; Marson et al. 2008) , а c-Myc индуцирует miR-17-92 кластер (O'Donnell et al. 2005). c-Myc может также репрессировать членов семейства let7 косвенно посредством активации Lin28B (Chang et al. 2009), тогда как Lin28 контролирует и контролируется с помощью семейства let7 (John et al. 2004; Heo et al. 2008; Newman et al. 2008; Rybak et al. 2008). Известно, что временная избыточная экспрессия ESC-специфических miRs может замещать c-Myc, когда репрограммирование фибробластов с помощью Oct4, Sox2 и Klf4, с помощью miR-294 увеличивает эффективность выхода iPSC ~20 раз (Judson et al. 2009), но добавление и c-Myc и miR-294 в одно и то же время не оказывает эффекта, указывая тем самым, что одной из причин в основе эффекта усиления с помощью c-Myc на репрограммирование является индукция ESC-специфических miRs. В одной работе было показано, что избыточная экспрессия только miR-302 может репрограммировать раковые клетки человека в iPSC состояние (Lin et al. 2008), а недавно это наблюдение было расширено на клетках волосяных фолликулов человека (Lin et al. 2010). Противоположный эффект ESCC и let7 miR семейств понуждает проверить гипотезу, что подавление семейства let7 может усиливать эффективность репрограммирования фибробластов, и было установлено, в самом деле, ингибирование let7 с помощью антисмыслового ингибитора может усиливать эффективность репрограммирования, при использовании Oct4, Sox2 и Klf4, независимо от того, будет ли c-Myc добавлен в смесь (Melton et al. 2010).
Др. пример, в котором miRs участвовали в репрограммировании связан с вопросом, идентичны ли iPSCs (т.e., полностью репрограммированные) с ESCs. Этот вопрос ё
обсуждается, но недавние находки показали, что это так, если сравниваются mESCs и iPSCs с идентичными генетическими фонами, транскрипционный профиль чрезвычайно сходен за исключением одного локуса:
Dlk1-Dio3 (Stadtfeld et al. 2010). Этот локус отцовски импринтирован и поэтому гены, его кодирующие, экспрессируются с материнского аллеля в ESCs. Известно, что большинство iPSCs неспособны реактивировать материнский аллель и статус реактивации локуса
Dlk1-Dio3 в iPSCs, как было установлено, коррелирует со способностью этих клонов давать жизнеспособных мышей путем тетраплоидной комплементации; отсутствие реактивации приводит к эмбриональной летальности. Отметим, что локус
Dlk1-Dio3 кодирует ~50 miRs, и 18 из них экспрессируются в ESCs, но не в iPSCs. Однако доказательства указывают на то, что miRs с локуса
Dlk1-Dio3 участвуют в эмбриональном развитии и не являются частью самообновляющейся сети плюрипотентности.
Transitions between cell states
Переходы между клеточными состояниями могут участвовать в генерации промежуточных состояний. Два недавних исследования (Li et al. 2010; Samavarchi-Tehrani et al. 2010) подтвердили, что самое раннее состояние репрограммирования удивительно похоже на мезенхимно-эпителиальный переход (mesenchymal-to-epithelial transition (MET)), показывая тем самым, что инициация репрограммирования маркируется подавлением мезенхимных маркеров, таких как Snail и N-Cadherin и активацией эпителиальных маркеров, таких как E-cadherin и Epcam. Избыточная экспрессия Snail- или RNAi-обусловленное подавление E-cadherin-оба события, как известно, ингибируют MET-существенно снижая формирование iPSC. Избыточная экспрессия miR-200 и miR-205 (которые, как было установлено, подавляют мезенхимные гены в контексте MET) в фибробластах ускоряет активацию связанных с MET генов по сравнению с контролем (Li et al. 2010; Samavarchi-Tehrani et al. 2010). Эти результаты подчеркивают концепцию, что переходы между клеточными состояниями могут управляться подавлением молекулярной поддержки инициального состояния, тогда как активация молекулярной поддержки финального состояния независимо от того обеспечивается поддержка собственно TF, miR или обоими.
Conclusion
miRs are important components of the regulatory network that governs ESCs. The study of gene regulation in many different systems has led to the observation that certain regulatory motifs are found repeatedly. The study of their structure has allowed certain basic types to be defined: Examples of these motifs are positive or negative feedback loops and coherent or incoherent feed-forward loops, where a small number of molecules (proteins or RNAs) are functionally related to each other in a way that forms an operational unit with predictable behavior (Alon 2007). A gene regulatory network can be seen as a complex structure formed by the association of many such operational units. In many cases, miRs are structural components of these regulatory motifs, and their absence can have major consequences on the behavior of the regulatory network they are a part of. The concept that miRs are central to the ESC phenotype is highlighted by the simple observation that ESCs that lack miRs cease, in fact, to be stem cells. Indeed, the definition of an ESC is an operational one: Above all, a stem cell must self-renew; i.e., it must be capable of ongoing cell division in vitro while retaining the ability to differentiate to all cell types of the adult organism. The analysis of the phenotype of DGCR8- or Dicer-null ESCs clearly shows that they no longer fulfill this requirement, as lack of miRs results in the cells remaining trapped in a state of ongoing cell division. When induced to differentiate, they fail to turn off the pluripotency regulatory program. Turning off pluripotency and switching to differentiation are aspects of a single molecular network, which cannot function normally in the absence of miRs. It would not be surprising to find novel ways in which miRs are integrated into (and necessary for) the normal function of the self-renewal regulatory program.
Сайт создан в системе
uCoz
