| fc | fcm | FURMAS | | |

Межклеточные слияния являются фундаментальным процессом, который происходит среди ограниченного числа клеточных типов. Эти типы клеток или соседствуют или мигрируют, корректно распознают и слипаются др. с др. (Oren-Suissa and Podbilewicz,2007). Как результат липидные бислои таких типов клеток сливаются и образуется синцитий; этот процесс помимо миогенеза также фундаментален для образования зигот, образования гиподермы, остеокластов и плаценты.

Слияние миобластов типично и существенно для миогенеза у высших организмов и необходимо для роста и репарации мышц у позвоночных. У holometabolic насекомых миогенез осуществляется во время эмбриогенеза, а также во время метаморфоза (rev. Maqbool and Jagla,2007). Личиночные мышцы формируются в виде стереотипического паттерна в каждом сегменте (Fig. 1A). Каждая личиночная мышца соответствует одной мышечной трубке, содержащей 4 - 24 ядер (Baylies et al.,1998). Молекулы, которые идентифицированы как регулирующие слияние миобластов у Drosophila суммированы в Table 1.

Figure 1. Schematic representation of muscle formation, attachment, and sacromere assembly. Following myoblast specification, mononucleated myoblasts fuse to form multinucleated myotubes. A: Muscles form a reiterated pattern from segment to segment. The muscles are visualized by anti-?3-Tubulin. Anterior is left and dorsal at the top. B: The cell adhesion molecule Duf/Kirre is distributed in a ring-shaped manner at the contact site of a growing muscle and an fcm. B1, B2, B3: Optical sections through one contact site. Fusion proceeds in two phases. C-1: During the first fusion phase, an fc fuses with fcms and a 2-3 nucleated precursor cell forms. C-2: This precursor cell behaves like an fc and undergoes subsequent fusion events until the final size of the muscle is reached. In parallel to these fusion events, the growing myotube migrates, as indicated by the arrows, towards its epidermal muscle attachment cells, the tendon cells. C-3: Attachment sites have been established. C-4: Sarcomere assembly completes the myogenesis process.

Table 1. List of Proteins That Are Known to Be Required for Drosophila Myoblast Fusion


Proteins          Protein class and function        Localization        Source
Transmembrane proteins
Duf/Kine        IgSF, recognition and adhesion        FC               Ruiz-Gomez et al. (2000)
Hbs        IgSF, recognition and adhesion        FCM                  Artero et al. (2001); Dowark et al. (2001)
Rst/Irre C        IgSF, recognition and adhesion        FC and FCM        Strunkelnberg et al (2001)
Singles bar        Proposed function: vesicle trafficking        FCM        Estrada et al. (2007)
Sns        IgSF, recognition and adhesion        FC and FCM             Bour et al. (2000)
Signaling molecules
Arf6        GTPase, actin regulation or vesicle trafficking        Uncertain        Chen et al. (2003)
Blow        F-actin regulation        FCM                   Doberstain et al. (1997), Artero et al. (2003); Schroter et al., (2006)
Cdc42        GTPase, F-actin regulation        Uncertain         Schafer et al. (2007)
Crk        Adaptor protein        Uncertain                 Erickson et al. (1997); Balagopalan et al. (2006)
Mbc        Nucleotide exchange factor for Rac        Uncertain        Rushton et al. (1995); Erickson et al. (1997)
Mind bomb 2        E3 ubiquitin ligase        FC                Nugyen et al. (2007); Carrasco-Rando and Ruiz-Gomez (2008)
Rac1, Rac2        GTPases, F-actin regulation        Uncertain        Hadeka-Suzuki et al. (2002)
Rols        Stabilization of adhesion, signalling        FC        Chen et al. (2001); Menon et al. (2001); Rau et al. (2001)
Schizo/Loner        Nucleotide exchange factor for Arf6        FC and FCM        Chen et al. (2003); Richardson et al. (2007)
Actin regulators
ArpC1        Subunit of the Arp2/3 complex        Uncertain        Massarwa et al. (2007)
Arp3        Subunit of the Arp2/3 complex        Uncertain        Berger et al. (2008)
Kette/Nap-1        Component of the Wave complex        FC and FCM        Schroter et al. (2004)
SCAR/WAVE        Arp2/3 activator        Uncertain                Richardson et al. (2007); Berger et al. (2008)
Vrp1        WASP-interacting partner        FCM               Kim et al. (2007); Massarwa et al. (2007)
WASP        Arp2/3 activator        FCM                   Massarwa et al. (2007); Schafer et al. (2007)

У Drosophila, слипчивость гетерологических клеток, т.е. founder cell (fc) и fusion-competent myoblast (fcm) является предварительным условием для последующего слияния миобластов, сопровождаемая локальным накоплением и ветвлением F-актина (Kesper et al.,2007; Kim et al.,2007; Richardson et al.,2007). Было предположено, что сигнальные пути, инициируемые с помощью успешной клеточной адгезии между fcs и fcms, передают сигналы к слиянию от клеточной мембраны к актиновому цитоскелету (rev. Chen and Olson,2004). Недавние данные показали, что клеточная адгезия ведет к сборке мультибелковых комплексов в месте слияния (Kesper et al.,2007; Kim et al.,2007; Richardson et al.,2007), которые были названы FuRMAS, специфическая Fusion-Restricted Myogenic-Adhesive Structure, которая содержит F-actin в месте клеточного контакта в виде пробок/фокусов (plugs/foci) (Kesper et al.,2007).

Мы полагаем, что FuRMASs обладают свойствами сигнальных центров и действуют как платформы для рекрутирования белков, связанных со слиянием.

AN OVERVIEW OF MYOBLAST FUSION

У Drosophila, главный миобласт, известный также как клетка основательница (fc), диктует качественные характеристики мышцы в отношении, напр., её размера, индивидуального положения и специфического прикрепления к эпидермису. Уникальные характеристики fc предопределяются дифференциальной экспрессией нескольких транскрипционных факторов, напр., Kruppel, Eve, Slouch, и Ladybird (rev. Baylies et al.,1998; Frasch,1999). Напротив, единственная характеристика, связанная с транскрипционным фактором, а именно, Gli-подобный фактор Lame Duck/Myoblast incompetent/Gleeful, известна для fcms (Duan et al.,2001; Ruiz-Gomez et al.,2002). После слияния fc-fcm, геном fcm перепрограммируется и воспринимает судьбу fcs. Такое репрограммирование необходимо для деградации белков, специфически экспрессирующихся в fcm. Mind bomb 2 (Mib2), как полагают, участвует в деградации характерного для fcm фактора Lame Duck (Carrasco-Rando and Ruiz- Gomez,2008) и также необходим для мышечной интеграции и стабильности (Nguyen et al.,2007).

У Drosophila, слиянию миобластов предшествуют две временные фазы, занимающие 5.5 ч, при этом индивидуальное событие слияния занимает лишь около минуты (Beckett and Baylies,2007). В первой временной фазе слияния каждая fc сливается с fusion-competent myoblast (fcms), чтобы сформировать двухядерную или трехядерную клетку (Fig. 1C-1), известную как предшественник (Bate,1990; Bate and Rushton,1993). Во второй временной фазе слияния эта клетка предшественница удлиняется вплоть до финального размера, достигаемого мышцей. Согласно альтернативной модели, предполагается, что помимо временных различий существуют генетические различия между этими двумя фазами слияния, это означает, что некоторые гены необходимы для дальнейшего хода от стадии предшественника к финальному размеру мышечной трубки (см. раздел Two-Temporal-Phases of Fusion and the Two-Phase Myoblast Fusion Model).

Dj время первой фазы, fcs и fcms отличаются лишь слегка по размеру, а диаметр клеток приблизительно соответствует области контакта и слияния (Fig. 1C-1). Во второй фазе, однако, часто несколько fcs прикрепляются к растущей мышечной трубке (Fig. 1C-2). На этой стадии, как полагают, индивидуальная fcm является маленькой по сравнению растущей мышечной трубкой (Fig. 2A). Поэтому механизм ограничения области слияния может быть более важным для второй, чем для первой стадии слияния. Во время второй фазы слияния финальное количество ядер в специфической мышце предопределяется за счет бокового слияния клеток fcms с растущей мышечной трубкой. Параллельно концы растущей мышечной трубки образуют филоподии, которые идентифицируют и контактируют со специфическими эпидермальными местами прикрепления (Figs. 1C, 2, arrows). Эти контакты затем стабилизируются благодаря закреплению мышечных и сухожильных клеток во внеклеточном матриксе (ECM) (Fig. 1C-3). Наконец, инициируется сборка саркомера и происходит созревание мышечной трубки (Fig. 1C-4).

Figure 2. Ultrastructural features during myoblast fusion in wild-type and mutant embryos. A: Schematic drawing depicting the ultrastructural features during the first and the second fusion phase. After the recognition and adhesion of fcs and fcms, a precursor cell forms. For the first phase of myoblast fusion, no ultrastructural features have been reported so far. One mutant that stops fusion during the first fusion phase is mbc, the only one analysed at the ultrastructural level. During the second fusion phase, electron-dense vesicles and plaques can be observed. Membrane vesiculation is a further characteristic feature of fusion. Embryos expressing activated RacV12 and wasp and vrp1 mutants stop fusion at this point. After all fusion events have been completed, a mature myotube is formed. B: The first fusion phase in a wild-type embryo. Electron-dense vesicles (arrowheads) (C) and electron-dense plaques (arrow) (D) are shown on ultrathin sections of wild-type embryos. E: A wasp3D3-035 mutant embryo with vesiculating membranes (arrowheads) and electron-dense vesicles (arrow). The membrane remnants become removed and a fusion pore forms. Subsequently, the fcm is integrated into the growing myotube. Magnifications: (B) 3,600?; (C) 12,000?; (D) 21,000?; (F) 21,000?. N, nuclei; G, Golgi apparatus, encircled by a dashed line.

Кстати, идентифицирован ряд генов, которые кодируют белки, связанные со слиянием, которые включают молекулы клеточной адгезии, членов сигнальных каскадов, и регуляторы актинового цитоскелета (Table 1). fc-специфические хемоаттрактивные сигналы, как известно, направляют fcms в направлении fcs (Ruiz-Gomez et al.,2000; Strunkelnberg et al.,2001), а затем обеспечивают пусковые механизмы распознавания и адгезии многоступенчатого каскада сигнальной трансдукции (Fig. 4), который ведет к активации формирования F-actin цитоскелета и в конечном итоге к формированию fusion поры (Fig. 5). Кроме того, связанные со слиянием белки также участвуют в ряде др. онтогенетических процессов, таких как прикрепление мышц (Schroter et al.,2004; Schafer et al.,2007), сборка саркомера (e.g., Kreiskother et al.,2006) и внутреннем (visceral) слиянии (Klapper et al.,2001,2002; San Martin and Bate,2001), организации Мальпигиевых канальцев (Denholm et al.,2003; Putz et al.,2005), развитии гирлянд клеток (Weavers et al.,2009), а также в развитии глаз (e.g., Carthew,2007; Fischbach et al.,2009). Т.о., благодаря мультифункциональным ролям связанных со слиянием белков необходимо с осторожностью интерпретировать исследования биохимических взаимодействий белков и получаемые данные необходимо коррелировать с определенной биологической функцией.

Figure 4. The Arp2/3 complex is activated by different F-actin regulators during the first and second fusion phase. A: The adhesion molecules in fcs and fcms trigger a signalling cascade that leads to the activation of the SCAR/WAVE complex and Vrp 1 during the first fusion phase. Intracellular components that might be involved in this signalling cascade include the nucleotide exchange factors Mbc and Schizo/Loner, the Rac-GTPases Rac1 and Rac2, as well as the Arf6-GTPase (in redundancy with another Arf-GTPase). Mutations in these genes disrupt fusion before precursor cell formation. In blow mutants, the first phase of fusion is inefficient (Beckett and Baylies,2007). B: The signalling cascades during the second fusion phase additionally involved the multidomain protein Rols7 in precursor cells and the Blow protein in fcms. In addition to the SCAR/WAVE complex, the WASP/Vrp 1 complex in fcms is activated during the second fusion phase. Whether Mbc and Schizo/Loner play a role during the second fusion phase remains to be determined. All actin regulators are shown in red.

Figure 5. A model for FuRMAS expansion. Cell adhesion and FuRMAS formation. A: Lateral view: Duf/Kirre and SNS form a ring-like adhesion belt that is stabilized during the second fusion phase by Rols7. Please note that to date, Hibris and Rst have not been analysed in respect to the FuRMAS. In the centre of this belt, an F-actin plug (red) is found on each site of the contacting membrane and fusion-relevant proteins become localized to the contact area in fcms. B: Branched F-actin leads to the expansion of the FuRMAS: In a lateral view, opposing membranes and branched F-actin filaments are shown in detail. Cross-sectional view of the FuRMAS at the level of the opposing membranes with respect to F-actin; a view of a plug and electron-dense vesicles. The adhesion belt that defines the FuRMAS is highlighted as circles of the membrane spanning Duf/Kirre and SNS molecules. The F-actin plug expands during the fusion process and drives the expansion of the FuRMAS (schematically indicated by the arrows). As a consequence, the F-actin plug is dissolved. Electron-dense vesicles accumulate at the opposing membranes (compare to Fig. 3B for a three-dimensional model). C: Pulling of the fcm into the growing myotube. As a consequence of FuRMAS expansion, the fusing fcms become integrated into the growing myotube as indicated by the arrow. By this time, F-actin has disintegrated.

Figure 3. Spatial distribution of paired vesicles at the opposing membranes between a growing myotub and a fcm. A: Serial section (A*- F*) reproduced from Doberstein et al. (1997, fig. 3) with permission of the publisher and tilted here to better visualize the spatial arrangement. The green lines represent landmarks showing corresponding positions in the sections. Prefusion complexes are visible at the contact zone between four cells (membranes are visualized in blue). Vesicles of the central prefusion complex existing between a growing myotube and a fcm are labelled in red. B: Schematic diagram of the arrangement of the red vesicles in A (vesicles: red in fcm, orange in growing myotube). A* to F* in B correspond to the cross-sections A* to F* in A. N, nucleus.

TWO-TEMPORAL-PHASES OF FUSION AND THE TWO-PHASE MYOBLAST FUSION MODEL

Перед обсуждением двух временных фаз в противоположность модели двух фаз необходимо подчеркнуть важность морфологических различий между временными фазами слияния. Первая и вторая фазы слияния отличаются с морфологической точки зрения. Самое первое слияние ведет к двухядреному или трехядерному предшественнику. Во время этой инициальной ступни слияния каждая клетка приблизительно 4 µm в ширину (Bate,1990 [light microscope]; Schroter et al.,2006 [TEM]) и они образуют контакт примерно в 1.7-1.9 µm (Fig. 2B). Внутри этой области контакта мембраны растворяются и образуется синцитиальная клетка с двумя ядрами и общей цитоплазмой. Во время второй фазы слияния, fcms остаются маленькими как в первой фазе слияния (Fig. 2A), тогда как клетка предшественник и растущая мышечная трубка увеличивается с каждым успешным слиянием. Следовательно, в абсолютных терминах место контакта остается сходным по размеру, но область контакта оказывается относительно небольшой по сравнению с крупным предшественником и растущей мышечной трубкой (Fig. 2A). Как показал Bate (1990) , используя инъекции краски, клетки предшественники и растущие мышечные трубки мигрируют в направлении их мест прикрепления, объясняя почему слияния происходят сбоку во время второй фазы слияния (Fig. 2A).

Генетический (Rau et al.,2001; Massarwa et al.,2007; Berger et al.,2008) и ультраструктурный анализ (Doberstein et al.,1997; Schroter et al.,2006) привел к предположению, что несколько разных генетических игроков участвуют во время двух временных фаз слияния. Это привело к модели двух фаз слияния миобластов, обладающих общими и отличающимися белками, имеющими отношение к слиянию, и сигнальными факторами, которые существенны во время двух фаз. Напротив, Beckett and Baylies (2007), рассморев модель двух временных фаз слияния миобластов, предположили, что не существует генетических отличий. Необходимо отметить, что данные, ведущие к предложению моделей двух временных фаз (Beckett and Baylies,2007) и двухфазности (Rau et al.,2001; Schroter et al.,2004; Menon et al.,2005) не противоречивы, различия возникают лишь на уровне интерпретации. Напр., Beckett and Baylies (2007) тщательно подсчитали количества ядер, обнаруживаемых в разных мышечных предшественниках у многих известных мутантов с нарушением слияния. Среди них только у myoblast city (mbc) мутантов (Rushton et al.,1995; Erickson et al.,1997; Galletta et al.,1999) слияния не возникали вообще, как сообщалось и ранее (Doberstein et al.,1997; Schroter et al.,2004,2006; Menon et al.,2005). Интересно, что в соответствии с ранее опубликованными данными, Beckett and Baylies (2007) обнаруживали разные количества ядер у мутантов blow, kette, schizo/loner, mbc и rols а также состояний слияния между сегментами индивидуальных мутантов и пришли к выводу, что отсутствуют генетические различия между двумя фазами слияния миобластов, а скорее имеет место лишь задержка самого процесса слияния. Трансплантационные исследования, связанные с исследованием слияния были использованы для тестирования способности к слиянию у rolling pebbles (rols) мутантных миобластов (Rau et al.,2001). Эксперименты показали. что rols мутантные fcs ведут к образованию небольших синцитиев как и на фоне дикого типа и что эти синцитии остаются маленькими даже у личинок третьего возраста. Эти наблюдения трудно объяснить, если принимать во внимание только время. Однако, истощение пула fcms за счет "faster acting" fcs дикого типа перед третьим личиночным возрастом нельзя исключить. Возможно, что некоторые имеющие отношение к слиянию белки, подобные Rols, необходимы для более высокой эффективности слияния во второй фазе слияния (see An Overview of Myoblast Fusion section). Кроме того, некоторые имеющие отношение к слиянию белки, вносятся матерями и в отношении эффективности слияния все зиготические мутанты с потерей функции и со строгим материнским вкладом соотв. мРНК трудны для интерпретации. Напр., kette мутанты часто образуют маленькие синцитии (Schroter et al.,2004; Beckett and Baylies,2007), указывая тем самым, что предоставляемый матерями белок Kette может быть центральным для событий инициального успешного слияния. Наконец, недавние исследования по дифференциальной регуляции реорганизации F-актина во время первой и второй фаз слияния (Massarwa et al.,2007; Berger et al.,2008) усложнили модель генетических отличий в добавление к временным отличиям (see Key Molecular Players as Components of the Fusion-Restricted Myogenic-Adhesive Structure [FuRMAS] section).

На основании описанных данных мы предположили, что существует ряд имеющих отношение к слиянию белков, таких как Rols, которые играют более важную роль во второй, по сравнению с первой фазой или ступенью слияния в терминах ограничения области слияния с клетками предшественниками, которые имеют более крупную поверхность по сравнению с маленькими fcms. Др., такие как Vrp1/Wip экспрессируются только в fcms во время первой фазы слияния, а позднее присутствуют как в fcm, так и растущих мышечных трубках. Мы объединили two-temporal-phase и two-phase модели, а также внесли последние данные по исследованию ультраструктурных свойств слияния миобластов (Fig. 2).

ULTRASTRUCTURAL FEATURES OF MYOBLAST FUSION

Интересно, что во время второй временной фазы, наблюдаются отличающиеся ассоциированные с мембранами электрон-плотные структуры, а именно, prefusion комплексы и электрон-плотные бляшки, а также vesiculation мембран, с помощью TEM (Doberstein et al.1997). Однако во время первой временной фазы prefusion комплекс и электрон-плотные бляшки не обнаруживаются (Fig. 2B), но везикуляция мембран происхдит (Schroter et al.,2006). Неспособность обнаружить префузионный комплекс и электрон-плотные бляшки в первой фазе слияни д. означать. что эти структуры ограничиваются второй фазой слияния. Но нельзя исключить, что они более ломкие и поэтому трудны для идентификации в первой фазе.

The Prefusion Complex

На ультраструктурном уровне электрон-плотные пузырьки могут наблюдаться во время второй фазы (Fig. 2C). Doberstein et al. (1997) подтверждают, что эти пузырька формируют префузионный комплекс, которые может состоять из более чем 15 пузырьков (40 nm в диаметре) на контактный сайт. От Golgi к мембране они могут транспортироваться с помощью F-actin, который распадается на части после образования префузионного комплекса (Kim et al.,2007). Систематический анализ этих пузырьков у эмбрионов дикого типа указывает на то, что этот комплекс состоит в среднем из 1.4 пузырьков на комплекс с отдельном разрезе (Estrada et al.,2007). Kim et al. (2007) также описывают варьирующие количества пузырьков, которые также не все спарены, находка, которая подтверждается Doberstein et al. (1997). Эти наблюдения ставят два ключевых вопроса: (1) Почему отличаются количества пузырьков? (2) Почему пузырьки не всегда спарены (paired)? Мы полагаем, что это зависит до некоторой степени от срезов (Fig. 3) непосредственно, т.к. срезы показывают частично пузырьки на пути от Golgi к мембране, пежде чем они станут видимы, как парные пузырьки на оппозитных мембранах. Дальнейший вопрос касается количества и пространственного распределения парных пузырьков на оппозитных мембранах. Серийные срезы Doberstein et al. (1997) высоко информативны, поскольку все 45 пар пузырьков обнаружены в 6 серийных срезах (каждый в 100 nm), и эти пузырьки распределены среди 4-х клеток, одна это fc/растущая мышечная трубка и три др., по-видимому, fcms (Fig. 3A). Приблизительно 15 пар пузырьков идентифицированы в каждом индивидуальном месте контакта и распределены на большой области (1 µm²) на оппозитных мембранах (парные пузырьки одного контактного сайта маркированы красным,а мембраны голубым; Fig. 3A). Рис. 3B изображает этот процесс для контактного сайта между растущей мышцей и одиночной fcm клеткой. Для модели FuRMAS, будет рассмотрена ниже (see The FuRMAS Model for Myoblast Fusion: Key Molecular Players, Their Localization and Ultrastructural Features section), важно держать в голове, что пузырьки распространяются поверх этой области.

Electron-Dense Plaques

Doberstein et al. (1997) полагают, что пузырьки префузионного комплекса растворяются и образуют электрон-плотные бляшки, которые более 500 nm в длину с 10-nm-толщиной материалом вдоль оппозитных мембран (see Fig. 2D). Интересно, что разрыв мембраны виден на одной стороне вблизи такой бляшки (Doberstein et al.,1997). Эти бляшки напоминают десмосомы между эпителиальными клетками (о десмосомах см. Getsios et al.,2004; Gumbiner,2005). Однако эти бляшки редко видны в норме, тогда как они часто наблюдаются у определенных мутантов (see Membrane Vesiculation section), указывая тем самым, что они являются временными структурами. Если это так, то электрон-плотные бляшки и пузырьки никогда не д. наблюдаться вместе. Эта находка говорит, что они могут не появляться одно и то же время. Или они могут , но не присутствуют в одном и том же срезе из-за разного пространственного расположения.

Membrane Vesiculation

Наконец, мембраны начинают пропитываться пузырьками (vesiculate) вдоль зоны контакта, образуя мешочки из мембран (Fig. 2E), которые в конце концов удаляются во время разрыва мембраны (Doberstein et al.,1997). Однако поскольку срезы во время везикуляции мембран не были исследованы столь тщательно, то сегодня мы неспособны сравнивать области спаренных пузырьков с областью разрыва мембраны.

Ультраструктурный анализ известных мутантов с нарушением слияния предоставил новую информацию о роли ключевых имеющих отношение к слиянию белков для ходя слияния по отношению к описанным ультраструктурным признакам (Fig. 2A). Напр., blown fuse (blow) (Doberstein et al.,1997) и singles bar (sing) (Estrada et al.,2007) мутанты не переходят границы стадии префузионных комплексов, указывая тем самым на роль blow и sing в обеспечиении слияния электрон-плотных пузырьков с плазматической мембраной, как это уже было предположено для blow Doberstein et al. (1997). Для первой фазы слияния, только мутанты myblast city (mbc) были проанализированы на ультраструктурном уровне и не было обнаружено ни пузырьков, но электрон-плотных бляшек (Doberstein et al.,1997; Schroter et al.,2006). Как sns15 (previously named rost15; Paululat et al.,1995), так kette мутанты с потерей функции накапливали аберрантные электрон-плотные бляшки, которые были значительно длиннее и тоньше, чем в норме и эти два мутанта не доходили до финальной стадии везикуляции мембран (Doberstein et al.,1997; Schroter et al.,2004). Пока неизвестно, являются ли sns15 нулевыми мутантами или нет. Наконец, мутации регуляторов актина (see Fig. 2E for wasp3D3-035 and Key Molecular Players as Components of the Fusion-Restricted Myogenic-Adhesive Structure [FuRMAS] section) и экспрессия конституитивно активного DRacG12V (Doberstein et al.,1997) ведут к везикуляции противоположных мембран, но не открывают фузионной поры.

KEY MOLECULAR PLAYERS AS COMPONENTS OF THE FUSION-RESTRICTED MYOGENIC-ADHESIVE STRUCTURE (FURMAS)

Establishment and Known Components of the FuRMAS

Ряд белков, связанных со слиянием, идентифицирован (Table 1), обсудим их роль в слиянии и их локализацию в FuRMAS. FuRMAS был определен как кольце-подобное расположение клеточных адгезивных молекул (и взаимодействующих молекул) с локальными скоплениями F-актина в бляшках в месте слияния миобластов (Kesper et al.,2007; see Fig. 1B1-B3 for the ring-like expression of Duf in fcs). F-actin и D-Titin, как известно накапливаются в fc и растущих мышечных трубках и в fcms клетках, тогда как Blow концентрируется в fcms (Kesper et al.,2007; Richardson et al.,2007). F-actin бляшки в месте слияния были также названы актиновыми фокусами (Kim et al.,2007; Richardson et al.,2007). Однако прежде чем будут установлены клеточные адгезивные кольца (Kesper et al.,2007) и актиновые бляшки/фокусы (Richardson et al.,2007) д. произойти успешное слияние клеток. Здесь мы опишем становление FuRMAS с помощью гетерофильной клеточной адгезии (Figs. 4, 5).

Направленная миграция и распознавание могут нуждаться в хемоаттрактивных сигналах, высвобождаемых клетками fc, чтобы привлечь fcms, которые могут также играть роль в слипании fc-fcm. В самом деле, трансмембранный белок Dumbfounded/Kin of Irre (Duf/Kirre) экспрессируется только в fcs и, как было установлено, привлекает fcms к эпидермису, если экспрессируется эктопически с wingless-GAL4 (Ruiz-Gomez et al.,2000). Однако еще предстоит установить, действительно ли Duf/Kirre действует как пронизывающая мембрану молекула или она секретируется, являясь частью внеклеточного домена. В клетках fcs из эмбрионов, Duf/Kirre и др. трансмембранный белок, а именно, Roughest/Irregular C (Rst/IrreC), перекрываются и поэтому выполняют перекрывающиеся роли. Подобно Duf/Kirre, Rst/IrreC является членом Immunoglobulin Superfamily (IgSF) и также может привлекать миобласты (Strunkelnberg et al.,2001); однако, в противоположность Duf/Kirre, Rst/IrreC экспрессируется в обоих типах миобластов. В экспериментах по агрегации с S2 клетками, установлено, что fcm-специфический IgSF белок Sticks and Stones (SNS) обеспечивает гетеротипическую адгезию с Duf/Kirre- и Rst/Irre C-экспрессирующими клетками (Bour et al.,2000; Galletta et al.,2004). Hibris (Hbs), паралог SNS, также экспрессируется в fcms (Artero et al.,2001; Dworak et al.,2001), но что интересно, Hbs, по-видимому, не абсолютно необходим для слияния миобластов, поскольку потеря функции не нарушала слияния миобластов (Artero et al.,2001; Dworak et al.,2001). Artero et al. (2001) подтвердили, базируясь на генетических взаимодействиях, что SNS и Hbs действуют антагонистично, Dworak et al. (2001) предполагают, что оба гена функционально перекрываются. Эта находка была подтверждена экспериментами с двойными мутантами Menon et al. (2005) и Shelton et al. (2009).

Для Duf/Kirre и SNS известно, что они распределяются кольцеобразным способом внутри FuRMASs в месте контакта fc/растущих мышечных трубок и fcms (Fig. 5). После распознавания и слипания между fcs и fcms, белки, связанные со слиянием, как полагают, переносят сигналы с мембраны, чтобы инициировать процесс слияния миобластов. Цитоплазматические хвосты адгезивных молекул, скорее всего, участвуют в этом процессе переноса сигналов (Sink,2006). Напр., внутриклеточный домен Duf/Kirre необходим, чтобы рекрутировать мультидоменовый белок Rolling Pebbles 7 (Rols7), также известный как Antisocial (Ants) (Chen and Olson,2001; Menon and Chia,2001). Это ведет к совместной локализации Rols и Duf/Kirre в виде кольца с FuRMAS в fc и растущей мышечной трубке (Kesper et al.,2007).

Исследования по иммунопреципитации (CoIPs) с Duf и Rols/Ants или Rols и Mbc после трансфекции в S2 клетки выявили взаимодействие Rols/Ants с Duf, а также с Mbc (Chen and Olson,2001). Т.о., Rols7/Ants могут служить в качестве связующего звена между мембраной и актиновым цитоскелетом посредством Mbc и Rac (Fig. 4). Это мнение подтверждается доказательством локализации Mbc в актиновых бляшках/фокусах и распределением Rac в виде самостоятельных точек по всей цитоплазме, при этом некоторые точки перекрываются с актиновыми бляшками/фокусами (Richardson et al.,2007). Недавно, Geisbrecht et al. (2008) исследовали генетическое взаимодействие и показали, что Mbc и ELMO/CED-12 кооперируют, чтобы активировать малые GTPases Rac1 и Rac2 в развитии глаз во время метаморфоза. Более того, ankyrin повторы в Rols/Ants оказались существенными для рекрутирования Rols7 на мембрану (Menon et al.,2005), тогда как TPR повторы взаимодействуют с внутриклеточным доменом Duf/Kirre (Kreiskother et al.,2006). Zhang et al. (2000) впервые показали, что компонент цитоскелета D-Titin накапливается в месте слияния. Kesper et al. (2007) подтвердили это и сообщили, что D-Titin локализуется в виде того же самого паттерна, что и F-actin в бляшках и фокусах FuRMASs. Эта локализация зависит от Rols7, который рекрутирует D-Titin в место слияния (Menon and Chia,2001).

Мутации в schizo/loner ведут к строгому фенотипическому отклонению слияния миобластов. Schizo/Loner, это GEF для Adenosin ribosylation factor (Arf) семейства GTPases, как полагают, является др. сигнальной молекулой в fcs и растущих мышечных трубках, и как было установлено, соединяется с Arf6 в исследованиях in vitro (Chen et al.,2003). Мутанты с потерей функции arf6 обладают паттерном мышц дикого типа и мутантные мухи жизнеспособны, но самцы стерильны (Dyer et al.,2007). Эта находка указывает на то, что Arf6 не является или является не только Arf GTPase, которая может активировать Schizo/Loner. Richardson et al. (2007) обнаружили Schizo/Loner как в fcs/растущих мышечных трубках, так и в fcms. Более того, они также установили, что Schizo/Loner находятся вне актиновых бляшек/фокусов и не по соседству с мембранами между fcms и fcs. Т.о., Schizo/Loner, по-видимому, не является важным компонентом FuRMASs. Однако, Schizo безусловно важен для слияния, но его точная роль нуждается в дальнейшем выяснении.

Хотя сигнальные молекулы, которые обеспечивают передачу сигналов в fcms в любой из двух фаз слияния, еще не идентифицированы, детальный анализ способности к восстановлению после SNS делеционной конструкции, показал, что цитоплазматический домен SNS обладает множественными перекрывающимися доменами (Kocherlakota et al.,2008). Это ещё больше подчеркивает мнение, что в игре разные сигнальные каскады.

Dynamics of FuRMAS

В норме обнаруживаются кольца разных размеров в пределах от 1 до 5 µm. Размер колец клеточной адгезии у мутантов (blow, kette, mbc и rols) меньше 2 µm, возможно, что наблюдаемые различия в размерах у дикого типа клеток отражают изменения в размере индивидуальных колец. Это предположение позволяет нам утверждать, что FuRMAS расширяется во время индивидуального процесса слияния с 1 до 5 µm в диаметре (Fig. 5). Кольцо (первоначально в 1 µm в диаметре) из SNS/Duf и Rols в FuRMAS (Kesper et al.,2007) окружает область актина в 0.78 µm². Возникает вопрос, изменяют ли свой размер также актиновые бляшки/фокусы. В самом деле, эксперименты по получению прижизненных картин у эмбрионов дикого типа показали, что размеры этих актиновых бляшек/фокусов очень динамичны и варьируют в границах от 0.7 до 4.5 µm² (Richardson et al.,2007) если измеряются сбоку (see Fig. 5). В отсутствие внутриклеточных компонентов, которые регулируют образование ветвящегося F-actin, таких как Kette, FuRMAS образуется, но не расширяется до конца (Kesper et al.,2007), хотя размер актиновой бляшки увеличивается (Richardson et al.,2007). Эти актиновые бляшки/фокусы высоко динамичные структуры и устанавливаются в течение 2 мин. и растворяются полностью менее чем за 1 мин., но могут присутствовать в индивидуальных местах слияния свыше 12 мин в среднем (Richardson et al.,2007).

REGULATION OF ACTIN POLYMERIZATION DURING MYOBLAST FUSION

Динамика F-actin бляшек/фокусов внутри FuRMAS нуждается в регулируемой полимеризации и деполимеризации F-actin. В самом деле, накапливаются доказательства, что точная регуляция полимеризации актина является критической для успешного слияния миобластов (Schroter et al.,2004; Kesper et al.,2007; Kim et al.,2007; Massarwa et al.,2007; Richardson et al.,2007; Berger et al.,2008). Родственные актину белки, подобные Arp2/3 комплексу, иницируют образование новых F-actin филамент в уже предсуществующей сети актина (rev.Pollard,2007). Во время слияния миобластов, лежащая в основе активация Arp2/3 комплекса по-разному регулируется в fcs и fcms и в первой и второй фазе слияния (Fig. 4; Table 1). Rho, Rac, и Cdc42 являются малыми GTPases, которые участвуют во многих зависимых от актина процессах (rev. Etienne-Manneville and Hall,2002). Cdc42, по-видимому, не играет главной роли в слиянии миобластов (Schafer et al.,2007) в противоположность Rac (see below). Первые регуляторы актина, которые были идентифицированы как важные для слияния миобластов, это были малые rac-GTPases rac1, rac2 (Luo et al.,1994; Doberstein et al.,1997; Hakeda-Suzuki et al.,2002) и kette, дрозофилийный гомолог Nap1/Hem-2 (Schroter et al.,2004). Интересно, что kette взаимодействует генетически с экспрессирующимся специфически в fcm клетках геном blow (Schroter et al.,2004). Мутанты по слиянию, такие как kette обнаруживают разные нарушения слияния на ультраструктурном уровне (см Ultrastructural Features of Myoblast Fusion section).

Малые Rac-GTPase и гомолог Kette у позвоночных Nap-1/Nap-125 , как известно, участвуют в активации Arp2/3 регулятора SCAR/WAVE. Белковый комплекс, включающий Nap-125 удерживает SCAR/WAVE в неактивном состоянии, тогда как связывание Rac активирует SCAR/WAVE, который в свою очередь стимулирует Arp2/3 комплекс (Takenawa and Suetsugu,2007). Mbc необходим для слияния миобластов (Rushton et al.,1995; Erickson et al.,1997) и как полагают, является GEF, который активирует Rac (Cote and Vuori,2002; see Fig. 4). В самом деле, Mbc и Rac GTPases локализуются совместно в F-actin бляшках (Richardson et al.,2007). Стимуляция Arp2/3 комплекса с помощью факторов, способствующих nucleation, таких как SCAR/WAVE и WASP достигается посредством трех коротких эволюционно законсервированных мотивов, которые также известны как VCA модуль: V мотив взаимодействует с actin мономерами, а CA мотив может связывать Arp2/3 комплекс и актин. У Drosophila, иммуногистохимические исследования показали, что Kette также необходим для корректной локализации SCAR/WAVE (Richardson et al.,2007). Эмбрионы, лишенные зиготической активности scar/wave, обнаруживают слабые дефекты слияния (Richardson et al.,2007; Berger et al.,2008), фенотип, который может быть усилен за счет дополнительной редукции материнского scar/wave (Richardson et al.,2007). Помимо SCAR/WAVE, Wiskott-Aldrich Syndrome белок WASP необходим для слияния миобластов. Анализ нового аллеля wasp wasp3D3-035, который лишен CA домена VCA модуля и действует как доминантно-негативная мутация, выявил, что этот домен важен для корректного слияния миобластов (Schafer et al.,2007). Эксперименты с двойными мутациями, с Arp3 и wasp мутантными эмбрионами, а также с потерей материнской и зиготической активности WASP, показали, что WASP необходим только во время второй фазы слияния (Massarwa et al.,2007; Berger et al.,2008). Более того, эксперименты по восстановлению специфических клеточных типов показали, что WASP необходим только в fcms (Schafer et al.,2007); однако этот вопрос нуждается в дальнейшем изучении, поскольку Massarwa et al. (2007) получили противоречивые результаты. Кроме того, WASP, как известно, образует комплекс со своим fcm-специфически экспрессирующимся партнером по взаимодействию Verprolin 1 (Vrp1) (также известным как D-Wip или Solitary) (Massarwa et al.,2007; Kim et al.,2007), а гомозиготные vrp1 нулевые мутанты обнаруживают остановку слияния после образования предшественников. На ультраструктурном уровне, Kim et al (2007) наблюдали неправильную локализацию префузионного комплекса и накопление пузырьков и поэтому было предположено, что регуляция F-actin необходима для доставки пузырьков на мембрану; однако, мембраны, по-видимому, остаются интактными. Напротив, Massarwa et al. (2007) и Berger et al. (2008) наблюдали везикуляцию мембран у vrp1 мутантов и не обнаружили доказательств накопления пузырьков. Причину подобных отличающихся находок предстоит выяснить, напр., различия в методах фиксации (high-pressure freezing; chemical fixation) могут давать разные результаты. У мутантов wasp префузионный комплекс также образуется корректно и не наблюдается накопления пузырьков (Berger et al.,2008; Massarwa et al.,2007). Интересно, что мутанты wasp обладают очень сходным фенотипом с мутантами vrp1 (Berger et al.,2008; Massarwa et al.,2007), находка, прекрасно согласующаяся с тем фактом, что WASP и Vrp1 являются взаимодействующими белками. Чтобы выяснить роль SCAR/WAVE, WASP и Vrp1 во время слияния миобластов, анализировали двойных мутантов scar/wave vrp1 и не обнаружили доказательств, что слияние у них имеет место. Всё это строго указывает на то, что SCAR/WAVE и Vrp1 контролируют первую фазу слияния, тогда как все SCAR/WAVE, WASP и Vrp1 необходимы для второй фазы слияния (Berger et al.,2008). Это в свою очередь указывает на то, что Arp2/3 активируется независимо от WASP в первой фазе слияния. В самом деле, было предположено, что Wip позвоночных может взаимодействовать с Cortactin, чтобы индуцировать полимеризацию актина посредством Arp2/3 комплекса (Kinley et al.,2003). Однако может ли это также вызывать слияние миобластов, предстоит изучить.

Комплекс Arp2/3 состоит из 7 белков: 2 родственных актину белка, а именно, Arp2 и Arp3, а также 5 дальнейших субъединиц (ArpC1-5). Мутации в Arp3 и ArpC1 генах, как известно, нарушают слияние (Massarwa et al.,2007; Richardson et al.,2007; Berger et al.,2008). Молекулярные игроки, которые регулируют ветвление F-actin во время первой и второй фазы слияния зависимым от типа клеток способом суммированы на Figure 4. Интересно, что на ультраструктурном уровне слияние миобластов у мутантов wasp и vrp1 нарушается на разных ступенях, по сравнению с Arp3^schwachling мутантами. Точнее wasp и vrp1 мутанты останавливают слияние во время везикуляции мембран (Massarwa et al.,2007; Berger et al.,2008), тогда как Arp3^schwachling мутанты останавливают слияние после того как остатки мембран удалены и сформировалась fusion пора, но fcm клетка не интегрируется в растущую мышечную трубку (Berger et al.,2008). Согласно этим данным предложена модель, которая указывает на то, что увеличение поры слияния зависит от Arp2/3-обеспечиваемого ветвления F-actin. Везикуляция и разрыв мембран, однако, по-видимому, контролируется др. факторами, напр., всё ещё неизвестным fusogene (белком, который сливает мембраны). Мы строго подтвердили присутствие скоординированных путей, ведущих к формированию и расширению fusion поры , а также благодаря сложности внутриклеточного домена SNS, присутствие множественных путей, по крайней мере, в fcms (Kocherlakota et al.,2008). Наконец, в подтверждение этого мнения биохимические эксперименты предоставили доказательства, что SNS взаимодействует с Crk, SH2-SH3 типа адапторным белком, и что Vrp1 обеспечивает образование комплекса Crk-Vrp1-WASP в fcms (Kim et al.,2007).

THE FURMAS MODEL FOR MYOBLAST FUSION: KEY MOLECULAR PLAYERS, THEIR LOCALIZATION AND ULTRASTRUCTURAL FEATURES

Исходя из предыдущих исследований (Kesper et al.,2007), мы предположили, что во время слияния миобластов адгезивная структура, наз., FuRMAS удерживает мембраны в тесном контакте. Kesper et al. (2007) предложили модель, которая интегрирует данные по FuRMAS, полученные на клеточном и субклеточном уровнях. Теперь мы включили недавние новые данные нескольких лаб. в эту модель и расширили её, чтобы включить роль регуляции F-actin во время слияния миобластов (Fig. 5). Многочисленные актиновые регуляторы, как известно, ко-локализуются с актиновыми бляшками/фокусами (Fig. 5A and B; см Key Molecular Players as Components of the Fusion-Restricted Myogenic-Adhesive Structure (FuRMAS) section). Мы полагаем, что F-actin выполняет множественные функции во время слияния миобластов, которые осуществляются частично параллельно. Во-первых, F-actin , скорее всего, транспортирует электрон-плотные пузырьки к месту слияния, чтобы сформировать префузионные комплексы на противоположных мембранах (Kim et al.,2007), и вполне возможно, что эти пузырьки накапливаются поверх области в 1 µm² (Doberstein et al.,1997; see Fig. 3). Во-вторых, далее мы предположили, что F-actin может быть необходим для экспансии адгезивной полоски с 1 to 5 µm в диаметре (Kesper et al.,2007; Fig. 5B), это находится в согласии с наблюдаемой редукцией размера фузионной поры у Arp3^schwachling мутантов (Berger et al.,2008). В-третьих, Massarwa et al. (2007) предположили, что увеличение поры слияния зависит от Vrp1-обусловленной активации WASP, поскоьку wasp и vrp1 мутанты обнаруживают множественные небольшие поры слияния (Massarwa et al.,2007; Berger et al.,2008). Т.о., активация Arp2/3, по-видимому, необходима для удаления везикулированных остатков мембраны и тем самым создания открытой фузионной поры. В-четвертых, активация Arp2/3, по-видимому, существенна для интеграции fcm в растущую мышечную трубочку, поскольку Arp3^schwachling мутантные эмбрионы не интегрируют fcms в растущие мышечные трубочки (Berger et al.,2008; see Fig. 5C).

Однако какой может быть роль префузионного комплекса? Doberstein et al. (1997) полагают, что пузырьки префузионного комплекса растворяются, чтобы сформировать электрон-плотные бляшки. Напротив, эти пузырьки могут играть роль в транспортировке молекул, необходимых для слияния, и такие молекулы может быть аналогичны fusogenes Eff1 и Aff1, идентифицированными при слиянии эпителия у C. elegans (Mohler et al.,2002; Podbilewicz et al.,2006; Sapir et al.,2007). Хотя такие fusogenes пока не идентифицированы у дрозофилы, можно предположить, что такие белки могут запускать везикуляцию и последующий разрыв мембран во время слияния миобластов.

COMPARISION OF TRANSIENT ADHESIVE STRUCTURES: THE FURMAS, IMMUNOLOGICAL SYNAPSES, PODOSOMES AND INVADADOPODIA

Кольцо из молекул клеточной адгезии и локальное ветвление F-actin в адгезивных структурах характерно для некоторых клеточных структур, таких как иммунологические синапсы, подосомы и invadopodia (Table 2). Иммунологические синапсы это временные адгезивные структуры, которые соединяют антиген-презентирующие клетки (antigen-presenting cell (APC)) с T клетками (Monks et al.,1997; Shaw and Dustin,1997; Grakoui et al.,1999). В теминах мимолетной клеточной адгезии и локального ветвления F-actin эта структура сходна с FuRMAS, которая образуется между fcs/растущими мышечными трубками и fcms во время слияния миобластов. Более того обе эти структуры временные и регулируют пространственное и временное общение между клетками. Podosomes (rev. Linder and Kopp,2005; Linder,2007) и invadopodia (Vignjevic and Montagnac,2008) известные формы адгезивных структур между филоподиями и внеклеточным матриксом (ECM) которые участвуют в деградации матрикса, что в конечном итоге ведет к инвазии. Обе эти структуры были недавно сравнены с иммунологическими синапсами (rev. Wernimont et al.,2008). Интересно, что эти структуры также характеризуются накоплением локального F-actin с общими F-actin регуляторами (Table 2). Наконец. иммунологические синапсы, подосомы и ивадоподии также служат для создания ограниченной области, где происходят литические процессы, напр., деградация матрикса (Table 2). Однако ещё предстоит определить, являются ли такие литические процессы также существенными для слияния миобластов.

Table 2. Key Characteristics of the FuRMAS, Immunological Synapse, Podosome, and Invadopodia FuRMAS Immunological synapse Podosomesa Invadopodiaa Cell type FC/growing myotube T-cell Monocytic cells Carcinoma cells FCM APC Adhesion molecules Duf and Rst Integrins (LFA-1) Integrins Vinculin Talin Integrins Talin Sns ICAMs F-actin regulators Nap-1 HEM-1e WAVE WAVE WASP WASP WASP WASP WIP WIP WIP WIP Arp2/3 Arp2/3 Arp2/3 Arp2/3 Rho-family GTPases Rho-family GTPases Rho-family GTPases Rho-family GTPases Gelsolin Gelsolin Cofilin Cofilin VASP VASP HS1e Cartactin Appearance of actin Plug Plug Dot-like Dot-like Size 0.8 µmb ? 0.4 µm2 40 µm2 0.7-4.5 µmc Persistence Up to 12 min Over hours 2-12 min Up to 1 hr ECM degradationd ? ? + +++ a Taken from Linder (2007). b Size of the area that is surrounded by Duf and Sns (Kesper et al.,2007). c Size of the actin plug in a lateral view (Richardson et al.,2007). d The ability of each structure to degrade the matrix is indicated by the number of + signs. e HEM-1 is the hematopoietic form of Nap-1 and HS1 is a hematopoietic-cell-specific form of the actin regulatory protein Cortactin.

FUNCTIONAL CONSERVATION BETWEEN ODROSOPHILA AND VERTEBRATE MYOBLAST FUSION

Поскольку образование скелетных мышц у млекопитающих экспериментально менее доступно для исследования, чем у Drosophila, то большинство исследований по слиянию миобластов осуществляется с использование клеточных линий миобластов позвоночных. Однако у млекопитающих клеточные процессы, лежащие в основе слияния миобластов, активно исследовали на цитологическом уровне (Knudsen and Horwitz,1977,1978; Wakelam,1985). Интересно, что сравнение этих данных с таковыми по дрозофиле обнаруживает безусловное сходство процессов слияния миобластов. Напр., и млекопитающие и дрозофила обладают двухфазным процессом слияния (Pavlath and Horsley,2003), как и у дрозофилы слияние миобластов млекопитающих сопровождается теми же самыми клеточными процессами распознавания, адгезии, выравнивания и объединение мембран. Кроме того, электрон-плотные пузырьки и бляшки обнаруживаются у позвоночных, как и у дрозофилы (Rash and Fambrough,1973; Doberstein et al.,1997). Однако молекулы, имеющие отношение к слиянию, которые были идентифицированы с помощью исследований in vitro, по-видимому, различны у дрозофилы и млекопитающих (rev. Richardson et al.,2008). Здесь мы сфокусируемся на функционально консервативных молекулах, связанных со слиянием, которые обнаруживают у разных видов (о молекулах известных только для позвоночных см. Maqbool and Jagla, 2008; Richardson et al.,2008).

Первым функциональным доказательством, что события слияния миобластов эволюционно консервативны получены в исследованиях на эмбрионах рыбок данио. Во время эмбриогенеза рыбок данио формируются два типа волокон скелетных мышц: моноядерные медленно сокращающиеся волокна и многоядерные быстро-сокращающиеся волокна. Недавно гомолог Duf/Kirre дрозофилы, наз. Kirrel, был идентифицирован у рыбок данио и было показано, что он локализуется в миобластах, компетентных к слиянию (Srinivas et al.,2007). Кроме того, были найдены гомологи некоторых внутриклеточных сигнальных молекул (see Table 1) Drosophila и у рыбок данио, напр., для Rac и Myoblast City гомологи Dock1 и Dock5 , а также Crk-родственные адапторные белки Crk и Crk-like. Нокдаун любого из Dock1, Dock5, Crk или Crk-like существенно снижает эффективность слияния миобластов у рыбок данио (Moore et al.,2007). Однако события слияния миобластов затрагиваются по-разному при избыточной экспрессии активированного Rac. Напр., у дрозофилы активированный Rac блокирует слияние миобластов (Luo et al.,1994; Doberstein et al.,1997), тогда как у рыбок данио это ведет к избыточному слиянию в быстро-сокращающихся мышцах (Srinivas et al.,2007).

Более того, Arf6 guanine nucleotide exchange фактор Schizo/Loner и Arf6-GTPase эволюционно законсервированы у позвоночных и дрозофилы (Chen et al.,2003; Onel et al.,2004). При миогенезе, Arf6, по-видимому, перекрывается и поэтому обладает перекрывающейся функцией с др. Arf GTPase (see Ultrastructural Features of Myoblast Fusion section). Доминантно-негативная версия Arf6 уменьшает эффективность слияния в трансфицированных C2C12 миобластов мыши в культуре клеток (Chen et al.,2003), это подразумевает, что Arf6 также может играть роль во время миогенеза позвоночных. В самом деле, используя C2C12 миобласты мышей в подходе RNAi, Pajcini et al., (2008) проанализировали роль GEF Brag2 (Schizo/Loner у Drosophila) и GEF Dock180 (Mbc у Drosophila) и обнаружили снижение индекса слияния. Кроме того, недавно идентифицированные компоненты, связанные со слиянием миобластов, в аппарате актинового цитоскелета, напр., WASP, Vrp1 и SCAR/WAVE, эволюционно законсервированы среди позвоночных и у Drosophila. siRNA нокдаун WASP и Vrp1, также как и Latrunculin-обусловленная дестабилизация F-actin ведут к снижению индекса слияния C2C12 клеток миобластов мыши в культуре (Kim et al.,2007). В культурах миобластных клеток мыши F-actin, по-видимому, играет роль в выравнивании клеток и образовании фузионных пор, предположительно, в свободных от актина регионах (Duan and Gallagher,2009), подобное предположение сделано Kim et al. (2007) и в отношении слияния миобластов у Drosophila. Chen et al. (2008) описали вирусный fusogene gp64 , который расширяет фузионную пору во время образования синцития в клеточной культуре также ограничивается актиновой сетью, опять же указывая на общий механизм. Кроме того, Crk, Dock180 (Dock1, Mbc homolog) и Kette/NAP1/Hem, как известно, экспрессируются в C2C12 миобластных клетках мышей (Kesper et al.,2007). Важно, что, Dock180 нулевые мыши обнаруживают тяжело сниженные уровни всех скелетно-мышечных тканей из-за сильного снижения событий слияния миобластов (Laurin et al.,2008). Итак, эти находки указывают на то. что слияние миобластов могут контролировать сходные механизмы у позвоночных и у Drosophila.

PERSPECTIVES

Our understanding of the myoblast fusion process in Drosophila and vertebrates has substantially increased over the last few years. Work on vertebrates has provided molecular evidence for conserved components in myoblast fusion over kingdoms and serves to demonstrate that the research on Drosophila myoblast fusion can prepare the ground for health-relevant translational research in higher organisms since fusion is relevant for growth and regeneration of muscles after injuries. During these processes, satellite cells, the stem cells of the myotubes, are activated, divide, and fuse to existing myotubes. To date, studies in Drosophila have provided new key insights into cell adhesion and regulation of F-actin branching and advanced understanding of the key players underpinning myoblast fusion events. However, the most central question that remains to be answered in Drosophila myoblast fusion is: how do the fusion pores form? The fusing membranes must be brought into close proximity to each other. In other systems, e.g., organelle or virus-cell fusion, there is an intermediate stage of fusion called hemifusion that precedes membrane fusion (Sapir et al., 2008). Proteins that can bend the membrane are known to be involved in the hemifusion process. To date, no such protein has been identified in Drosophila. However, its existence is likely and the search for such a protein remains a major challenge.

FuRMAS: triggering myoblast fusion in DrosophilaSusanne-Filiz Onel, Renate Renkawitz-PohlDevelopmental Dynamics 238:1513–1525, 2009.

FuRMAS: triggering myoblast fusion in Drosophila
Susanne-Filiz Onel, Renate Renkawitz-Pohl
Developmental Dynamics 238:1513–1525, 2009.