В развивающемся головном мозге позвоночных нейроны часто мигрируют на достаточные расстояния из пролиферативной зоны, где они зарождаются, чтобы достичь местоположения, где они будут выполнять свои специализированные функции. Миграция клеток в целом затрагивает комплекс взаимодействий между между мигрирующими клетками и их окружением. Примерами таких взаимодействий в ЦНС являются взаимодействия между мигрирующими кортикальными нейронами и их субстратами в виде радиальной глиии (Marin and Rubenstein, 2003) и между нейронами рострального миграторного потока и трубочками астроцитов по которым они мигрируют в обонятельные луковицы (Kaneko et al., 2010). В генетических подходах in vivo необходимо выяснить взаимодействия между мигрирующими неронами и их окружением и идентифицировать гены, участвующие в таких взаимодействиях.
Накапливющиеся доказательства указывают, что направленная клеточная миграция испытывает влияние со стороны неканонического Wnt/planar cell polarity (PCP) сигнального пути. У позвоночных, как и у Drosophila, передача сигналов PCP координирует ориентацию клеточных структур в плоскости эпителия, как, напр., ориентацию пучков стереоцилий во внутреннем ухе (Kelly and Chen, 2007) и асимметричная локализация подвижных ресничек в эпителии (Park et al., 2008; Borovina et al., 2010). PCP путь, как известно, активен в контроле направленной клеточной подвижности при движения convergent extension (CE) во время гаструляции и поляризованного поведения клеток при закрытии нервной трубки (Heisenberg and Tada, 2002; Wallingford, 2006), миграции клеток нервного гребня (De Calisto et al., 2005; Carmona-Fontaine et al., 2008) и заживлении эпидермальных ран (Caddy et al., 2010). Участие генов PCP в миграции нейронов стало известно в исследовании facial branchiomotor (FBM) нейронов в сегментированно заднем мозге позвоночных. FBM нейроны являются субнабором краниальных бранхиомоторных нейронов, которые генерируются вентрально в ромбомере (r)4 и осуществляют высоко стереотипированную каудальную миграцию в r6 и r7 у рыбок данио. Здесь они формируют фациальное двигательное ядро, из которого аксоны выходят из заднего мозга через r4 и иннервируют мышцы головы, происходящие из второй бранхиальной дуги (Chandrasekhar, 2004). Во время этой миграции FBM нейроны движутся через нейроэпителий, соседний к донной (floor) пластинки, контактируя как с базальной мембраной, так и с др. мигрирующими FBM нейронами (Grant and Moens, 2010). Зиготическая потеря функции основных компонентов PCP Vang-like 2 (Vangl2), Prickle (Pk1a and Pk1b), Frizzled (Fzd3a) и Celsr (Celsr2) у рыбок данио во всех случаях ведет к специфической неспособности миграции FBM нейронов (Bingham et al., 2002; Jessen et al., 2002; Carreira-Barbosa et al., 2003; Wada et al., 2005; Wada et al., 2006; Rohrschneider et al., 2007). Эта роль PCP в направлении миограции FBM нейронов эволюционно закреплена, т.к. сходные фенотипы наблюдаются у мутантных мышей Vangl2, Fzd3 и Celsr (Vivancos et al., 2009; Qu et al., 2010).
Хотя эти генетические доказательства указывают на участие PCP пути в миграции FBM, остается неясным, как PCP компоненты регулируют миграцию. В эпителии основные компоненты PCP функционируют, чтобы сообщать о субклеточных различиях в поляризованной информации между соседними клетками межклеточным контакт-зависимым способом (Vladar et al., 2009). Такая молекулярная полярность затем траслируется в контекст-зависимую морфологическую асимметрию посредством активности специфичных для типов клеток молекул нижестоящих эффекторов, которые связывают информацию о полярности с изменениями в актиновом цитоскелете (Strutt et al., 1997; Lee and Adler, 2002; Strutt and Warrington, 2008). При миграции FBM нейронов анализ химер подтвердил, что PCP компоненты Vangl2, Fzd3a и Celsr2 действуют преимущественно клеточно неавтономно, поскольку нейроны дикого типа неспособны мигрировать через мутантный нейроэпителий, а мутантные нейроны мигрируют через окружение дикого типа, хотя и не в полной мере (Jessen et al., 2002; Wada et al., 2005; Wada et al., 2006). Поскольку нейроэпителий, через который мигрируют FBM нейроны, обладает аспектами планарной полярности и экспрессирует PCP компоненты (Ciruna et al., 2006; Borovina et al., 2010), то было предположено, что это окружение формирует траекторию миграции FBM нейронов косвенно, путем создания благоприятного маршрута для миграции. Однако др. доказательства указывают на более прямую роль передачи сигналов PCP, поскольку основной компонент Pk1b необходим клеточно автономно для миграции FBM нейронов (Rohrschneider et al., 2007; Mapp et al., 2011). Отметим, что не идентифицированы PCP эффекторы миграции, кстати, это могло бы помочь в выявлении того, как PCP путь регулирует миграцию нейронов in vivo.
Крупный PDZ-домен содержащий белок Scribble (Scrib) также необходим для миграции FBM нейронов (Wada et al., 2005; Vivancos et al., 2009). Scrib обладает разнообразными функциями в клеточной полярности и миграции. Помимо его хорошо известной функции в определении апикально-базальной полярности в эпителиальных клетках дрозофилы вместе с Discs large (Dlg; Dlg1 – FlyBase) и Lethal giant larvae [Lgl; L(2)gl – FlyBase] (Bilder et al., 2000; Bilder and Perrimon, 2000), Scrib действует также как PCP компонент у позвоночных, у которых он взаимодействует с Vangl2, чтобы контролировать ориентацию сенсорных клеток уха, конвергентное удлинение и закрытие нервной трубки (Montcouquiol et al., 2003; Murdoch et al., 2003; Wada et al., 2005; Montcouquiol et al., 2006). У мигрирующих клеток в культуре Scrib располагается на ведущем крае, где он способствует образованию клеточных выпячиваний путем локальной модуляции активности и локализации Rac и Cdc42 в виде комплекса с факторами обмена ?PIX и GIT1 (Osmani et al., 2006; Dow et al., 2007; Nola et al., 2008). Т.о., Scrib представляет собой белок полярности с хорошо охарактеризованной клеточно автономной функцией в миграции, однакодо сих пор его функция в миграции FBM нейронов, подобно др. PCP компонентам была описана в основном как неавтономная (Wada et al., 2005).
У рыбок данио передовой генетический скрининг на мутации с дефективной миграцией FBM нейронов, мы идентифицировали мутацию в Nance-Horan syndrome-like 1b (
nhsl1bfh131). Nhsl1b родственен белку Nance-Horan синдрома (NHS) человека и у
Drosophila Scrib-взаимодействующему белку Guk-holder (Gukh). Мы показали, что nhsl1b необходим клеточно автономно для миграции FBM нейронов и показали, что белок Nhsl1b локализуется на краю мембранных выпячиваний FBM нейронов
in vivo. В экспериментах по клеточной трансплантации мы показали, что scrib и vangl2 обладают ранее недооцененной клеточно-автономной ролью в миграции FBM нейронов помимо их клеточно неавтономной роли и что nhsl1b взаимодействует генетически со scrib в этом процессе. Мы полагаем, что Nhsl1b является нейральным PCP эффектором, первым в этой системе, который участвует в мигрирующих нейронах, чтобы обеспечить направленные клеточные перемещения. Наши результаты подтверждают модель, согласно которой передача сигналов PCP между FBM нейронами и их окружением действует, чтобы контролировать непосредственно траекторию миграции. Более того, наш анализ химер выявил, что FBM нейроны обладают альтернативным, коллективным способом миграции, который требует взаимодействий между самими мигрирующими FBM нейронами и происходит независимо от Nhsl1b или PCP белков в мигрирующих нейронах. Мы предлагаем модель, согласно которой PCP-зависимый и коллективный способы совместно управляют направленной миграцией FBM нейронов
in vivo.
DISCUSSION
Мы идентифицировали новый ген, nhsl1b, необходимый для миграции FBM нейронов. Nhsl1b кодирует один из 4-х белков семейства NHS у рыбок данио, каждый из которых имеет N-терминальный WAVE homology domain (WHD), кодируемый альтернативно сплайсируемым первым экзоном (Brooks et al., 2010). WAVE белки, члены крупного семейства Wiskott-Aldrich syndrome protein (WASP) существуют в виде ингибирующего гетеропетамерного WAVE комплекса, который активируется с помощью Rac, чтобы способствовать полимеризации актина в структурах мембран выпячиваний посредством взаимодействия с комплексом Arp2/3 (Takenawa and Suetsugu, 2007; Insall and Machesky, 2009; Derivery and Gautreau, 2010). NHS человека связывает компоненты гетеропентамерного WAVE комплекса, но лишен др. доменов, необходимых для взаимодействия с актином и Arp2/3, подтверждая модель, согласно которой белки семейства NHS регулируют полимеризацию актина путем контроля сборки WAVE комплекса (Brooks et al., 2010). Мы установили, что белок Nhsl1b локализуется на мембране и часто обилен в выступающих вперед структурах мигрирующих FBM нейронов in vivo, это согласуется с ролью Nhsl1b в модулировании перестроек цитоскелет-мембрана в мигрирующих клетках, ниже передачи сигналов PCP.
У Drosophila, единственный гомолог семейства NHS Gukh взаимодействует физически со Scribble и необходим для локализации Scribble в нейромышечных соединениях (Mathew et al., 2002). В соответствии с этим мы наблюдали, что у рыбок данио Nhsl1b и Scrib взаимодействуют физически и обнаруживают строгое генетическое взаимодействие. Интересно, что Scrib также участвует в направленной миграции в др. клеточных контекстах. Scrib необходим для поляризации и миграции астроцитов и эпителиальных клеток молочных желез in vitro в методе ‘заживления’ царапин и в transwell культурах (Osmani et al., 2006; Dow et al., 2007; Nola et al., 2008). В этих клетках Scrib рекрутируется на ведущий край, где он необходим для локальной активации Rac и Cdc42 благодаря прямому взаимодействию с Rac/Cdc42 GEF, ?PIX (Audebert et al., 2004; Osmani et al., 2006; Dow et al., 2007; Nola et al., 2008). Принимая во внимание, что Rac , как известно, активирует WAVE комплекс (Derivery and Gautreau, 2010), наша находка, что Nhsl1b и Scrib взаимодействуют физически и генетически, открывает возможность, что Scrib может функционировать как каркас, который сводит вместе компоненты, которые регулируют сборку (посредством Nhsl1b) и активацию (посредством Rac) комплекса WAVE в мигрирующих FBM нейронах.
В предыдущей работе было показано, что PCP компоненты Scrib и Vangl2 действуют клеточно неавтономно в миграции FBM нейронов и было предположено, что планарно поляризованный эпителий формирует траекторию этой миграции (Jessen et al., 2002; Wada et al., 2005; Wada et al., 2006). В согласии с этой идеей мы показали, что зиготические функции Scrib и Vangl2 необходимы для планарной поляризации предшественников нейроэпителия и клеток донной пластинки вдоль передне-задней оси нервной трубки в то время, когда мигрируют FBM нейроны (see also Borovina et al., 2010). Напротив, наше исследование функции Nhsl1b подтвержадет клеточно автономную роль Nhsl1b внутри мигрирующих FBM нейронов: (1) Nhsl1b не нужен для планарной полярности в предшественниках окружающего нейроэпителия или в соседней донной пластинке, (2) дикого типа нейроны могут мигрировать в nhsl1b мутантном окружении, и (3) nhsl1b мутантные нейроны неспособны мигрировать через окружение дикого типа, если нейроны хозяина не мигрируют. Важно. что наш анализ химер также открыл важные клеточно автономные функции PCP компонентов Scrib и Vangl2 в этой миграции. Итак, наши данные подтверждают модель, в которой миграция FBM нейронов зависит как от планарной поляризации эпителия и донной пластинки, для чего необходимы Vangl2 и Scrib (Fig. 7B), так и от способности FBM нейронов быть поляризованными в ответ на это, что нуждается в Vangl2, Scrib, Nhsl1b , также как и в Pk1b (Mapp et al., 2011) в самих нейронах (Fig. 7C). В этом сценарии внешняя планарная полярность в нейроэпителиальных клетках транслируется во внутреннюю полярность нейронов, чтобы контролировать направление миграции. Двойная потребность в PCP компонента в FBM нейронах и в их окружении напоминает клеточно автономную и клеточно неавтономную функции основных PCP компонентов в крыльях мух (Lawrence et al., 2007; Wu and Mlodzik, 2009) и подтверждает интригующую возможность, что миграция FBM нейронов управляется передачей сигналов PCP между планарно поляризованным нейроэпителием и донной пластинкой и мигрирующими нейронами. Мы обозначили это как ‘PCP-dependent migration’ (Fig. 7D). Точный молекулярный механизм, с помощью которого полярность сообщается в таком контексте, предстоит ещё определить.
View larger version:
In this page In a new window
Download as PowerPoint Slide
Fig. 6.
A cell-autonomous role for Nhsl1b, Scrib and Vangl2 in migration. (A-J) Live confocal images at 48 hours post-fertilization (hpf) of chimeric zebrafish embryos with anterior to the top. Cascade blue marks donor-derived cells (blue), Tg(isl1CREST-hsp70l:mRFP)fh1 marks host motorneurons (red) and Tg(isl1:GFP) marks donor-derived motorneurons (green). Histograms on the right indicate the percent of donor-derived FBM neurons in rhombomere (r)4 (unmigrated), r5 and r6 (fully migrated) under the transplantation conditions indicated on the far left, which are written as Donor>Host. n refers to the total number of FBM neurons scored in each condition. Pk1b MOs were used in D, E, G and I to prevent host FBM neurons from migrating by a cell-autonomous mechanism. J shows the rescue of host nhsl1b mutant FBM neurons expressing Tg(isl1:GFP) (green) (arrow) by wild-type donor FBM neurons expressing Tg(isl1CREST-hsp70l:mRFP)fh1 (red). Scale bar: 50 ?m.
View larger version:
In this page In a new window
Download as PowerPoint Slide
Fig. 7.
A model for facial branchiomotor (FBM) neuron migration. (A-C) FBM neuron migration requires the planar polarization of both the neurons and the surrounding neuroepithelium. Neurons fail to migrate either owing to lack of neuroepithelial polarity, e.g. in a vangl2 or scrib mutant (B) or owing to the inability of the neurons to be polarized in response to this environment, e.g. in an nhsl1b or pk1b mutant (C). (D,E) Chimeric analysis reveals that FBM neurons can migrate by one of two distinct mechanisms: one which requires the function of PCP proteins both within FBM neurons and the neuroepithelium (D), or collectively, independent of these functions in the ‘rescued’ neurons but requiring the presence of other normally migrated neurons (E). The incomplete migration of donor-derived neurons observed in D or E when only one of these two mechanisms is available indicates that both mechanisms are functioning during normal migration.
PCP эффекторы являются белками, специфичными для типов клеток, которые функционируют клеточно автономно ниже передачи сигналов PCP, чтобы увязать планарную полярность с изменениями в цитоскелетных сетях (Strutt et al., 1997; Lee and Adler, 2002; Strutt and Warrington, 2008). Напр., большинство нижестоящих PCP эффекторов Multiple Wing Hairs, как было установлено, кодируют Formin Homology 3-домен содержащий белок, который регулирует полимеризацию актина на апикальной поверхности крыловых клеток мух PCP-зависимым способом (Strutt and Warrington, 2008). Клеточно автономная функцимя Nhsl1b участвует специфически в миграции FBM нейронов, но не в др. PCP-зависимых процессах, его локализация в клеточных выпячиваниях и известная роль членов семейства NHS в регуляции активности комплекса WAVE (Brooks et al., 2010) совместно свидетельствуют в пользу того, что Nhsl1b функционирует как нейрон-специфический PCP эффектор, впервые в этой системе.
Анализ наших эксперимнтов по трансплантации также выявляетя альтернативная форма миграции, которая зависят от взаимодействий между самими FBM нейронами. Мы наблюдали, что vangl2, scrib и nhsl1b мутантные FBM нейроны, которые неспособны мигрировать, используя ‘PCP-зависимый’ способ миграции, могут восстановить свою миграцию, если они находятся в присутствии соседних дикого типа FBM нейронов. Мы обозначили это как ‘коллективная миграция’ (Fig. 7E). Это аналог коллективной миграции клеток в зачатке латеральной линии рыбок данио, где клетки, лишенные рецептора к хемокиану Sdf1 (Cxcl12a – Zebrafish Information Network), тем не менее способны мигрировать, если они находтся в присутствии клеток дикого типа и могут воспринимать сигнал, или в яйцевых камерах мух, где пограничные клетки, лишенные транскрипционного фактора slbo, могут мигрировать в присутствии пограничных клеток дикого типа (Rorth et al., 2000; Haas and Gilmour, 2006). Коллективный способ миграции FBM нейронов, продемонстрированный в этой работе, может объяснить предыдущие наблюдения, что не все нейроны дикого типа эффективно мигрируют в окружении, где нейроны хозяина не мигрируют, хотя эпителиальная полярность нормальная (Cooper et al., 2003; Rohrschneider et al., 2007). Способность одного FBM нейрона управлять миграцией др., по-видимому, обеспечивается посредством межклеточной, контакт-обеспечиваемой передачи сигналов. Хотя молекулярный механизм коллективной миграции предстоит выяснить, наши данные указывают на то, что существует генетически отличный способ от PCP-зависимой миграции, поскольку он не нуждается в функции vangl2, scrib или nhsl1b в ‘спасенных’ нейронах.
PCP-зависимый и коллективный способы миграции скорее всего оба активны во время миграции FBM нейронов дикого типа, т.к. ни один из способов недостаточен для завершения миграции. Мы полагаем, что инициальная миграция из r4 может преимущественно управляться первым PCP-и-Nhsl1b-зависимым способом, тогда как более поздняя миграция клеток может использовать коллективный способ. Однако один и тот же рнейрон может использовать оба способа в разное время во время своей миграции или оба способа могут быть активны в разных частях клетки в одно и то же время. С высоким разрешением наблюдение за живыми клетками химерных эмбрионов, в которых один или др. способ отключен, может помочь в выяснении относительных вкладов PCP-зависимого и коллективного способов миграции FBM нейронов.
Сайт создан в системе
uCoz 
