Мы скомбинировали генетические инструменты с эпигеномными технологиями, чтобы исследовать пространственно временные механизмы RA-индуцированной активации Hox генов в ESCs. Мы идентифицировали RARγ в качестве превалирующего медиатора передачи сигналов RA в ESCs в контексте активации транскрипции Hoxa и Hoxb хромосомных кластеров в ранние моменты времени после добавления RA. RARγ необходим для запуска широкой эпигеномной реорганизации Hoxa и Hoxb хромосомных кластеров и для ген-специфического удаления H3K27me3 метки. Мы установили быструю внутрикластерную реорганизацию после воздействия RA, с транскрипцией и помещением активирующих меток перед удалением polycomb-репрессивной метки, H3K27me3, в течение нескольких часов. Эти результаты подтверждают, что стирание H3K27me3 по времени не связано с активностью MLL комплекса и совпадает с индукцией транскрипции. Наши данные также выявили высокую степень межкластерной координации между кластерами Hoxa и Hoxb. Эта координация возникает в результате перекрестной регуляции генов проксимальных частей Hoxa и Hoxb кластеров генов, запускаемой с помощью RARγ, расположенного в Hoxa1 3'-RARE. Т.о., 3'-Hoxa1 RARE является критическим регуляторным элементом, необходимым для RA-RARγ-обеспечиваемой активации как Hoxa1 , так и Hoxb1 кластеров.

Мы установили, что крупные домены бивалентного хроматина соответствуют собранным в кластеры Hox генам в самообновляющихся ESCs, что skj продемонстрировано и др. группами (52). Сборка этих региональных доменов не нуждается в базовой оккупации элементов RAREs рецептором RARγ, поскольку бивалентный характер этих кластеров сохранялся в наших мутантных ESC линиях (Figs. 2 and 3 and supplemental Figs. SI and S2). Возможно, что эти бивалентные домены собираются сами при этом их организация связана с лежащими в основе характерными последовательностями локусов (52, 64). Помещение активирующих меток (acH3 и H3K4me3) высоко периодично и тонко скоррелировано с местом старта транскрипции кластера генов. Эта периодичность указывает на топологическую организацию кластера с активирующими метками, собранными с помощью внутриядерного узла (hub), такого как "транскрипционная фактория" (86, 87). Хотя мы не обнаружили базовой транскрипции с генов Нох, собранных в кластер, ясно, что эти гены поддерживаются в "сбалансированном" состоянии, так что они могут быть транскрибированы, будучи запущенными онтогенетическими сигналами. RA является важной онтогенетической сигнальной молекулой, которая затрагивает организацию плана тела путем регуляции ею Hox генов. Мы установили, что RA индуцирует синхронную активацию проксимальных генов кластера Hoxa и Hoxb в WT ESCs (Fig. 2E and Fig. 3Ј). В соответствии с активацией транскрипции быстро ремоделируется эпигеномная конфигурация этих кластеров, при этом самые ранние изменения появляются вблизи TSSs, маркированных с помощью H3K4me3 и acH3 (Figs. 2, A and B, and 3, A and B, WT). H3K4me3 может служить в качестве якоря для пост-иниационных и сплайс факторов , а индуцированное помещение этой метки может создавать связь с ко-транскрипционным процессингом РНК (88). Элегантные исследования ядерной организации ESC ранее показали, что Hoxb1 быстро перемещается в транскрипционную факторию в ответ на RA (89). Транскрипционные фактории делают возможной общую энхансерную активность и концентрацию регуляторных белков, необходимых для локального распространения хроматиновых модификаций (86, 90). В свете этого ассоциации кластеров Hox генов с транскрипционными факториями (или путем de novo сборки или рекрутирования предварительно сформированных факторий) может облегчить скоординированную регуляцию кластеров (87). Многими способами осуществляемое, синхронное распространение acH3 и H3K4me3 окружающих генов с RA-индуцированной транскрипцией, по-видимому, является линейным отражением топологии Hox кластеров. Можно предположить, что преобразование в транскрипционных факториях проксимальных частей кластеров Hoxa и Hoxb управляется с помощью RARγ? расположенного в Hoxa1 3'-RARE, поскольку делеция или рецептора или его сайта связывания снижает или устраняет RA индукцию как Hoxa, так и Hoxb кластеров генов (Figs. 2 and 3, γ-, E-).

Динамичная совместная локализация активно транскрибируемых генов, скорее свего, правило , чем исключение (91). Активные транскрипционные фактории обычно обладают удлиненной формой pol II, фосфорилированной по Ser-2 (Ser(P)-2) (87, 91). Однако определенные онтогенетические гены, располагающиеся внутри PRC1-позитивных бивалентных доменов (64) вместо этого ассоциированы с готовыми транскрипционными факториями, содержащими pol II Ser(P)-5 вместо pol II Ser(P)-2 (92, 93). Неожиданно, синтез РНК происходит в готовых транскрипционных факториях, но pol II элонгация неэффективно сцеплена с созреванием синтезируемой РНК и транскрипция является непродуктивной. Поразительно, но индукция таких онтогенетических генов не ассоциирована с крупными изменениями в оккупации pol II, а вместо этого связана с удалением PRC1/Ring1-обусловленного убиквитинирования H2A, по крайней мере, поздние моменты времени (92, 93). Мы нашли, что pol II Ser(P)-5 предварительно загружается на промоторы Hoxa1 и Hoxb1 в самообновляющихся ESCs, указывая тем самым, что эти гены в основном ассоциированы с готовыми транскрипционными факториями (Fig. 5). RA запускает только умеренное дальнейшее рекрутирование polymerase на эти промоторы, привлекая др. механизмы для быстрой индукции транскрипции этих генов (Figs. 2Јand 3Ј).

Эпигенетическая реорганизация проксимальных частей кластеров Hox быстро наступает вслед за воздействием RA. Переход от бивалентной конфигурации к зрелому паттерну в основном завершается через 24 ч, но кинетика активации осуществляется ещё быстрее, чем темп стирания H3K27me3 (Figs. 2 and 3). Предыдущие исследования также показали, что триметилирование H3K4 с помощью MLL2/3 комплекса предшествует деметилированию H3K27me3 с помощью JmjC доменового белка UTX, но в этих исследованиях оценивали Hox гены после сравнительного длительной (18-72 h) экспозиции RA (73, 94). Наше исследование расширило эти предварительные исследования путем предоставления механистической информации о ранней кинетике активации Нох генов в ESCs. Хотя действие UTX может быть необходимо для полной транскрипционной активации Hox генов с помощью RA в поздние моменты времени (94), удаление H3K27me3 не нужно для инициации индукции транскрипции (Figs. 2, C and Ј, and 3, C and Ј). Более того, стирание H3K27me3, , по-видимому, недостаточно для нормальной индукции транскрипции, поскольку транскрипция тяжело депрессирована в линии RARE-kO ESC, несмотря на то, что темп деметилирования сохраняется (Fig. 2, Cand Ј, Ј-). Т.о., если RA-запущенная индукция проксимальной части Hox кластеров нуждается в удалении H2Aubl, чтобы освободить готовую pol II Ser(P)-5, она происходит слишком быстро, чтобы зависеть от потери PRC1 комплексов, ответственных за помещение H2Aubl метки (93). Вообще-то затем RA рекрутирует на Hox гены H2A deubiquitinase, такую как 2A-DUB благодаря её взаимодействию с RAR/RXR коактиватором p300/PCAF (31, 32, 95).

Хотя мы и другие показали, что RA стимулирует RARs, чтобы подавлять ко-репрессоры и рекрутировать коактиваторы на специфические RAREs (31, 32), только рекрутирование не объясняет полностью активацию Hox в ESCs. Подобно pol II Ser(P)-5 внутри готовой транскрипционной фактории гистоновые acetyltransferases и MLL комплексы предварительно собираются на локусах Hox, до тех пор. пока их активность недостаточна, чтобы инициировать продуктивную транскрипцию (Figs. 2, 3, 5, and 6). Сходным образом, UTX ассоциирует с Hoxb1 локусом в самообновляющихся ESCs в то время, когда локус широко маркирован H3K27me3; т.о., активность UTX д. индуцироваться до добавления RA (94). Ни RARγ, ни Hoxa1 3'-RARE не нужны для сборки этих факторов и дальнейшее рекрутирование этих комплексов на Hox локусы после воздействия RA скромное по сравнению со скоростью и степенью активации транскрипции. Наши данные четко показывают первенство RARγ в качестве медиатора ранней активации Hox с помощью RA, но они не объясняют, как Hox гены столь быстро активируются транскрипционно. Вообще-то даже незначительные изменения в специфическом факторе или гистоновых метках запускают каскад событий, ведущих к эффективной транскрипции. Мы полагаем, что RA индуцирует RARγ-зависимую активность, которая высвобождает предварительно собранные комплексы и делает возможной инициацию транскрипции.

Наши данные подтверждают модель, согласно которой RARγ действует в ESCs в качестве критического регулятора кластеров Hoxa и Hoxb посредством взаимодействий с определенными энхансерными элементами. Мы показали, что эти Hox кластеры неспособны подвергаться обычной транскрипции и формированию эпигеномного паттерна после воздействия RA, если отсутствуют или RARγ или сайт его связывания 3' в Hoxa1. Кинетика этих событий подтверждает, что активация подготовленной транскрипции не дожидается стирания PRC2 меток. Эти результаты понуждают искать инициального арбитра RARγ-индуцированной активации Hox.