Дифференцировка сосудистых гладкомышечных клеток (SMC)² является важным компонентом сосудистого развития. Этот сложный процесс дифференцировки может быть подразделен на три основные регуляторные стадии: 1) стадия инициации: избирательная активация субнабора генов, необходимых для функционирования SMC; 2) скоординированный контроль экспрессии SMC-избирательных/специфических генов в определенное время и в стоихометрии; 3)непрерывная регуляция экспрессии генов посредством эффектов сигналов локального окружения (1,2). Достигнут существенный прогресс в идентификации механизмов, которые контролируют экспрессию репертуара генов, специфичных для дифференцировки и функции сосудистых SMC (2). Однако точные молекулярные механизмы управления ранней инициацией дифференцировки SMC ещё предстоит выявить.

Миокардин (MYOCD) является мощным коактиватором для serum response factor и экспрессируется в основном в SMC и кардиомиоцитах. Избыточная экспрессия MYOCD вызывает заметную активацию множественных CArG- содержащих маркерных SMC генов, включая гладкомышечный α-actin (Acta2), тяжелую цепь миозина, SM22α (Taglin) и SM-calponin (Cnn1) (3-6). Нокаут Myocd у мышей вызывает эмбриональную летальность на ст. Е10.5 и ассоциирует с неспособностью SMC к инвестированию и дифференцировке (7). Дополнительные исследования показали, что Myocd может индуцировать SMC-подобный контрактильный фенотип (8), хотя экспрессия др. ассоциируемых с SMC генов, по-видимому, не зависит от MYOCD (9,10). Экспрессия ранних SMC маркерных генов, таких как Taglin и Acta2 начинается до обнаружения мРНК Myocd в эмбриональной дорсальной аорте; это может указывать на то. что MYOCD играет минимальную роль в инициации дифференцировки SMC в некоторых сосудистых тканях (4, 11-13).

Генетический анализ у мышей показал, что передача сигналов TGF-β является важным детерминантом дифференцировки SMC во время эмбрионального развития. Нокаут TGF-β рецепторов и подавление сигнальных компонентов ведут к дефектам эмбрионального ангиогенеза из-за отсутствия формирования SMC (14-19). Исследования in vitro продемонстрировали, что TGF-β индуцирует дифференцировку SMC из нескольких разных типов клеток, таких как стволовые клетки нервного гребня (20-22), мезенхимных предшественников (23) и эндотелиальных клеток (24), что соответствует наблюдениям in vivo. Недавнее исследование показало, что MYOCD участвует в TGF-β-индуцированной дифференцировке SMC. MYOCD, по-видимому, действует как коактиватор Smad3 и регулирует активность промоторов маркеров SMC посредством Smad-связывающего элемента в CArG боксе независимым способом (25). Т.к. MYOCD взаимодействие со Smad3 наблюдалось во многих исследования по избыточной экспрессии, точная роль эндогенного MYOCD в инициации дифференцировки SMC неизвестна.

В данном исследовании мы установили, что эндогенный MYOCD не активируется клеточной линии в предшественниках SMC вплоть до момента, спустя 18 ч после индукции TGF-β. Это время осуществления экспрессии ранних маркерных генов SMC, таких как Acta2 и Taglin (26), это подтверждает, что MYOCD не может участвовать в инициации программы дифференцировки SMC, вызываемой TGF-β. Дополнительные исследования показали, что супрессия MYOCD обусловлена Smad3 секвестрацией Nkx2.5, критического транскрипционного фактора для транскрипции Myocd (27). Блокада с помощью Smad3 Myocd в инициальной фазе индукции с помощью TGF-β обусловлена ядерной локализацией Smad3. Удержание Smad3 в ядрах во время поздней фазы (18 ч) ведет к продолжению ингибирования промотора. Это замалчивание Myocd, скорее всего, важный механизм для инициации развития SMC, поскольку инициальное превращение SMC фенотипа нуждается в точной регуляции. MYOCD является очень сильным активатором генов SMC и его экспрессия обычно вызывает драматические изменения, которые могут препятствовать клеткам предшественникам тонко настраиваться и аккуратно инициировать дифференцировку SMC. Вместо этого Smad белки, напр., Smad3 в 10Т1/2 клетках являются умеренными регуляторами и т.о. могут активировать гены SMC в мягким, но точным способом. Как только клетки проходят стадию инициации, экспрессия Myocd ускоряет процесс дифференцировки и генерирует зрелые SMC.

Активация Myocd с помощью TGF-β в клетках 10Т1/2 обеспечивается с помощью PI3K и её нижестоящего транскрипционного фактора Nkx2.5, который важен для экспрессии Myocd в кардиальных миоцитах (27). мРНК Nkx2.5 также экспрессируется в некоторых зрелых SMC (41). Smad3 блокада Myocd осуществляется не за счет ингибирования активности PI3K. Вместо этого, Smad3 супрессирует активацию промотора Myocd за счет соединения с Nkx2.5. TGF-β индуцирует быструю экспрессию Nkx2.5. Nkx2.5 располагается как в цитоплазме, так и ядре после синтеза. Большая часть Smad3 транслоцируется в ядро непосредственно после индукции с помощью TGF-β. Smad3, по-видимому, колокализуется и физически взаимодействует с Nkx2.5 на ранних стадиях индукции с помощью TGF-β, это препятствует Nkx2.5 взаимодействовать с промотором Myocd. В более позднее время Smad3 переносится в цитоплазму, высвобождает Nkv2.5 в ядре, где он соединяется с промотором Myocd. Smad3, в самом деле, ингибирует активируемую Nkx2.5 активность промотора Myocd зависимым от дозы способом.

Интересно, что нокдаун Smad3 в ранней фазе индукции с помощью TGF-β увеличивает связывание Nkx2.5 с промотором Myocd (Рис. 7, А и В). Однако повышенное взаимодействие Nkx2.5 с промотором Myocd не усиливает далее активности промотора Myocd? указывая тем самым, что дополнительные факторы могут быть необходимы для увеличения экспрессии MYOCD до порогового уровня. Эти факторы могут быть не активированы вплоть до поздней фазы индукции с помощью TGF-β.

Полученные данные предлагают модель активации Myocd dj время инициации SMC дифференцировки с помощью TGF-β из клеток мезенхимных предшественников 10Т1/2. После стимуляции TGF-β активируется Smad3 и транслоцируется в ядро, где соединяется с Nkx2.5? это блокирует связывание Nkx2.5 с промотором Myocd и тем самым ингибируется экспрессия мРНК Myocd. После стадии инициации, Smad3 перемещается обратно в цитоплазму, это высвобождает Nkx2.5 и делает возможным соединение с промотором Myocd. Nkx2.5 и др. транскрипционные факторы работают вместе, чтобы активировать экспрессию MYOCD до порогового уровня, это ускоряет процесс дифференцировки SMC (Рис. 8). По-видимому, сходная ситуация наблюдается в клетках нервного гребня, поскольку Myocd также не активируется в клетках Monc-1 вплоть до поздней стадии (2 спустя после индукции с помощью TGF-β). Однако для др. клеток предшественников, таких как А404, Myocd присутствует ещё до воздействия ретиноевой кислоты. Стимуляция с помощью RA существенно усиливает экспрессию мРНК Myocd (6). Следовательно, инициация ретиноевой кислотой SMC дифференцировки из А404 д. регулироваться с помощью др. механизма. Существование разных механизмов для разных предшественников согласуется с разными паттернами экспрессии Myocd в субнаборах сосудистых SMC in vivo во время эмбрионального развития (4).