Формирование паттерна и ремоделирование вновь формируемых сосудов использует организованные перемещения эндотелиальных клеток (Lamalice et al.. 2007). Во время развития млекопитающих формирование de novo кровеносных сосудов первоначально происходит вне эмбриона в мезодермальном слое желточного мешка. Кластеры мезодермальных предшественников в местах образования кровеносных сосудов подвергаются дифференцировке в эндотелиальные и кровяные клетки, образуя кровяные островки (Doetschman et al., 1987). Эндотелиальные клетки затем теряют межклеточные контакты, мигрируют и повторно выстраиваются в ряды, чтобы сформировать трубки, которые сливаются, чтобы создать взаимосвязанные сети сосудов, обозначаемых примитивные капиллярные сплетения. Ремоделирование капиллярных сплетений в функциональную иерархическую сеть из крупных, средних и малых в диаметре сосудов происходит точно выверенным и контролируемым образом, что гарантируют упорядоченные перемещения эндотелиальных клеток (Lamalice et al., 2007). Исследования с делециями генов у мышей идентифицировали множественные факторы роста и их рецепторы, которые являются критическими для ремоделирования сосудов желточного мешка, включая vascular endothelial growth factor-A ( VEGF-A; Carmeliet et al.. 1996; Ferrara et al., 1996), ephrinB2 (Adams et al.. 1999: Geretу and Anderson, 2002) and angiopoetin-1 (Suri et al., 1996), а также членов hedgehog (Byrd et al., 2002), Notch (Krebs el al.. 2000; Limbourg et al.. 2005) и TGF-β семейств (Li et al.. 1999; Yanget al., 1999j. Способные к диффузии сосудистые ростовые факторы высвобождаются соседними клетками или внеклеточным матриксом (ECM) и взаимодействуют со своими рецепторами на эндотелиальных клетках, чтобы регулировать как пролиферацию, так и миграцию, необходимые для моделирования сосудов, однако точные молекулярные сигнальные каскады и клеточные события, способствующие миграции эндотелиальных клеток in vivo изучены недостаточно.

RhoGTPases, низкого мол. веса внутриклеточные GTP-связывающие белки, как известно, трансдуцируют внеклеточные сигналы от ростовых факторов к актиновому цитоскелету, чтобы обеспечивать миграцию клеток (Ridley and Hall. 1992; Ridley et al.. 1992). RhoA, Rac1 и Cdc42 наиболее изучены среди Rho-GTPases. Rho белки активны, когда связаны с ГТФ и неактивны, когда связаны с ГДФ (Etienne-Manne-ville and Hall, 2002). Rac1 обеспечивает образование и вытягивание ламеллиподий и тем самым обеспечивают миграцию клеток вперед (Nobes and Hall, 1995). Разборка фокальных адгезий, которая д. происходить, чтобы стала возможной миграция клеток, нуждается в активации Rac1 и её эффекторах, таких как p21-activated kinase (РАК; Zhao et al., 2000). Rac1 экспрессируется повсеместно во многих типах клеток, однако специфичные для эндотелия делеции Rac1 вызывают дефекты ремоделирования сосудов и раннюю эмбриональную гибель на ст. 9.5 days post coitum (dpc; Tan et al., 2008).

Эти результаты указывают на центральную роль Rac1 в координации перемещений эндотелиальных клеток во время раннего эмбрионального развития сосудов. В противоположность функциональным ролям Rac1 во время миграции, инактивация Rho, по-видимому, необходима для разборки фокальных адгезий, а активация RhoA с помощью интегринов вызывает образование стрессовых волокон и фокальных адгезий и обеспечивает контракцию клеточного тыла (Ridley and llall. 1992; Barry et al., 1997; Clark et al., 1998; lien et al., 1999; Gallant et al., 2005). С повышением активности Rho фокальные адгезии увеличиваются в размере и обнаруживают усиление стабильности (Ren et al., 2000), это мешает миграции.

Помимо Rho-обеспечиваемых сигналов, регуляция миграции клеток базируется на образовании фокальных адгезий и передаче сигналов от этих сайтов. Фокальные адгезии являются точками контактов между клетками и ECM, они обогащены интегринами, а также цитоскелетными, адапторными и сигнальными белками, включая talin, tensin. α-actinin, paxillin, vinculin, zyxin, p130cas и FAK. Чтобы происходило перемещение клеток вперед, по фронту клеток д. формироваться адгезивные сайты и устраняться в тылу клетки (Nobes and Hall, 1999). Целенаправленные делеции генов белков фокальных адгезий vinculin, paxillin и FAK у мышей (Xu et al., 1998a; Hagel et al.. 2002; Hie et al., 2003) приводили к ранней эмбриональной летальности, обусловленной мезодермальными, сосудистыми и кардиальными дефектами, демонстрируя тем самым критическую роль этих белков во время раннего эмбрионального развития сосудов.

Vinculin является основным компонентом фокальных адгезий и межклеточных соединений, показано, что модулирование уровней vinculin может непосредственно влиять на подвижность клеток. Избыточная экспрессия vinculin с помощью трансфекции в 3T3 клетки ингибирует миграцию (Rodriguez Fernandez et al.. 1992), тогда как снижени экспрессии vinculin в 3T3 клетках, трансфицированных антисмысловой vinculin кДНК конструкцией, способствует клеточной подвижности (Rodriguez Fernandez et al.. 1993). В согласии с этой находкой и наблюдение, что раковые клетки, которые лишены vinculin, инвазивны и обладают высоким метастатическим потенциалом (Lifschitz-Mercer et al.. 1997). Роль передачи сигналов vinculin в ингибировании миграции parietal энтодермы, инициального миграторного типа клеток у эмбрионво мыши, продемонстрирована с использованием vinculin-дефицитных F9 teratocarcinoma стволовых клеток, понуждаемых к формирование париетальной энтодермы (Mills et al.. 2005). Париетальная энтодерма, происходящая из vinculin-дефицитных F9 стволовых клеток, мигрирует приблизительно в два раза дальше, чем париетальная энтодерма, происходящая от клеток дикого типа. Vinculin^-/- F9 стволовые клетки также обладают пониженной слипчивостью. Рекрутирование vinculin в сайты фокальных адгезий, как было установлено, играет роль в укреплении адгезии между клетками и ECM, тогда как снижение адгезии и усиление миграции происходит при подавлении vinculin (Coll et al.. 1995). Vinculin сам по себе не существенен для образования фокальных адгезий, т.к. количество фокальных адгезий в vinculin-нулевых клетках сходно с таковым в клетках дикого типа (WT) (Coll et al., 1995; Mills et al., 2005), однако роль vinculin в супрессии оборота фокальных адгезий, а , следовательно, и подвижности (Saunders et al.. 2006) была продемонстрирована у vinculin нулевых эмбриональных фибробластах мыши, причем экспрессия vinculin в этих клетках давала более крупные фокальные адгезии с повышенной стабильностью и слабым оборотом (turnover).

Белок фокальных адгезий FAK также необходим для оборота фокальных адгезий. Фибробласты от FAK^-/- мышей обнаруживают пониженное распластывание, мигрируют медленнее, чем FAK^+/+ фибробласты и обнаруживают повышенные количества фокальных адгезий (llic et al., 1995). Эти данные указывают на то. что FAK не только необходима для сборки фокальных адгезий, но и играет существенную роль в обороте фокальных адгезий и поэтому важна для миграции клеток. Регуляция оборота (turnover) фокальных адгезий и сигнальная трансдукция от этих сайтов используют сигнальные пути фосфорилирования тирозина. В частности, активация FAK при её аутофосфорилировании сайта остатка тирозина 397 ассоциирует с разборкой фокальных адгезий и необходима для обеспечения клеточной миграции (Sieg et al.. 1999; Webb et al.. 2004; Hamadi et al.. 2005).

Т.о., исходя из предсуществующих и преимущественно in vitro данных, имеются доказательства, что скоординированная регуляция миграции клеток использует сигналы трансдукции от внеклеточных факторов роста ко внутриклеточным медиаторам клеточной формы и адгезии, включая RhoGTPases и белки фокальных адгезий. Однако интеграция всех этих молекулярных событий во время инициации ремоделирования эмбриональных сосудов in vivo не была исследована. Для дальнейшего понимания и идентификации молекулярных и клеточных событий, необходимых для собственно миграции эндотелиальных клеток во время ремоделирования ранних эмбриональных сосудов в контексте in vivo, мы исследовали retinaldehyde dehydrogenase-2 (Raldh2) нулевые эмбрионы в качестве мышиной модели дефектного ремоделирования сосудистых сплетений желточного мешка. Raldh2, энзим второй ступени метаболического пути витамина A, который окисляет all-trans-retinal в ретиноевую кислоту (RA), является преимущественным энзимом, ответственным за продукцию RA во время раннего эмбриогенеза и существенен для выживания эмбрионов (Nie-derreither et al., 1999). У Raldh2^-/- мутантов не происходит ремоделирования первичных капиллярных сплетений на ст. 9.5 dpc. Установлено, что это обусловлено снижением активации Rac1, повышением активации RhoA и увеличением фокальных адгезий. Vinculin увеличен в Raldh2^-/- желточных мешках, а молекулярные события, важные для оборота фокальных адгезий, фосфорилирование FAK (Tyr397) и ассоциации FAK-paxiliin, снижены. RA восстанавливает ремоделирование сосудов путем подавления vinculin и восстановления фосфорилирования FAK (Tyr397) и ассоциации FAK-paxillLn. Более того, восстановление сосудов с помощью vascular endothelial growth factor-A, Indian hedgehog и basic fibroblast growth factor восстанавливает фосфорилирование FAK (Tyr397) в эндотелии Raldh2^-/- желточных мешков. Полученные результаты предоставляют новую информацию о регуляции миграции эндотелиальных клеток во время ремоделирования сосудов in vivo путем добавления путей активации Rac1 и FAK в качестве критического медиатора образования и оборота фокальных адгезий во время ремоделирования сосудов.