У всех проанализированных видов эукариот пространственное расположение генома неслучайно: хромосомы или геномные области занимают предпочтительные позиции по отношению др. к др. и/или ядерных маркеров (Parada and Misteli, 2002).
На значительно более мелкой шкале хроматинового волокна, которая является результатом обертывания спирали двойной ДНК вокруг нуклеосом, описываются обычно как компактные структуры в 30 nm диаметре. 30-nm волокно определено в экспериментах in vitro, но его тождество in vivo сегодня спорно (Maeshima et al., 2010). Как хроматиновое волокно организовано на крупной шкале порядка, сравнимого с ограниченным объёмом ядра, известно ещё менее.
Очевидным ограничением
S. cerevisiae для исследований организации хроматина является малый размер ядра, ~1 µm радиус у гаплоидов, всего лишь в несколько раз крупнее, чем дифракцией ограниченное разрешение обычной световой микроскопии. Однако, недавний прогресс в методах получения изображений, включая разработку новых вычислительных методов анализа, делают возможным картирование ядерной организации дрожжей с subdiffraction разрешением. В комбинации с новыми геномными биохимическими техниками,
S. cerevisiae является важным ключом к фундаментальным вопросам относительно структурного и функционального состояния хромосом.
Topology of 3D chromosomal architecture
Centromere clustering, telomere positioning, and the Rabl-like configuration.
Центромеры, как было первоначально установлено с помощью FISH, образуют кластер в виде структуры подобной розетке вокруг SPB (Guacci et al., 1997; Jin et al., 1998; Jin et al., 2000; Bystricky et al., 2004). Исследования с использованием системы Cre/lox (в которой экспрессия бактериального происхождения Cre рекомбиназы обеспечивает рекомбинацию между экзогенно внесенными loxP сайтами, позволяя тем самым измерять частоту рекомбинации; Hoess and Abremski, 1984) показали повышенные скорости рекомбинации для локусов, тесно расположенных к центромерам (Burgess and Kleckner, 1999). Образование кластера центромер недавно было подтверждено с использованием chromosome conformation capture (3C) в комбинации с массивным секвенированием генома дрожжей (Duan et al., 2010). 3C техника базируется на отлавливании с помощью мягкого поперечного сшивания взаимодействующих сегментов хроматина в большой популяции клеток, сопровождаемое внутримолекулярными сшивками в условиях разбавления. PCR или секвенирование затем идентифицирует химерные последовательности, обилие которых позволяет определять вероятности взаимодействий между парами хроматиновых локусов. Первоначально ограниченная анализом цис-взаимодействий выбранных локусов (Dekker et al., 2002), техника была расширена до картирования геномных взаимодействий (Simonis et al., 2006; Lieberman-Aiden et al., 2009). Эта техника подтвердила образование кластера центромер в виде розетко-образной структуры, со множеством межхромосомных контактов, сконцентрированных в промежутке в 20-kb вокруг центромер (Fig. 1; Rodley et al., 2009; Duan et al., 2010).
Выяснены механизмы образования кластера центромер. Каждая центромера управляет сборкой кинетохора, белкового комплекса из ~70 субъединиц, которые связывают плюс конец одиночной микротрубочки (Joglekar et al., 2009). Во время интерфазы, 16 микротрубочек поддерживают связь между центромерами и SPB (Furuyama and Biggins, 2007). С помощью флюоресцентного мечения компонентов SPB и инсерции специфической бактериальной операторной последовательности (распознаваемой с помощью флюоресцентно меченного репрессора) вюлизи к центромерам, было измерено расстояние между SPB и центромерой с высоким разрешением на живых клетках (Dorn et al., 2005). Хотя рост и усадка микротрубочек постоянны, SPB и центромера никогда не обнаруживались ближе чем ~200 nm в G1 фазе (Dorn et al., 2005). Важно, что разрушение связи кинетохора-микротрубочка ведет к пертурбациям образования кластера центромер (Jin et al., 2000). Одной из крупных сил по организации хромосом, по-видимому, является зависимое от микротрубочки закрепление центромеры на SPB, и расширение ядерной оболочки в ходе клеточного цикла.
Дополнительным важным признаком ядерной организации дрожжей является позиционирование концов хромосом, т.е. теломер и субтеломер. У большинства эукариот, теломеры являются участками повторяющихся мотивов ДНК. У S. cerevisiae, эти повторы приблизительно длиной в 250 п.н. с повторяющимися единицами из TG1-3. Субтеломеры это ~30-kb регионы ДНК выше теломер, которые включают немногие несущественные гены. Высоко консервативная ~500-п.н. стержневая X последовательность оказывается общей для всех субтеломер, а 17 из 32 субтеломер содержат Y' элементы, последовательность с неизвестной функцией, которая имеет варьирующую длину (4-8 kb) и количество среди хромосомных плеч и у видов Saccharomyces (Louis et al., 1994; Liti and Louis, 2005).
Теломеры и субтеломеры первоначально выявлялись с помощью FISH, будучи локализованными на периферии ядра. Более того, наблюдалось относительно небольшое количество (3-8) блестящих флюоресцентных пятен, которые показывали. что некоторые концы хромосом собраны в кластер в тесную близость др. к др. (Gotta et al., 1996; Hediger et al., 2002). Когда субтеломеры наблюдались в популяции живых клеток, то они постоянно обнаруживались расположенными преимущественно вблизи периферии ядра (Fig. 1; Hediger et al., 2002; Bystricky et al., 2005; Schober et al., 2008; Therizols et al., 2010). Это оказывалось верным для 20 из 32 субтеломер дрожжей.
Что удерживает концы хромосом дрожжей вблизи края ядра? Некоторые исследования выявили белки, которые взаимодействуют непосредственно с теломерами и субтеломерами и концентрируются на периферии ядра. Напр., Sir4 (silent information regulator), который является частью комплекса Sir2-Sir4, привлекается на субтеломеры с помощью белка, связывающегося с теломерами, Rap1 (Hecht et al., 1995); Sir4 также взаимодействует с Esc1, белком. расположенным на ядерной оболочке (Andrulis et al., 2002; Taddei et al., 2004), и с Mps3, интегральным SUN домен-содержащим белком ядерной мембраны, который концентрируется в SPB (Antoniacci et al., 2007; Bupp et al., 2007). Сходным образом белок Ku70, который вместе с Ku80 связывает двунитчатую теломерную ДНК, непосредственно или косвенно взаимодействует с членами ядерной оболочки и/или nuclear pore complex (NPC; Galy et al., 2000; Therizols et al., 2006). Ku80 может также связывать субъединицы теломеразы, которые в свою очередь нуждаются в Mps3, чтобы направлять теломеры к оболочке (Schober et al., 2009). Эти взаимодействия, обеспечиваемые с помощью Sir4/Mps3 для субтеломер и Ku70/80 для теломер, как было предположено являются двумя частично перекрывающимися путями, которые направляют концы хромосом к оболочке ядра, несмотря на некоторые вариации в зависимости от плеч хромосом и фазы клеточного цикла (Hediger et al., 2002; Taddei et al., 2004).
Образование кластера центромер вблизи SPB и позиционирование теломер вблизи периферии ядра указывает на неслучайное поляризованное расположение хромосом в интерфазных ядрах дрожжей. Такая конфигурация наблюдалась первоначально в эпителии личинок саламандр Carl Rabl и затем в быстро делящихся ядрах, подобно у эмбрионов Drosophila melanogaster и у многих видов злаковых (Rabl, 1885; Cowan et al., 2001). Rabl конфигурация обнаруживается в интерфазе и, как полагают, является результатом расположения хромосом в анафазе, устанавливаемом в предшествующем митозе. У S. cerevisiae, образование кластера центромер не обязательно для прохождения через анафазу и теломеры не строго расположены на противоположных полюсах SPB; из-за этих различий конфигурация хромосом в интерфазе у дрожжей была названа Rabl-подобной (Jin et al., 2000). В соответствии с Rabl конфигурацией субтеломеры малых плеч (<~300 kb) от разных хромосом обнаруживаются в более тесной близи, чем субтеломеры плеч разных размеров (Jin et al., 2000; Bystricky et al., 2005; Schober et al., 2008; Therizols et al., 2010). Кроме того, наблюдение, что противоположные концы хромосом более близки пространственно, чем концы разных хромосом (at least for arms up to 435 kb) согласуется с конфигурацией розетки, в которой центромеры имеют предельное расстояние др. от др. (Fig. 1; Therizols et al., 2010).
Ничего не значит однако, что конфигурация Rabl обычно не обнаруживается в клетках человека, существуют др. точки ядерного закрепления. Напр., ядрышко взаимодействует со многими специфическими доменами хроматина в хромосомах человека (Nemeth et al., 2010; van Koningsbruggen et al., 2010). Было предположено, что эти регионы прикрепления могут играть сходную роль в становлении поляризованных хромосомных конфигураций (van Koningsbruggen et al., 2010).
Chromosome configuration: between centromeres and telomeres.
У эукариот ДНК оборачивается вокруг нуклеосом размером ~10 nm. Как и происходит ли дальнейшая компакция в хроматиновые волокна 30-nm in vivo is известно плохо. У дрожжей некоторая информация о компакции хроматина получена в FISH экспериментах, где пространственные расстояния были измерены между локусами, расположенными с разными геномными интервалами вдоль хромосом (Guacci et al., 1994; Bystricky et al., 2004). Путем подгонки полугибкой полимерной модели к этим расстояниям, были определены компакция и персистирующие длины в 110-150 bp/nm (7-10 нуклеосом на 11 nm) и 170-220 nm, соотв. (Bystricky et al., 2004). Хотя эти значения компакции согласуются с каноническим 30-nm волокном, недавний повторный анализ измерений in vivo в комбинации с 3C данными для хромосомы 3 показал наличие более рыхлой структуры с ~1.2-3.6 нуклеосомами на 11 nm (Dekker, 2008). Такое непостоянство может быть объяснено гистоновыми модификациями и вариациями в длине линкерной ДНК между последовательными нуклеосомами, которые , как ожидается, будут модулировать расположение нуклеосом и компактность хроматина (Routh et al., 2008). Напр., количество молекул Hho1, гистона H1 у дрожжей, низкое и изменчивое и подсчитывается как ~1/37 нуклеосом до 1/4 нуклеосом (Freidkin and Katcoff, 2001; Downs et al., 2003).
Помимо мелкомасштабного расположения хроматина, что представляют собой высшего порядка структуры хромосом? Исследования по окрашиванию хромосом во многих системах метазоа показали, что индивидуальные хромосомы занимают определенные, неперекрывающиеся субъядерные регионы, названные хромосомными территориями (Cremer and Cremer, 2001; Branco and Pombo, 2006), но у дрожжей относительная диспозиция и внутренняя организация потенциальных хромосомных территорий всё ещё в основном неизвестны. У гибридов между двумя видами Saccharomyces-S. cerevisiae и S. paradoxus, чьи геномы отличаются на 8-20%-при гибридизации in situ с зондами, позволяющими отличать видовую принадлежность хромосом, выявлено два неперекрывающихся набора хромосом, это подтверждает существование хромосомных территорий в ядрах дрожжей (Lorenz et al., 2002; Liti et al., 2009). Напротив, эксперименты, базирующиеся на рекомбинации после индукции разрывов двойной нити (double-strand break (DSB)) между последовательностями, вставляемыми в разные позиции генома, показали отсутствие территориальности (Haber and Leung, 1996). В данном исследовании сходные скорости рекомбинации были получены независимо от позиции разрыва. Напротив, геномный 3C подтвердил существование хромосомных доменов и хромосомных территорий у почкующихся дрожжей (Duan et al., 2010). Получение картин, в которых позиции некоторых локусов были картированы с высоким разрешением в 2D системе координат, может быть
использовано для дополнительных предсказаний об организации хромосом (Berger et al., 2008). Эти карты предоставили строгое статистическое заключение, что большинство локусов в "генных территориях" и показали, что локусы во внутренних позициях вдоль разных хромосом были ближе к SPB на небольших геномных расстояниях от центромеры и ближе к ядрышку на значительных геномных расстояниях (Berger et al., 2008). Дальнейшее подтверждение близкой связи между пространственным позиционированием и геномной локализацией получены при наблюдениях с помощью
этого метода угловой позиции к ядерной периферии 12 субтеломер. Угол, определяемый между субтеломерой и осью, соединяющей центры ядра и ядрышка, увеличивается как функция длины хромосомного плеча (Fig. 1; Therizols et al., 2010). Т.о., концы коротких хромосомных плеч не могут разведывать всю ядерную периферию, а ограничены небольшой областью, противостоящей ядрышку, наблюдение согласуется с высокой частотой взаимодействий, обнаруживаемых между короткими хромосомными плечами (Duan et al., 2010; Therizols et al., 2010). Сходным образом, наблюдение, что концы длинных плеч распространяются прочь от SPB согласуется с менее частыми взаимодействиями, наблюдаемыми между длинными хромосомами и и любыми другими хромосомами (за исключением плеч длинных хромосом 12R и 4R; Duan et al., 2010; Therizols et al., 2010). Эти данные подтверждают модель, согласно которой крупномасштабные конфигурации хромосом диктуются длиной последовательности, расположение, которое, по-видимому, согласуется с общим поведением, ожидаемым для полужесткого полимера (Rosa and Everaers, 2008).
Трудно примирить это кажущееся разделение между короткими и длинными хромосомными плечами после находки, что пять семейств генов transfer RNA (tRNA) (каждое содержит 9-14 разных членов), рассеяны по геному, формируют кластеры вблизи ядрышка (Thompson et al., 2003). Образование таких кластеров д. с определенностью предполагать существенные ограничения 3D организации хромосом. Однако, анализ образования иерархических кластеров на межхромосомных контактах, определяемых с помощью 3C, выявляет два кластера колокализованных tRNA генов: один вблизи рДНК и один образует кластер с центромерами (Duan et al., 2010). Было бы интересно установить, будут ли идентифицированные tRNAs в ядрышке предпочтительно находиться вблизи концов длинных плеч хромосом, это бы согласовалось с ожиданием, что пространственная близость ядрышка требует крупных геномных расстояний от центромер (Therizols et al., 2010). Тот факт, что образование кластеров tRNA в ядрышке персистирует в отсутствие микротрубочек ещё больше подтверждает, что оно не зависит от образования кластера центромер, это согласуется с наблюдением, что относительные позиции субтеломер длинных плеч не затрагиваются дефектами в прикреплении микротрубочек (Haeusler et al., 2008; Therizols et al., 2010). Сходным образом недавняя идентификация в промоторах многих генов "gene recruitment sequences" , которые достаточны для обеспечения физических взаимодействий с NPCs и могут накладывать др. важные ограничения на конфигурацию хромосом (Ahmed et al., 2010). Было бы особенно интересно точное определение позиций рекрутирующих последовательностей генов в ядерном пространстве, чтобы понять, как они могут участвовать в определенных конфигурациях хромосом.
The special rDNA array on chromosome 12 and the nucleolus.
У
S. cerevisiae, в отличие от др. дрожжей и большинства др. видов, тандемное расположение генов, кодирующих рибосомальные субъединицы (rDNA), ограничивается одиночным геномным локусом на правом плече хромосомы 12 (12R). В нормальных условиях, ядрышко
S. cerevisiae занимает приблизительно одну треть объёма ядра на полюсе клетки, противоположном SPB (Yang et al., 1989; Leger-Silvestre et al., 1999). Исследования многих организмов, включая дрожжи, установили, что ядрышко собирается в месте синтеза рибосомальной РНК (rRNA) , это указывает на то, что ядрышко происходит из rDNA путем самоорганизации (for reviews see Misteli, 2001; Hernandez-Verdun, 2006). Метод иммунопреципитации хроматина с белком внутренней ядерной мембраны Heh1 (oили Src1) выявил обогащение rDNA повторяющимися последовательностями и субтеломерами (Grund et al., 2008; Mekhail et al., 2008). Выявленная ассоциация rDNA с ядерной оболочкой была предложена в качестве способа ограничения рекомбинации между массивами путем секвестрирования rDNA повторов отдаляя её от аппарата рекомбинации (Mekhail et al., 2008). Фактически, rDNA временно расширяет границы своего распространения за пределы ядрышка для репарации, когда DSB индуцируются в этих массивах (Torres-Rosell et al., 2007). Получение картин ~20 non-rDNA локусов показало, что все они были исключены из объема ядрышка и что редукция этого объяма позволяет субтеломерам длинных плеч хромосом занимать крупное нуклеоплазматическое пространство (Berger et al., 2008; Therizols et al., 2010). В случае плеча 12R, дистальная часть, от теломеры до rDNA, как было установлено, появляется из внутрь обращенного лица ядрышка (Fuchs and Loidl, 2004). Недавние 3C данные также показали драматическую нехватку взаимодействий между ДНК последовательностями, расположенными на противоположных сторонах rDNA (Duan et al., 2010). Ядрышко, т.о., по-видимому, играет центральную роль в пространственной организации генома путем секвестрирования повторяющихся массивов вдали от остального генома.
Chromosomes in motion.
3C техника, FISH или получение статичных картин с живых клеток представляют снимок вида хромосом, который не учитывает динамичной природы хроматина. Первые доказательства перемещений хроматина в интерфазных ядрах дрожжей получены в пионерских исследованиях с использованием отслеживания GFP-нагруженных локусов
in vivo в течение 150-600 сек (Robinett et al., 1996; Marshall et al., 1997; Heun et al., 2001). Эти исследования использовали анализ mean square displacement (MSD), стандартный инструмент для характеристики природы и количественных свойств стохастических движений из траекторий частиц. Для нормальной диффузии, такого случайного (Броуновское) движения малых частиц в жидкости MSD должно быть пропорциональным временному интервалу, а коэффициент пропорциональности представляет коэффициент диффузии (within a scaling factor). Предполагая нормальную диффузию, эти инициальные исследования использовали измерения MSD в небольших временных интервалах, чтобы подсчитать коэффициенты диффузии в пределах от 0.5 до ~3 х 10
-3 µm2/s, в зависимости от локуса, при этом субтеломеры и центромеры обнаруживали более медленную диффузию, чем более внутренние локусы. Поскольку хроматин ограничен объёмом ядра, то MSD не может расти бесконечно как функция времени и должно быть плато на значениях слегка меньших, чем квадрат радиуса ядра. Измеренные кривые MSD, в самом деле, достигали плато, на более низких значениях, это указывало на то, что локусы хроматина ограничены регионами более маленькими, чем само ядро. Величины радиусов, подсчитанные из этих плато находились в пределах от 0.3 до ~0.7 µm, при этом субтеломеры и центромеры казались более ограниченными, чем внутренние локусы (Marshall et al., 1997; Heun et al., 2001; Bystricky et al., 2005). Не удивительно, ограничение перемещений центромер частично объяснялось прикреплением к микротрубочкам, поскольку центромеры оказывались менее ограниченными, если микротрубочки оказывались деполимеризованными (Marshall et al., 1997; Heun et al., 2001; Bystricky et al., 2005). При более недавнем анализе динамики локуса GAL1 при более коротких временных промежутках (менее 60 сек) были охарактеризованы с помощью MSD кривой, пропорциональной временному интервалу раной ~0.4 (вместо 1 при Броуновском движении), это указывает на subdiffusive движения. Такое поведение наблюдалось независимо от статуса транскрипции гена (Cabal et al., 2006). Интересно, что субдиффузия со сходной степенью зависимости недавно описана для бактериальных локусов (Weber et al., 2010), это указывает на то, что лежащий в основе механизм является общим. Кажется очевидным, что движения, описанные ранее как с ограниченной диффузией, могут фактически могут также подчиняться subdiffusive поведению при сходных временных шкалах. Субдиффузия может возникать как результат нескольких физических эффектов, включая тесноту в ядре, экранирование, вязкоэластичность нуклеоплазмы или полимерные эффекты, вызываемые динамическими свойствами хроматиновых волокон. Недавние теоретические исследования предположили, что наблюдаемая субдиффузия базируется на физике полимеров скорее, чем тесноте или экранировании (Rosa and Everaers, 2008; Weber et al., 2010). Несмотря на эти в общем то subdiffusive движения, наблюдаются случайные резкие (~0.5 µm) и быстрые (~10 s) скачки (Heun et al., 2001). Поскольку они зависели от АТФ, то эти внезапные движения, по-видимому, подкреплялись активными механизмами скорее, чем пассивной субдиффузией (Heun et al., 2001). Механизмы потенциальных активных движений не известны у дрожжей, но в клетках млекопитающих ядерный актин и миозиновые моторы, как было установлено, играют роль в движениях, которые сопровождают активацию транскрипции (Chuang et al., 2006; Dundr et al., 2007). Кроме того, возможно, что механическое купирование между цитоскелетом и хромосомами, недавно обнаруженное при мейозе, может быть также применимо к митотическому циклу и это предоставляет силу, которая возникает вне ядра, чтобы перемещать интерфазные хромосомы (King et al., 2008; Koszul et al., 2008). Дальнейшая информация о природе и механизмах динамики хроматина, скорее всего, результат использования недавних успехов в высокоскоростной и высоко разрешающей микроскопии в комбинации с теоретическим моделированием (Manley et al., 2008; Hajjoul et al., 2009; Wombacher et al., 2010).
Functional relevance of chromosome organization
Хромосомная организация и метаболизм ДНК сцеплены, поскольку изменения этой организации часто ассоциированы с пертурбациями репликации, транскрипции или репарации ДНК. Мы остановимся на двух последних функциях. См. недавний обзор по репликации Raghuraman and Brewer (2010).
Chromosome configuration and transcription.
Репрессия pol II транскрипции часто происходит в генах вблизи концов хромосом, это, как обсуждалось выше, преимущественно обнаруживается на периферии ядра. Напр., кассеты HML и HMR, которые необходимы S. cerevisiae для переключения типов спаривания, обе являются субтеломерными и должны замалчиваться для поддержания характеристик клеточного типа; pol II-управляемые репортеры вблизи теломер с или без некоторых субтеломерных элементов, обычно обнаруживают мозаичную экспрессию (Gottschling et al., 1990; Renauld et al., 1993; Pryde and Louis, 1999; Bi, 2002; Halme et al., 2004). Мнение, что регион, близкий к ядерной оболочке является ключевым игроком в репрессии pol II транскрипции, далее был подкреплен наблюдением, что искусственное удержание на периферии ядра локуса, локуса обычно лишенного способности к молчанию, облегчает репрессию его транскрипции. Этот эффект родственен обогащению периферии ядра молчащими Sir белками, которые кроме того присутствуют в ядре в ограниченных количествах
(Fig. 2; Maillet et al., 1996; Andrulis et al., 1998).
Чтобы понять, ограничено ли молчание ядерной оболочкой, были исследованы ситуации, в которых отправка на периферию и экспрессия оказывались не связанными. Если кольцевая ДНК, содержащая HMR кассету замалчивания типа спаривания, вырезалась из хромосомы и её позиция отслеживалась в ядрах ku70 или esc1 мутантов, у которых нарушено закрепление теломер, то транскрипционная репрессия HMR всё ещё происходила в нуклеоплазме вдали от периферии, так долго, пока присутствовали белки замалчивания (Gartenberg et al., 2004). Более того, некоторые укороченные субтеломеры могут обнаруживаться молчащими внутри ядра, а некоторые нативные субтеломеры, несмотря на их переферическое положение, могут быть транскрипционно активными (Enomoto and Berman, 1998; Pryde and Louis, 1999; Tham et al., 2001; Mondoux et al., 2007). Т.о., хотя и сохраняются общие репрессивные условия для pol II транскрипции, ядерная периферия в некоторых случаях, по-видимому, пермиссивна для экспрессии. Сходным образом, у млекопитающих позиция вблизи края ядра может влиять на экспрессию некоторых, но не всех генов (Finlan et al., 2008; Guelen et al., 2008; Kumaran and Spector, 2008).
Фактически среда, способствующая активации транскрипции, предоставляется с помощью ключевых составляющих ядерной оболочки, а именно NPC. Некоторые индуцибельные гены, включая GAL1-10, GAL2, INO1, HSP104 и HKX1 перемещаются из нуклеоплазмы к NPC, когда активируются (Brickner and Walter, 2004; Cabal et al., 2006; Dieppois et al., 2006; Schmid et al., 2006; Taddei et al., 2006). В соответствии с этими наблюдениями, анализ иммунопреципитации хроматина показал взаимодействие между компонентами NPC и субнабором высоко транскрибируемых генов (Casolari et al., 2004; Luthra et al., 2007). И снова, транскрипция и позиционирование могут быть не связаны, поскольку мутации SAGA комплекса гистоновой ацетилтрансферазы устраняют околоядерное расположение, не влияя на транскрипцию, а rpb1-1 мутантная самая крупная RNA pol II субъединица всё ещё рекрутирует GAL1 или INO1 гены к NPC. Эти данные также указывают на то, что направление на периферию вызывается сигналами, регулирующими активацию транскрипции скорее, чем транскрипция сама по себе (Cabal et al., 2006; Dieppois et al., 2006; Schmid et al., 2006; Brickner et al., 2007).
Регион, ближайший к ядерной оболочке т.о., выгляди мозаичным, вблизи NPCs оказываются зоны, благоприятные для транскрипции, тогда как зоны между NPCs являются скорее репрессивными. Можно также предположить, что у дрожжей, как это было описано недавно для клеток Drosophila, nucleoporins, присутствующие в глубине ядра могут связывать хроматин и регулирвать экспрессию генов без необходимости позиционирования хроматина на периферии или непосредственных физических взаимодействий с NPCs (Capelson et al., 2010).
Наблюдаемые перемещения индуцибельных генов после активации ставит несколько вопросов. Каковы механизмы, вызывающие эти перемещения? Используют ли они молекулярные моторы или они являются результатом деконденсации хроматиновых волокон? Затрагиваются ли соседние гены? Хотя механизм инициации этих перемещений хроматина всё ещё неизвестен, очень вероятно, что изменения конформации хромосом стабилизированы и поддерживаются с помощью взаимодействия с белками ядерной оболочки, такими как компоненты NPC. Фактически, как было установлено, для INO1 и GAL1, что взаимодействия этих генов с NPC регулируются во время клеточного цикла; взаимодействие с NPC теряется во время S фазы из-за Cdk1-зависимого фосфорилирования Nup1 (Brickner and Brickner, 2010). Более того, связь между позиционированием в ядре и изменениями конформации хроматина выявлена в исследовании индуцибельных генов, таких как GAL1. После активации 3' и 5' концов этот ген взаимодействует, формируя петлю хроматина. Эта петля необходима для быстрой повторной экспрессии гена после периода репрессии, тем самым приобретается транскрипционная память, которая сохраняется в течении нескольких генераций (Brickner et al., 2007; Laine et al., 2009; Tan-Wong et al., 2009; Light et al., 2010). Возможным объяснением этого является то. что эти петли могут создавать структуры, которые способствуют рекрутированию или повторному использованию аппарата транскрипции у NPC, даже при том, что pol II до сих пор ещё не обнаружена на NPCs.
Chromosome configuration and DNA repair.
Как конфигурация хромосом влияет на репарацию ДНК? ДНК постоянно оказывается поврежденной из-за индукции их светом или оксидативными стрессами или как результат остановки репликативной вилки. Большинство вредных форм повреждений ДНК составляют разрывы двойной нити ДНК (DSB). В гаплоидных дрожжевых клетках, DSBs могут быть репарированы с помощью гомологичной рекомбинации или между сестринскими хромосомами, когда геном реплицируется, или с помощью эктопических неаллельных гомологичных и часто повторяющихся регионов. Др. механизмом репарации DSBs является соединение негомологичных концов, при котором разорванные концы ДНК соединяются по-новому. Последний процесс используется преимущественно во время G1, но более склонен к ошибкам (Krogh and Symington, 2004).
Поскольку репарация ДНК нуждается в физическом контакте между разорванными концами или гомологичными регионами, можно ожидать, что неслучайная организации хромосом в интерфазе будет отражать варьирующую эффективность репарации. В самом деле, низкая эффективность репарации между пространственно удаленными регионами наблюдается в ядрах млекопитающих (Parada et al., 2002). Сходный результат ожидается у дрожжей, исходя из недавней работы по организации хромосом дрожжей (Duan et al., 2010; Therizols et al., 2010). Связь между позиционированием хромосом на периферии ядра и стабильностью генома установлена недавно (Fig. 2; Therizols et al., 2006; Nagai et al., 2008; Kalocsay et al., 2009; Oza et al., 2009; Schober et al., 2009). Впервые наблюдалось, что DSB, вызванные с помощью I-SceI endonuclease в субтеломере 11L нуждаются во взаимодействии с субкомплексом nucleoporin Nup84 для эффективной репарации (Therizols et al., 2006). Более того, персистирующие DSB , индуцированные в маленьком плече хромосомы 3R с помощью HO эндонуклеазы (в отсутствие кассет HM гомологов) мигрируют к и остаются на периферии ядра с помощью процесса, который нуждается в checkpoint белке Mec1 (ATR у человека) и белке ядерной оболочки Mps3 (Nagai et al., 2008; Kalocsay et al., 2009; Oza et al., 2009; Schober et al., 2009). Специфические хроматиновые метки, кроме того, вступают в игру поскольку необходим sumoylated вариант гистона H2AZ для перемещения персистирующего разрыва (Kalocsay et al., 2009).
Концы хромосом также подчеркивают роль, выполняемую архитектурой хромосом в рекомбинации. Рекомбинация может происходить в субтеломерах, но не теломерах (Louis et al., 1994). Репрессия гомологичной рекомбинации в теломерах обеспечивается yKu и стержневой X последовательностью с помощью механизма, который не нуждается в закреплении на периферии ядра или молчании (Stavenhagen and Zakian, 1998; Marvin et al., 2009). Было предположено, что теломеры укладываются обратно на самих себя, создавая структуру петли, которая предупреждает рекомбинацию (Stavenhagen and Zakian, 1998; Marvin et al., 2009). Это согласуется с наблюдением, что хромосомные концы редко ассоциируют др. с др. и что взаимодействия между теломерами по большей части преходящие (Therizols et al., 2010).
Репарация разорванных концов ставит несколько вопросов. Какие силы лежат в основе наблюдаемого перемещения на периферию? Могут ли модификации хроматина, такие как H2AZ sumoylation или H2A фосфорилирование инициировать перемещения хроматина, заканчивающиеся отлавливанием с помощью nucleoporins или Mps3? Могут ли разорванные концы оставаться в тесной близи, как в клетках млекопитающих, в которых меченные DSB остаются неподвижными, по крайней мере, в течение 24 ч (Soutoglou et al., 2007)? Или такие концы могут свободно диффундировать в нуклеоплазме, чтобы найти потенциальные гомологичные регионы, что также наблюдалось в клетках млекопитающих (Aten et al., 2004)? В последнем случае поврежденные хромосомные локусы д. путешествовать по ядру в направлении центра репарации.
Nuclear foci versus chromatin interactions.
Важным аспектом ядерной организации является возможное существование предпочтительных взаимодействий между специфическими регионами хроматина или между белками, связанными с хроматином. Эти свойства привлекательны в функциональном отношении, поскольку они могут предложить способ увеличения локальной концентрации функциональных белков и предупреждения нежелательного действия этих белков где-либо ещё в ядре. Визуализация регионов хроматина с помощью световой микроскопии не позволяет определять прямые взаимодействия, но, учитывая ограниченные ресурсы микроскопии, только их пространственную близость. Меченные регионы, локализованные внутри границ разрешения, ведут к появлению агрегатов. часто наз. "nuclear foci." Примером ядерного фокуса у дрожжей является открытие, что два, во всем остальном пространственно отличающиеся локуса на разных хромосомах колокализуются, чтобы сформировать фокус с белками аппарата репарации после индукции DSB в этих двух сайтах (Lisby et al., 2003). Эти фокусы репарации могут облегчать воссоединение разорванных концов и снижать аберрантное или незаконное воссоединение. Сходным образом, концентрация дрожжевых белков молчания на периферии ядра может предупреждать нежелательную репрессию др. частей генома, действуя тем самым как генетический контрольный механизм (Gartenberg et al., 2004).
Хорошо изученные ядерные фокусы у дрожжей получены в результате наблюдения, что Y' субтеломерные последовательности образуют кластеры в 3-8 фокусах на ядерной оболочке (Gotta et al., 1996; Enomoto et al., 1997; Galy et al., 2000; Feuerbach et al., 2002). У многих мутантов с субтеломерным замалчиванием, включая sir3, sir4 или rlf2, транскрипционное состояние репортерных генов вблизи теломер повреждается и окрашивание с помощью теломерного Rap1 оказывается более диффузным, чем в клетках дикого типа (Palladino et al., 1993; Gotta et al., 1996; Enomoto et al., 1997; Mondoux et al., 2007). Однако, ряд субтеломерных фокусов, выявляемых с помощью Y' зонгдов, остается почти неизменным у этих мутантов (Gotta et al., 1996; Enomoto et al., 1997; Mondoux et al., 2007). Эти наблюдения указывают на то, что субтеломерных хроматин может быть поражен без пертурбаций Y'-меченных субтеломерных фокусов, и предполагается, что факторы, необходимые для ассоциации Y' отличны от факторов замалчивания генов, соседних с теломерами. Что же тогда заставляет Y' последовательности образовывать кластер, видимый при FISH? Отражают ли эти кластеры действительные физические взаимодействия? Если это так, то белки, участвующие в сборке нуклеосом, являются кандидатами на роль обеспечения взаимодействий между субтеломерами (Miele et al., 2009). Напротив, мы задаемся вопросом, будут ли возникать FISH фокусы в отсутствие каких-либо взаимодействий между теломерными последовательностями. Поскольку дрожжевые ядра имеют радиус только ~1 µm , а разрешение обычной световой микроскопии обычно ограничено ~200 nm латерально и ~500 nm или более аксиально, то флюоресцентные сигналы от двух разных Y' последовательностей часто могут перекрываться и выглядеть как одиночная точка или кластер даже в отсутствие действительных взаимодействий. Чтобы проверить это, мы модулировали микроскопические широкого поля картины 32 флюоресцентных теломер, расположенных случайно и независимо одна от др. в ядре. Теломеры оказывались расположенными на периферии ядра и исключались из ядрышка, как наблюдалось и раньше (Therizols et al., 2010). Моделеируемые картины обнаруживали относительно небольшое количество широких флюоресцентных пятен, напоминавших Y' FISH фокусы, это указывало на то, что взаимодействия могут быть не нужны для объяснения этих наблюдений (Fig. 3, left, top). Если 32 смодулированные теломеры расположены случайно во внутренности ядра скорее чем позиционированы только на периферии ядра, то количество фокусов д. увеличиваться существенно, подразумевая меньшее среднее число теломер на фокус (Fig. 3, left, bottom). Это можно сравнить с наблюдением, что Y' фокусы более дисперсные и многочисленные у мутантов, таких как Δku70, где теломеры, прикрепленные к ядерной оболочке, искажены (Laroche et al., 1998). Увеличение числа фокусов также предсказуемо для теломер в более крупных ядрах (not depicted). Следовательно, наблюдение меньшего числа ядерных фокусов, чем индивидуальных локусов может возникать как следствие ограниченного разрешения картин и уединения в ядерных территориях, в данном случае на периферии ядра. Физические взаимодействия между такими локусами тем не менее могут существовать, но не обязательно их призывать для объяснения визуализации ядерных фокусов при обычной микроскопии. Длительно осуществляемые взаимодействия могут быть также необходимы для объяснения функций, подобных репарации или замалчиванию, которые могут быть инициированы преходящими взаимодействиями.
Conclusions
Budding yeast has been useful as a model system to understand many aspects of 3D chromosomal architecture, chromosome dynamics, and functional compartmentalization. Yet, many open questions remain, especially regarding the links between spatial chromosome organization and DNA-related processes. Given the implications for fundamental genome functions, a major objective is obviously to identify or better characterize the principles that drive nonrandom chromosome organization.
We would like to distinguish two types of organizing principles. Specific processes depend on the chemical identity of molecules involved in biochemical or genetic interactions, whereas generic principles do not depend on the exact compound, but on more general physical laws. For example, a specific mechanism is the tethering of chromosome ends to the nuclear envelope through the Ku/Sir/Mps3 protein pathways (Gotta et al., 1996; Laroche et al., 1998; Bupp et al., 2007) or the nucleolar clustering of tRNA genes (Thompson et al., 2003). These examples indicate sequence-specific interactions of loci with each other and a nuclear landmark, with potentially dramatic consequences on nuclear organization. Identifying such specific processes requires nailing down their molecular determinants in wild-type and mutant contexts. Generic processes include self-organization by macromolecular crowding, an attractive scenario to explain the existence of protein-based nuclear compartments, and polymer effects (Munkel and Langowski, 1998; Misteli, 2001; Rosa and Everaers, 2008). Polymer physics makes simple and robust predictions about chromosome configuration: for a given chromatin compaction and persistence length, the mean distance between the extremities of chromosomes containing a longer DNA sequence is predicted to be larger than for chromosomes with less DNA (Gehlen et al., 2006). In contrast, if chromosome configuration is mainly constrained by sequence- or nuclear landmark–specific interactions such as reported for tRNA, then such a simple relationship is expected to break down (Thompson et al., 2003). Our high-throughput subtelomere position analysis fits qualitatively with the simple prediction from polymer physics, as the ends of short arm chromosomes are closer to the SPB than the ends of longer chromosome arms (Therizols et al., 2010). The Rabl-like configuration can thus be understood as a result of the mitotic spindle forces and the basic properties of polymers. These simple effects can account for the nonrandom organization of chromosomes in the nucleus, reflected by differences in subnuclear territories of chromosome ends, despite stochastic motions of the chromatin. Such exclusively generic principles may give rise to features that do not necessarily require specific interactions, such as the apparent clustering of simulated independent telomeres. These considerations do not rule out specific interactions because fundamental DNA processes may be initiated by transient contacts that are the result of random dynamics. Specific interactions are also clearly involved in previously identified alterations of chromosome organization, e.g., in the repositioning of inducible genes upon transcriptional activation (Cabal et al., 2006; Berger et al., 2008; Brickner and Brickner, 2010).
Despite impressive recent advances in microscopy, genetics, and genomic technologies, further improvements in the resolution of imaging techniques and 3C-based maps of genomic contacts will likely be required to dissect the processes driving chromosome configuration at all scales. Although 3C methods can provide genome-wide interaction frequencies, these are averaged over large populations of fixed cells. Distinguishing between interactions that occur at high probability in a small fraction of cells from those occurring at a low probability in a large majority of cells, and determining which interactions occur in the same cells, is difficult, if not impossible. Imaging, in contrast, allows tracking locus positions in individual live cells and can be scaled up to analyze position distributions in populations of thousands of cells, but is limited to a small number of loci per experiment. Thus, these very different techniques should be used in combination to determine chromosome configuration and dynamics, and their variability within cell populations. In addition, further development of physics-based models and analysis techniques will be important to make full use of these data and to better understand the mechanisms underlying nuclear organization.
Understanding nuclear organization will be essential to address how nuclear processes are controlled and, potentially, how they evolved. In budding yeast, chromosome ends are spatially confined in a region that appears as a mosaic of repressive and permissive compartments for transcriptional regulation. Evolution may have taken advantage of this 3D organization by moving the genes that need to be switched on or off near chromosome ends. Consistent with this hypothesis, genes present in subtelomeric regions are often involved in adaptation of yeast to environmental changes (Halme et al., 2004; Fabre et al., 2005). More generally, it would be interesting to determine whether families of homologous genes found at genomic positions predicted to share a common nuclear space also share common transcriptional regulation.
The nucleus is a crowded environment of macromolecules and chromatin, and yet order exists. This is probably dictated in part by simple physical constraints, allowing nuclear functions to be harmoniously performed and conserved during evolution.
Сайт создан в системе
uCoz
