Хроматин возможно наиболее сложный молекулярный ансамбль клетки. Он состоит из геномной ДНК вместе со всеми прямо или косвенно ассоциированными молекулами белка и РНК. Сюда входят гистоны, DNA-binding factors (DBFs), базовый аппарат транскрипции и синтезируемые транскрипты, устройства репликации и репарации, которые копируют и поддерживают ДНК и многие др. молекулы, которые взаимодействуют с любым из этих компонентов. Все эти компоненты работают во взаимодействии и не могут быть поняты целиком, несмотря на то, что изучаются в их полной взаимосвязи.

В последнее десятилетие разработаны новые мощные базирующиеся на геномике техники, которые существенно расширили нашу способность осуществлять измерения в хроматине. Эти новые методы позволяют нам понять сложность хроматина более эффективно и мы теперь начинаем видеть первые проблески 'большой картины' хроматина. Выявляются основные глобальные принципы, некоторые из которых могут отличаться от принятых ранее. Здесь эти принципы (суммированы в Box 1) будут рассмотрены. Мы хотим сконцентрироваться на двух генеральных аспектах хроматина: структуре и составе. Во-первых, мы рассмотрим пространственную упаковку хроматиновых волокон внутри ядра, в масштабе от ~1 kb до нескольких megabases. Среди прочего мы пересмотрим широко распространенную дихотомию 'компактного' гетерохроматина в противовес 'открытому' эухроматину, чрезвычайно упрощенную модель, которая может оказаться в основном неправильной. Во-вторых, мы рассмотрим протеом хроматина и сравним основные типы хроматина, определяемые по локальному составу белков. Будут обсуждены характеристики и биологические функции этих типов хроматина. Наконец, будет представлена модель, как хроматин может привлекать транскрипционные факторы на специфические гены помимо основной роли доступности хроматина.

Box 1 Principles of chromatin organization

I Three-dimensional architecture
Architecture is driven by a combination of polymer biophysics and biochemical interactions. Most DNA is in a beads-on-a-string configuration with varying degrees of poorly understood local compaction. There are many long-range contacts between genomic loci, but most of these contacts are transient. Tethering to landmark structures contributes to the overall folding of chromosomes.

II Chromatin composition
Chromatin harbours thousands of proteins and dozens of histone marks. Distinct combinations of proteins and histone marks form a limited number of chromatin types. Some chromatin types mediate gene repression, others are conducive to transcription. Each chromatin type assists the binding of specific DBFs to their cognate DNA motifs. Chromatin structure: polymer physics and specific interactions

По сути хроматин состоит из нуклеосом, которые состоят из ~147 пн ДНК, обвитых вокруг гистонового октамеров. Приблизительно в 20-50 пн линкерная ДНК соединяет нуклеосомы. Эта конфигурация 'бусинок на нитке' может рассматриваться в качестве очень гибкого полимера (Figure 1A), и в значительной степени трехмерная укладка (folding) хроматина управляется принципами физики полимеров (Langowski and Heermann, 2007). Все имеющиеся доказательства указывают на то, что хромосомы не принимают одну воспроизводимую конфигурацию; вместо этого они могут иметь множество разных конфигураций. Тем не менее, физика полимеров накладывает некоторые ограничения на возможную архитектуру. Компьютерное моделирование показывает, что некоторые свойства хромосом, такие как агрегация гетерохроматиновых хромоцентров или расхождение хромосом по разным территориям, может быть объяснена базовым поведением полимеров лишь с небольшими добавочными допущениями (Cook and Marenduzzo, 2009; de Nooijer et al, 2009; Bohn and Heermann, 2010). Но др. свойства упаковки хромосом не могут быть объяснены одной только физикой полимеров; напр., на расстояниях более megabase интерфазные хромосомы оказываются более компактными, чем предсказывается компьютерным моделированием простых полимеров (Mateos-Langerak et al, 2009). В самом деле, сегодня ясно, что существуют специфические биохимические механизмы, которые вносят вклад в укладку хроматина. По существу эти механизмы распадаются на три типа: локальное уплотнение, дальнодействующие взаимодействия и закрепление на ядерном каркасе.

Local chromatin compaction

Популярным мнением является то, что нуклеосомные нити являются локально свёрнутыми в кольцо, чтобы сформировать соленоид или др. повторяющуюся структуру с диаметром ~30 nm. Теоретически существует несколько способов, c помощью которых нуклеосомы могут быть уложены, чтобы сформировать такие волокна и получены доказательства для некоторых конфигураций in vitro с использованием чистых полинуклеосом (rev. Fussner et al, 2011). Однако продвинутые ЭМ методы оказались неспособны выявить существенные количества волокон в 30 nm в нефиксированных ядрах или митотических хромосомах (Maeshima et al, 2010; Fussner et al, 2011). Такие волокна могут быть т.о., редкими или ограничены очень специфическими типами клеток.

Существуют, однако, и др. типы локальных уплотнений, которые более распространены: электронные микрографы из большинства ядер обнаруживают четкие участки плотно окрашенного хроматина, а биофизическое фракционирование хроматиновых фрагментов также подкрепляет дифференциальную компакцию (Gilbert et al, 2004). Такая локальная сжатость может не быть в форме регулярного высшего порядка волокна, а вместо этого может состоять из довольно нерегулярных участков агрегированных нуклеосом (Figure 1B). Разнообразие специализированных белков может способствовать подобной сжатости (compaction), таких как линкерные гистоны H1 и Polycomb Group (PcG) белковые комплексы (Francis et al, 2004; Hizume et al, 2005).

Long-range interactions

Второй биохимический механизм, который важен для архитектуры хромосом связан с физическими контактами между двумя элементами последовательностей, которые удалены на линейной хромосоме (Figure 1C). Такие контакты могут быть обнаружены с использованием техники, наз. отлавливание конформации хроматина, для которой сегодня имеется множество производных (rev. Simonis et al, 2007; Fullwood and Ruan, 2009; van Steensel and Dekker, 2010). Использование этой технологии показало, что существует множество физических взаимодействий между энхансерами и промоторами (Hakim et al, 2010). Существуют также частые взаимодействия внутри хромосом на длинные расстояния (свыше ~10 Mb) и даже между локусами разных хромосом, хотя последние не столь многочисленны. Исследования клеток млекопитающих показали, что существует более нескольких тысяч дальнодействующих взаимодействий (Simonis et al, 2006; Fullwood et al, 2009; Lieberman-Aiden et al, 2009). Интересно, что эти взаимодействия обнаруживают глобальный паттерн доменов вдоль хромосом, где области неактивного и активного хроматина каждый предпочтительно взаимодействуют внутри самих себя. Это указывает на то, что хроматин подразделен на два разных компартмента (Simonis et al, 2006; Lieberman-Aiden et al, 2009). Разнообразные белки, как полагают, действует как связующие факторы, которые обеспечивают дальнодействующие взаимодействия, включая инсуляторный белок CTCF, некоторые регуляторы транскрипции, cohesin, polycomb белковые комплексы и др. (Sexton et al, 2009; Hakim et al, 2010).

Важно отметить, что большинство этих дальнодействующих контактов являются частично стохастическими: хотя, как считают, они являются специфическими, большинство из описанных взаимодействий между двумя локусами происходят только в небольшой фракции клеток в какой-нибудь временной отрезок (Simonis et al, 2006; Lieberman-Aiden et al, 2009; Bantignies et al, 2011). Поэтому трудно получить картину того, как такие индивидуальные парные контакты вносят существенный вклад в регуляцию генной активности, за исключением, что короткие контакты, так или иначе, запоминаются, как длительно длящиеся эпигенетические импринты (Bantignies et al, 2003).

Attachments to nuclear landmarks

Третий механизм, который вносит вклад в упаковку хромосом связан с взаимодействиями генома с относительно фиксированными ядерными 'ориентирами', которые могут действовать как места прикрепления (Figure 1D) (reviewed in Deniaud and Bickmore, 2009; Towbin et al, 2009; Kind and van Steensel, 2010; van Steensel and Dekker, 2010). Одним из таких ориентиров является ядерная ламина (nuclear lamina (NL)), которая состоит из полимеров lamin. NL покрывает большую часть внутренней ядерной оболочки, предоставляя огромную площадь поверхности для потенциальных контактов с геномом. В самом деле, исследования по молекулярному картированию показали, что геномы Drosophila, мыши и человека экстенсивно взаимодействуют с NL, посредством так наз. lamina-associated domains (LADs) (Pickersgill et al, 2006; Guelen et al, 2008; Peric-Hupkes et al, 2010; van Bemmel et al, 2010). У млекопитающих имеется ~1300 LADs, которые имеют средний размер примерно в 0.5 Mb. В целом LADs млекопитающих составляют примерно 35-40% генома. LADs обычно имеют четкие границы, которые маркированы специфическими элементами последовательностей, которые включают места соединения для CTCF, CpG островков и промоторов. Большинство генов в LADs транскрипционно молчащие. Это указывает на то, что NL вносит вклад в репрессию генов, это подтверждается c помощью дерепрессии ассоциированных с NL генов у мух, лишенных одного из ламинов (Shevelyov et al, 2009) и c помощью подавления определенных генов, которые искусственно прикрепляются к NL (Finlan et al, 2008; Kumaran and Spector, 2008; Reddy et al, 2008; Dialynas et al, 2010). В соответствии с ролью NL в регуляции генов, наблюдали сотни генов перемещающихся в направлении или от NL во время дифференцировки (Peric-Hupkes et al, 2010). Пока всё ещё неясно, как эти динамические взаимодействия генома с NL обеспечиваются и регулируются.

Nuclear pore complexes (NPCs) также взаимодействуют со специфическими геномными локусами (Liang and Hetzer, 2010). Эти локусы отличаются от LADs, это согласуется с наблюдением, что NPCs преимущественно располагаются в промежутках в NL и поэтому представляют собой самостоятельные микроусловия (Schermelleh et al, 2008). Усилия по геномному картированию у дрожжей, мух и млекопитающих выявили множество генов, которые связываются белками NPC proteins (Casolari et al, 2004; Capelson et al, 2010; Kalverda et al, 2010; Vaquerizas et al, 2010), это показало, что большинство таких белков свободно диффундирует в нуклеоплазме и часто взаимодействует со своими генами мишенями внутри ядра скрее, чем на NPCs (Capelson et al, 2010; Kalverda et al, 2010). Геномное картирование взаимодействий NPC белков необходимо поэтому интерпретировать с осторожностью, т.к. они частично отражают пространственное позиционирование генома относительно ядерной оболочки. Необходимы дальнейшие исследования для выяснения функций и механизмов взаимодействий генома с NPC.

Др. ядерная структура, которая может предоставить относительно фиксированную закрепляющую платформу для генома является ядрышко. Недавнее исследование по картированию идентифицировали множество nucleolus-associated domains (NADs), которые обнаруживают тенденцию становиться крупными доменами и обладают специфическими наборами генов (Nemeth et al, 2010; van Koningsbruggen et al, 2010). Некоторые из NADs могут перекрываться с LADs, указывая тем самым, что имеются геномные регионы, которые обладают альтернативными контактами как с NL , так и ядрышками.

Chromatin accessibility

Часто пространственная конфигурация ДНК ставит под угрозу доступность ДНК, но это другие-хотя иногда родственные-аспекты структуры хроматина. Доступность хроматина лучше всего определяется как доступность последовательностей ДНК для молекулярных взаимодействий, обычно c помощью DBFs. Нуклеосомы являются основными детерминантами локальной доступности ДНК: последовательность ДНК, крепко обернутая вокруг нуклеосомы, с меньшей готовностью связывается с DBF, чем те же самые последовательности участков ДНК, лишенные нуклеосом; в самом деле, эта модель подтверждается рядом экспериментальных данных (Hayes and Wolffe, 1992; Lieb and Clarke, 2005; Rando and Ahmad, 2007). Факторы ремоделирования нуклеосом являются белковыми комплексами, которые меняют позиционирование нуклеосом вдоль ДНК (Maier et al, 2008; Clapier and Cairns, 2009).

Считается, что существуют механизмы, которые контролируют доступность помимо нуклеосом в виде широких регионов хромосом. Теоретически, доступ может быть блокирован c помощью специализированных белков, которые образуют плотный покров вокруг серии нуклеосом. Альтернативно, участок нуклеосом может быть сильно сжат, в результате остается мало пространства для др. белков, чтобы достичь ДНК. Такие механизмы легко себе представить, но подтверждается ли существование такого 'inaccessible heterochromatin' действительно экспериментальными данными?

Доступность хроматина часто измеряется путем открытия доступа в ядра, пермеаблизированные детергентом, эндонуклеаз, таких как DNase I, после чего разрезанные сайты количественно картируются (Weintraub and Groudine, 1976). Идея в том, что частота разрезания пропорциональна доступности ДНК. Однако пермеабилизация вызывает диссоциацию многих белков-из-за нефизиологических буферных условий и простого эффекта разведения -и поэтому д. создавать сильно искаженную картину. Это не означает, что картирование гиперчувствительности к DNase I бесполезно; это мощный метод для идентификации регуляторных элементов в геноме (Hesselberth et al, 2009; Song and Crawford, 2010), но не следует забывать предостережений при интерпретации результатов в терминах доступности хроматина in vivo .

Картирование in vivo метилирования c помощью DNA adenine methyltransferase (Dam) (Gottschling, 1992; Singh and Klar, 1992; Kladde and Simpson, 1994; Wines et al, 1996) не имеет недостатков эндонуклеаз. Dam может экспрессироваться in vivo (т.e. без permeabilization) и это маркирует любой доступный GATC мотив путем добавление небольшой метки метилирования аденина, которая не возникает эндогенно у большинства эукариот. Паттерн метилирования аденина может быть картирован затем c помощью различных методов. Недавний осмотр генома на Dam метилирования в трех тканях Caenorhabditis elegans (Sha et al, 2010) показал, что большая часть генома доступна, лишь приблизительно с двукратной вариацией сигналов Dam метилирования. Большинство из этих вариаций объясняется локальным позиционированием нуклеосом (согласуется с более ранними исследованиям Dam у дрожжей; Kladde and Simpson, 1994), а е эффектами чрезмерного расширения геномных регионов. Тщательно контролируемое исследование у почкующихся дрожжей также выявило менее чем двукратные различия в доступности Dam как между эухроматином, так и репрессивным гетерохроматином, маркированного c помощью белков SIR (Chen and Widom, 2005).

Др. взаимодействующие с ДНК белки также обнаруживали нормальный доступ к репрессированному хроматину. Экзогенно экспрессируемые DBFs , соединяются со своими мотивами распознавания почти с тем же самым сродством в контекстах активного и репрессированного хроматина (Chen and Widom, 2005; Filion et al, 2010), и также некоторые эндогенные факторы, как было установлено, соединяются с промоторами репрессированного хроматина (Chen and Widom, 2005; Gao and Gross, 2008).

Эти результаты в целом согласуются с исследованиями доступности хроматина на микроскопическом уровне, определяемой сравнением скорости диффузии флюоресцентно меченных макромолекул внутри морфологически определяемого гетерохроматина и эухроматина. Эти исследования оказались неспособны выявить существенные различия в доступности для молекул с радиальными размерами до ~10 nm, что соответствует белковым комплексам приблизительно в 1 MDa (Verschure et al, 2003; Gorisch et al, 2005; Pack et al, 2006). Лишь молекулы более крупных размеров, по-видимому, специфически исключаются из гетерохроматиновых регионов (Gorisch et al, 2005). Даже митотические хромосомы, которые сильно компактизированы, оказывались легко доступными для связывания транскрипционных факторов (Chen et al, 2005).

Итак, поскольку стерические помехи для DBFs могут возникать локально на индивидуальных позиционированных нуклеосомах, то вряд ли возможно, что регулируемая доступность посредством изменений в сжатости хроматина составляет основной механизм контроля связывания белков с ДНК. Прежде чем рассмотреть альтернативную модель, которая объяснит, как связывание DBFs может регулироваться, мы должны сначала рассмотреть белковый состав хроматина.

Chromatin proteome

Ядро человека содержит примерно 3 ? 107 нуклеосом, но имеется и множество др. белков хроматина. Для 'полноты картины', необходимо рассмотреть, сколько белковых молекул участвуют в создании хроматина в типичном ядре человека. В качестве верхнего предела мы примем общее количество белковых молекул, присутствующих в ядре. Клетка человека, как полагают, содержит приблизительно 10¹⁰ молекул белка (Lodish et al, 2000), если мы предположим, что 10% из них составляют ядро клетки, то имеется грубо 109 белковых молекул на ядро или приблизительно 1 на 6 пн ДНК и приблизительно 30 на нуклеосому (Figure 2). Конечно не вся ядерные белки являются частью хроматина, но большинство возможно является-если аппарат процессинга РНК ассоциирован с хроматином (Perales and Bentley, 2009; Luco et al, 2011)-то эти подсчеты не могут быть слишком далеки от истины. Большинство транскрипционных факторов присутствует в виде 103-105 молекул на ядро, тогда как некоторые линкерные гистоны и белки групп высокой подвижности (которые, как полагают, модулируют структуру хроматина) почти столь же обильны, как и нуклеосомы (Kuehl et al, 1984; Paull et al, 1996).

Figure 2. How many protein molecules are present in a stretch of chromatin? Computer-simulated model of nucleosomal fibre (60 nucleosomes) without (A), with 5 (B), or with 25 (C) proteins per nucleosome on average. Proteins (grey spheres) were simulated to attach randomly to DNA, histones or to other proteins, the latter yielding simulated protein 'complexes' of various sizes. The model in (C) is most in agreement with estimates of protein molecule numbers inside the nucleus. A 3D rendering movie is available as

Необходимо также рассмотреть разнообразие белков, которые составляют хроматин. Недавнее протеомное исследование с осторожностью идентифицировало более 500 белков, ассоциированных с очищенными метафазными хромосомами человека (Ohta et al, 2010). Интерфазный хроматин, скорее всего, ещё сложнее, поскольку многие белки, как известно, диссоциируют с хроматина во время митозов. Систематические исследования на дрожжах показывают, что приблизительно 1/3 из всех клеточных белков локализована в ядре (Huh et al, 2003). Если экстраполировать это на клетки человека, тогда приблизительно 8000 различных белков являются ядерными и, следовательно, являются кандидатами на участие в хроматине человека. Из них ~1400 каталогизировано как сиквенс-специфические DBFs (Vaquerizas et al, 2009). Итак, разумно предполагать, что хроматин в типичной клетке человека состоит из нескольких тысяч разных белков.

Все эти белки осуществляют свои функции путем образования комплексов с ДНК, РНК и др. белками. Биохимически очищенные хроматиновые белковые комплексы обычно состоят из 5-50 белков. Однако они включают только стабильно взаимодействующие белки; современные подсчёты показывают, что весь интерактом человека может содержать 130 000 взаимодействий (Venkatesan et al, 2009). Итак, в хроматине может быть несколько десятков тысяч разных парных межбелковых взаимодействий, из которых мы сегодня знаем только крохотную часть. Если мы также учтем многие молекулы некодирующих РНК, которые были открыты как часть хроматина (Hung and Chang, 2010; Koziol and Rinn, 2010), то станет ясно, что хроматин невероятно сложная макромолекула.

Principal chromatin types

Мириады хроматиновых белков и возможных взаимодействий между ними делает теоретически возможным, что каждый бит генома связан с разной уникальной комбинацией белков. Эта идея 'комбинаторного кода' была озвучена примерно десять лет назад для гистоновых модификаций, которые сами по себе могут потенциально формировать значительно больше комбинаций, чем общее количество нуклеосом в ядре (Strahl and Allis, 2000).

Систематическое изучение комбинаторной сложности хроматиновых белков недавно было изучено на культивируемых клетках Drosophila (Filion et al, 2010). Используя DamID технологию (van Steensel et al, 2001), был картирован в геноме широкий спектр из 53 белков, представляющих срез известных функциональных классов компонентов хроматина. Были картированы также некоторые гистоновые метки. Интегративный анализ карт из 53 белков показал, что большинство профилей связывания объясняется c помощью пяти принципиальных хроматиновых типов, каждый из которых создает уникальные комбинации белков. Поскольку некоторые белки маркируют только один из этих хроматиновых типов, то многие белки имеют общими от двух до четырех типов. Благодаря греческому слову chroma, означающему 'цвет', пять принципиальных хроматиновых типа были обозначены цветами YELLOW, RED, BLUE, BLACK and GREEN (Figure 3). Как показано ниже, эти пять типов имеют разные и иногда удивительные характеристики.

YELLOW and RED (high-occupancy target) chromatin

Большинство транскрипционно активных генов маркированы YELLOW или RED хроматином. YELLOW хроматин согласуется с нашей общей концепцией активных генов: он обладает компонентами базового аппарата транскрипции, некоторыми DBFs и энзимами, которые контролируют ацетилирование гистонов. Довольно неожиданно сюда входят гистоновые деацетилазы, (HDACs) RPD3 и SIR2-те, которые первоначально считались, как участвующие в репрессии генной активности, но HDACs, как было установлено, присутствуют в большом количестве на активных генах в клетках человека (Wang et al, 2009).

RED хроматин также преимущественно ассоциирует с активными генами. Однако, RED хроматин обладает некоторыми уникальными свойствами, которые отличают его от YELLOW хроматина. Во-первых, он маркирует преимущественно гены, которые тканеспецифичны в противоположность YELLOW хроматину, который обнаруживает строгое предпочтение к повсеместно экспрессируемым генам домашнего хозяйства. Во-вторых, хотя RED и YELLOW гены обнаруживают сходный спектр уровней экспрессии, гены в RED хроматине в основном лишены гистоновой метки H3K36me3, также как и MRG15, chromodomain белка, который связывает H3K36me3 in vitro. Этот отсутствие H3K36me3 является неожиданным, поскольку ранее полагали что это генеральная метка транскрипционной элонгации и выполняет роль по репрессии антисмысловых скрытых промоторов в транскриптомных единицах (Li et al, 2007). Почему отсутствует эта метка в активных генах RED хроматина, неясно.

Третье и наиболее неожиданное свойство RED хроматина является его огромное разнообразие белков. В среднем, регионы, маркированные RED хроматином связывают приблизительно 60% от всех белков, которые были протестированы. Недавнее картирование ~50 дополнительных хроматиновых белков снова обнаруживало сходную фракцию в RED хроматине (BvS lab, неопубликованные результаты). Экстраполяция этих результатов указывает на то, что д. существовать сотни различных белков, которые ассоциируют с каждой RED хроматиновой областью. Многие из этих белков, по-видимому, функционально не связаны: напр., ДНК-связывающие факторы, GAGA фактор, экдизоновый рецептор, MNT и Jun-родственный антиген, все ко-локализуются в red хроматине, пока нет доказательств функциональных взаимоотношений между этими факторами. Горячие точки, по-видимому, ко-локализованые неродственные регуляторные факторы, впервые наблюдались в клетках мух (Moorman et al, 2006), и позднее у эмбрионов Drosophila, в мышиных ES клетка и у C. elegans (Chen et al, 2008; Li et al, 2008; MacArthur et al, 2009; Gerstein et al, 2010; modENCODE Consortium, 2010). Иногда они обозначаются как 'high-occupancy target' (HOT) регионы. Они выявляются с помощью двух независимых техник картирования (ChIP и DamID), исключающих технические погрешности. Интересно, что повторный анализ ранее опубликованных ChIP-chip данных (Harbison et al, 2004) показал, что также геном почкующихся дрожжей обладает горячими точками, которые плотно связаны с помощью разнообразных факторов-эти свойства первоначально были пропущены из-за использования алгоритма нормализации (Harbison et al, 2004), который маскировал многоместные сайты (H Bussemaker, personal communication). Т.о., эквиваленты RED хроматина, по-видимому, существуют у многих видов.

RED/HOT регионы имеют пониженную плотность нуклеосом, более высокий оборот нуклеосом и более высокую концентрацию гистонового варианта H3.3, который связан с вытеснением нуклеосом (Moorman et al, 2006; Filion et al, 2010; modENCODE Consortium, 2010). Можно предположить, что RED регионы легко доступны и поэтому пригодны для связывания многими белками. Однако, как указывалось выше, различия в доступности вдоль генома, по-видимому, оказывают небольшое воздействие на DBFs. Более того, логично противоположное: трудно представить последовательности ДНК высоко доступные (т.e. не связанные с чем-либо) и в то же самое время оккупированные десятками белков. В самом деле, эмпирически установлено, что ДНК-связывающий домен дрожжевого Gal4 не имеет предпочтительного доступа к её связывающему мотиву в RED хроматине клеток мух (Filion et al, 2010). Мы поэтому нуждается в привлечении другого, более специфического механизма. Напр., образование RED хроматина может начинаться с немногих 'пионерских' DBFs, которые соединяются с мотивами из специфических последовательностей, которые в свою очередь рекрутируют др. белки. Множество межбелковых взаимодействий может, т.о., управлять образованием крупных, сложных агрегатов белков. Было установлено, что ДНК-связывающий домен BICOID в основном не существенен для привлечения к горячим точкам (Moorman et al, 2006), это иллюстрирует выдающуюся роль межбелковых взаимодействий при формировании этого трудного типа хроматина.

Что же делает RED/HOT хроматин? Скорее всего, он участвует в контроле своих генов мишеней; вообще-то RED регионы представлены специализированными типами энхансеров. Одной из интересных возможностей является то, что RED регионы могут пространственно формировать кластеры в так наз. транскрипционных факториях, которые являются ядерными фокусами, где РНК полимераза II, различные регуляторные белки и множественные транскрибируемые гены приходят в соприкосновение (Sutherland and Bickmore, 2009; Cook, 2010). Кроме того, RED хроматин реплицируется первым во время S-фазы и обогащен белками комплекса распознавания источника (origin recognition complex proteins) (Filion et al, 2010; modENCODE Consortium, 2010, 21177974), тем самым создается возможность, что RED хроматиновые регионы служат в качестве источников раннего запуска репликации. Учитывая сложность RED хроматина, важной задачей является выявление их функций и молекулярной архитектуры.

BLUE: polycomb chromatin

BLUE хроматин характеризуется присутствием PcG белков и гистоновой метки H3K27me3 (Filion et al, 2010). PcG белки в первую очередь репрессируют транскрипцию и обнаруживают строгое предпочтение к связыванию генов, участвующих в регуляции процессов развития (Muller and Verrijzer, 2009; Morey and Helin, 2010; Sawarkar and Paro, 2010).

BLACK chromatin

Интересен новый тип хроматина BLACK хроматин (Filion et al, 2010). У Drosophila в клетках Kc167 этого типа хроматин покрывает почти половину неповторяющейся части генома. По существу все гены, внедренные в BLACK хроматин транскрипционно молчащие; в целом BLACK хроматин содержит почти две трети всех замалчиваемых генов и т. о., является наиболее преобладающим репрессивным типом хроматина. Анализ данных генной экспрессии в разных тканях показывает, что гены, которые расположены в BLACK хроматине (в Kc167 клетках) в целом экспрессируются лишь в немногих тканях. Т.о., BLACK хроматин, по-видимому, обеспечивает репрессию большого набора тканеспецифических генов. Важно, что репортерный ген, несущий мобильный элемент, скорее всего, будет молчащим, если он интегрируется в BLACK регионы, по сравнению с др. 4 основными типами хроматина (Filion et al, 2010). Это указывает на то, что BLACK хроматин не является пассивным маркером транскрипционно неактивного хроматина, а скорее вносит активный вклад в репрессию транскрипции.

Как достигается эта репрессия пока неясно, получены намеки от горстки белков, которые, как сегодня известно, маркируют BLACK хроматин. Одним из них является линкерным гистоном H1, который, прежде всего, связан с репрессией транскрипции (Woodcock et al, 2006). Другим является Lamin,главный компонент NL, это указывает на то, что BLACK хроматин преимущественно располагается на периферии ядра (Figure 3). Др. BLACK маркерные белки включают AT-hook белок D1, который участвует в упаковке хроматина высокого порядка (Smith and Weiler, 2010), и SuUR, регулятор репликации гетерохроматиновых регионов политенных хромосом (Zhimulev et al, 2003).

Пока не идентифицированы гистоновые метки в BLACK хроматине, которые могли бы объяснить, почему хроматин этого типа оставался незамеченным вплоть до недавнего времени. Однако вполне возможно, что BLACK-специфические гистоновые модификации будут открыты. Напр., EFFETE, сильно консервативный гомолог дрожжевого Ubc4/5, который обладает способностью к убиквитилированию in vitro, связывается вдоль BLACK хроматина, указывая, что один из гистонов может нести специфическую метку для убиквитилирования. Возможно, что дополнительные компоненты BLACK хроматина будут открыты. Ясно, что предстоит ещё много узнать о BLACK хроматине.

GREEN chromatin: HP1 and partners are conducive to transcription

GREEN хроматин специфически маркирован HP1 и SU(VAR)3-9, вместе с некоторыми HP1-ассоциированными белками (HP2 - 6) и гистоновыми модификациями H3K9me2 и H3K9me3 (Greil et al, 2007; Filion et al, 2010; Riddle et al, 2010). Он традиционно обозначается как 'гетерохроматин', но согласно современному знанию лучше бы отказаться от этого термина (see below). GREEN хроматин занимает крупные домены в перицентрических регионах и 'точечную' хромосому 4, все они богаты повторяющимися последовательностями. Кроме того, найдены сотни генов, разбросанные вдоль хромосомных плеч.

HP1 и SU(VAR)3-9 хорошо известны своей способностью репрессировать репортерные гены, которые интегрируются в богатые HP1 регионы (Girton and Johansen, 2008). Парадоксально, некоторые геномные исследования на Drosophila установили, что большинство генов, которые естественным образом связаны с HP1 транскрипционно активны (Greil et al, 2003; de Wit et al, 2007; Johansson et al, 2007; Piacentini et al, 2009; Filion et al, 2010; Riddle et al, 2010). Это согласуется с более ранними наблюдениями индивидуальных активных генов в перицентрическом гетерохроматине (Wakimoto and Hearn, 1990; Clegg et al, 1998). В культивируемых Kc167 клетках, мы нашли, что нокдаун HP1 слегка снижает экспрессию HP1-связанных генов (G Hogan and BvS, неопубл.), и у мух перицентрические гены обнаруживают пониженную активность у HP1 мутантных мух (Lu et al, 2000; Schulze et al, 2005). Т.о., по крайней мере у Drosophila, HP1 является прежде всего скромным активатором своих естественных генов мишеней. Согласно этой новой информации, термин 'heterochromatin' становится несоответствующим, поскольку он традиционно используется для обозначения репрессированного хроматина; термин GREEN хроматин представляет нейтральную альтернативу.

HP1 paradox

Как такое возможно, что HP1 (вместе со своими белками партнёрами) репрессирует определенные репортерные гены, тогда как он ведет к транскрипции огромного большинства своих естественных генов мишеней? Первой важной частью объяснения является обнаружение, что все примеры генов, репрессированных гетерохроматином у Drosophila, были исторически отобраны по репрессивному фенотипу. Напр., из сотен мух, которые были подвергнуты ионизирующей радиации, чтобы индуцировать хромосомные перестройки, редкие из них были выбраны по паттерну мозаичной (variegating) экспрессии (хорошая причина: variegating фенотип удивителен!). При др. стратегии репортерные гены случайно вставлялись в геном, используя мобильные элементы в качестве транспортного средства и опять отбирались мухи с мозаичным фенотипом. С помощью этой стратегии, было открыто около 65 различных генов, которые экспрессировались мозаично, когда включались вблизи центромер, теломер или в 'точечную' хромосому 4 (Tweedie et al, 2009). Это может быть значительным количеством, но мы не должны забывать, что тысячи др. генов не обнаруживают мозаичной экспрессии. Т.о., возможно, что только определенные гены репрессируются, когда помещаются в условия GREEN хроматина? Детальное исследование классической модели position effect variegation (PEV) показало, что это и в самом деле имеет место (Vogel et al, 2009). Мутанты wm4, первоначально открытые благодаря variegation гена белой окраски глаз, обусловлены транслокацией, которая соединяла white и фланкирующие гены с перицентрическим гетерохроматином. Молекулярное картирование показало, что HP1 распространяется через соединение в формально эухроматическую область и покрывает приблизительно 20 генов, включая white. Удивительно, но только экспрессия white редуцирована, тогда как др. гены остаются в основном незатронутыми.

Т.о., по крайней мере, у Drosophila, догма, что HP1 и партнерские белки ингибируют транскрипцию базировалась на бросающиеся в глаза, но не-репрезентативных данных репотерного гена. В настоящее время мы может только предполагать, как эти репортерные гены репрессируются с помощью HP1, поскольку естественные гены мишени не репрессируются. Большинство из генов, которые обнаруживают PEV, будучи подвергнуты действию HP1 являются тканеспецифическими генами, которые стремятся локализоваться в RED хроматине. Поразительно, что GREEN хроматин имеет очень разные белковые составы, чем RED хроматин, хотя оба транскрипционно активны. Более того, GREEN и RED хроматин редко управляют соседями (U Braunschweig, GJ Filion, JG van Bemmel, BvS, неопубл.). Эти наблюдения указывают на то, что RED и GREEN хроматин могут быть несовместимыми. И вполне возможно, что инсерция гена, который обычно находится в RED хроматине, в условия GREEN хроматина может приводить к дестабилизации RED хроматина и как следствие неправильная регуляция гена. Будущие эксперименты д. показать, дает ли эта модель 'несовместимых типов хроматина' хорошее объяснение PEV.

В настоящее время всё ещё неясно, почему специфический набор в несколько сотен активных генов, разбросанных по всему геному мух, связывается HP1 и его партнерами. Гены мишени для HP1 обнаруживают тенденцию быть длинными и богатыми экзонами, возникает возможность, что HP1 необходим, чтобы стимулировать элонгацию транскрипции или регуляцию процессинга РНК. В самом деле, у Drosophila, HP1 взаимодействует с комплексом элонгации FACT (Kwon et al, 2010). Более того, HP1 и партнерские белки могут обладать др. функциями, такими как регуляция времени репликации (Schwaiger et al, 2010).

Other chromatin classifications: Drosophila and other species

Пять принципиальных типов хроматина, которые были идентифицированы в клетках дрозофилы, представляют главные комбинации белков, идентифицированных среди набора из 53 протестированных белков. Возможна дальнейшая очистка этой классификации с помощью более филигранного алгоритма. Однако любая субклассификация этих 5 состояний будет нуждаться в объективных статистических и биологических критериях, чтобы устранить произвольность. Мы недавно установили, что расширение набора карт связывания 50 дополнительными (опять же широко отобранными) белками не открыло дополнительных типов хроматина (JG van Bemmel, GJ Filion, A Rosado, W Talhout, BvS, неопубл.), указывая, что пять типов в самом деле представляют собой принципиальные типы.

Некоторые др. группы недавно представили классификацию хроматиновых состояний, базируясь на больших массивах геномных данных. В этих случаях, наборы данных были в основном ограничены модификациями гистонов. Набор из 18 гистоновых меток в клетках Drosophila давал 9 или 30 комбинаторных состояний в зависимости от используемого алгоритма (Kharchenko et al, 2010). Поскольку эти данные были получены на др. линии клеток (S2 клетки), сравнение с пятью цветами в Kc167 клетках д. интерпретироваться с осторожностью. тем не менее 4 из 9 состояний в S2 клетках напоминали BLACK, GREEN (2 ?) и BLUE ъроматин Kc клеток. Остальные 5 состояний представили собой суб-состояния RED и YELLOW хроматина. Поскольку огромное большинство гистоновых меток ассоциировано с активными генами, то возможен эффект 'увеличительного стекла' на классификацию активного хроматина, что объясняет. почему это исследование (Kharchenko et al, 2010) выявило большее количество активных состояний хроматина, чем исследование, базирующееся на широкой селекции из 53 белков (Filion et al, 2010).

Интересно, что недавнее исследование данного номера EMBO Journal показало, что растение Arabidopsis thaliana может также иметь ограниченное количество принципиальных типов хроматина. Рассмотрение 11 гистоновых меток вместе с метилированием ДНК выявило 4 основных комбинации, которые покрывают большую часть генома (Roudier et al, 2011). Два из этих состояний в первом приближении напоминают GREEN и BLUE типы хроматина, обнаруженные у дрозофилы. Третье состояние, которое в целом лишено каких-либо тестируемых гистоновых меток, может быть эквивалентно BLACK хроматину. Наконец, только один из основных типов транскрипционно активного хроматина найден у Arabidopsis, в отличие от двух самостоятельных состояний у Drosophila.

51 комбинаторное состояние хроматина было идентифицировано а лимфоцитах человека, базируясь на картах из 38 гистоновых меток (Ernst and Kellis, 2010). Это скорее всего избыточная классификация, т.к. некоторые комбинации выглядят очень сходными. Авт. сгруппировали 51 комбинацию в 5 основных класса, которые грубо соответствуют активным промоторам, активным транскрипционным единицам, межгенным регионам вблизи активных генов, транскрипционно неактивным регионам и повторяющимся последовательностям. У C. elegans, более умеренный анализ 33 геномных карт (в основном гистоновых меток) идентифицировал три основные комбинации (Gerstein et al, 2010).

Не всегда возможно прямое сравнение идентифицированных типов хроматина, поскольку некоторые белки и гистоновые метки адаптируются к новым функциям и взаимодействиям во время эволюции. Напр., у Drosophila, lamin B в первую очередь ассоциирован с BLACK хроматином, тогда как H3K9me2 располагается в GREEN хроматине. Напротив в клетках мыши и человека паттерны связывания H3K9me2 и lamin B1 существенно перекрываются (Guelen et al, 2008; Wen et al, 2009; Peric-Hupkes et al, 2010). Возможно, что BLACK и GREEN хроматин слились у млекопитающих; вполне возможно также, что лишь немногие белки и метки оказались переставленными между типами хроматина. Так, HP1 ортолог A. thaliana has эволюционировал, чтобы соединяться с H3K27me3 (Zhang et al, 2007), подчеркивая переключение компонентов между GREEN и BLUE хроматином, определенным у Drosophila. Эти примеры иллюстрируют, что необходимы систематические крупные карты и беспристрастные наборы компонентов хроматина у каждого вида (и для каждого типа клеток), чтобы определить и сравнить основные типы хроматина.

DBF guidance by chromatin types

DBFs являются ключевыми игроками в регуляции генов: они являются белками. которые считывают инструкции, закодированные в регуляторной ДНК. Поэтому важно понять, как DBFs взаимодействуют с ДНК. DBFs обычно распознают мотивы в 4-8 пн, часто со значительной толерантностью к вариациям мотива. Обычно мотив в 6 пн появляется с вероятностью примерно каждые 4 kb, так что геном человека обладает приблизительно 1 миллионом мотивов, которые потенциально могут связываться с помощью DBF. Всё же in vivo огромное большинство этих мотивов не оккупируется с помощью DBF. Следовательно, д. существовать дополнительные механизмы специфичности, которые направляют DBFs только на субнабор из имеющихся мотивов. Одним из таких механизмов является закрытие индивидуальных связывающих мотивов путем позиционирования нуклеосом (Hayes and Wolffe, 1992; Lieb and Clarke, 2005; Rando and Ahmad, 2007). Как упоминалось выше уплотнение крупных сегментов хроматина, по-видимому, не является надежным механизмом для предупреждения избытка DBFs. Вместо этого разные типы хроматина могут действовать как DBF-специфические гиды в механизмах позитивного выбора (targeting) (Figure 4).

Анализ взаимодействий DBF-мотив показал. что каждый DBF обнаруживает предпочтение к связыванию со своим мотивом только в определенном типе хроматина. Напр., MNT соединяется со своим мотивом преимущественно в YELLOW и RED хроматине, тогда как SU(HW) соединятся со своим мотивом преимущественно в RED, BLUE и BLACK хроматине, даже если соотв. мотив для обоих DBFs присутствует во всех 5 типах хроматина (Filion et al, 2010). Т.о., каждый DBF имеет предпочтительный хроматиновый контекст, в котором он соединяется со своим мотивом. Эти предпочтения скорее всего обусловлены присутствием ассоциированных с хроматином белков 'помощников', которые помогают DBFs. Белки помощники могут физически взаимодействовать с DBF и стабилизировать связывание DBFs с их мотивами. Поскольку каждый DBF может иметь разные белки помощники, то каждый тип хроматина увеличивает взаимодействия специфических субнаборов DBFs с их мотивами. Итак, типы хроматина составляют селективную систему, которая наводит каждый DBF на его мотивы связывания только в некоторых регионах генома.

Big picture of chromatin: what's next?

Хроматин чрезвычайно сложен, и простые глобальные принципы, которые выявляются, предоставляют строгую основу для дельнейших поисков. Среди них имеются несколько принципов пространственной укладки и состава хроматина (Box 1). Пока ещё многие вопросы остаются нерешенными. Напр., каковы молекулярные механизмы, которые управляют сборкой принципиальных типов хроматина? Насколько эти типы отличаются между типами клеток и видами? Как они влияют на экспрессию генов и др. ассоциированные с ДНК функции, такие как репликация и репарация? Вносят ли они вклад в эпигенетическую память (Kaufman and Rando, 2010; Margueron and Reinberg, 2010), и если да,то каков механизм? Насколько важны дальнодействующие контакты хроматина для регуляции генов? Как контролируются взаимодействия генома с ядерными метками? Огромные темпы развития технологий предполагают. что вскоре мы будем способны получить ответы на эти важные вопросы и сможем открыть дополнительные базовые принципы.

Chromatin: constructing the big picture Bas van Steensel The EMBO Journal (2011) 30, 1885 - 1895 doi:10.1038/emboj.2011.135

Chromatin: constructing the big picture
Bas van Steensel
The EMBO Journal (2011) 30, 1885 - 1895 doi:10.1038/emboj.2011.135