Формирование глаз сложный и скоординированный процесс, которые возникает в результате взаимодействий клеток из нескольких разных источников во время раннего эмбрионального периода (Chow and Lang,2001). Среди этих клеточных взаимодействий, происходящие из нейроэктодермы, клетки глазного поля, располагающиеся на передне/вентральных сторонах нервной трубки, подвергаются экстенсивной клеточной пролиферации и морфогенетическим изменениям и развиваются в нейральную часть сетчатки, а также в не-нейральные ткани, такие как retinal pigmented epithelium (RPE), цилиарное тело и радужку (Chow and Lang,2001; Davis-Silberman and Ashery-Padan,2008). Цилиарное тело и радужка являются частью структур переднего сегмента глаза, и цилиарное тело необходимо для аккомодации, процесса, с помощью которого хрусталик меняет форму, позволяя менять фокусное расстояние. Цилиарное тело и радужка представлены внутренним двухслойным эпителием и лежащей поверх стромой. Внутренние два слоя происходят из внутреннего и наружного слоёв глазного бокала, который происходит из вентральной части переднего мозга. Внутренний непигментированный слой цилиарного эпителия является продолжением внутреннего пигментированного эпителия радужки и сетчатки. Наружный пигментированный слой цилиарного эпителия продолжается в наружный эпителий радужки и RPE (Beebe,1986). Третий слой происходит преимущественно из нервного гребня, который вносит вклад в меланоциты и клетки соединительной ткани радужки, а также в соединительную ткань и мышцы цилиарного тела. Однако этот слой является смесью разных клеток, некоторые из которых происходят из мезодермы (Gage et al.,2005).
Первичной ролью цилиарного тела является продукция и секреция внутриглазной жидкости в заднюю камеру, которая затем проникает в переднюю камеру, где она поддерживает внутриглазное давление (IOP). Поддержание собственно IOP важно как для нормального функционирования глаз взрослых (Gould et al.,2004) , так и для продолжающегося роста развивающегося эмбрионального глаза (Coulombre and Coulombre,1957). Помимо своей важной роли в установлении и поддержании IOP, цилиарное тело также ответственно за синтез многих белков внутренней ограничивающей мембраны, структуры, которая является критической для жизнеспособности клеток ретинальных ганглиев (Halfter et al.,2005). Интересно, что недавние исследования подтвердили, что цилиарное тело и радужка содержат клетки с характеристиками стволовых клеток и родоначальных клеток (Ahmad et al.,1999; Tropepe et al.,2000; Sun et al.,2006).
Радужка ответственна за контроль количества света, проходящего через хрусталик и воздействующего на сетчатку, аналогично роли жалюзи в камере. Она также участвует в циркуляции внутриглазной жидкости, которая секретируется цилиарным телом (Davis-Silberman and Ashery-Padan,2008). Радужка состоит из нескольких слоёв клеток. Пигментный эпителий радужки находится на стороне хрусталика/сетчатки он состоит из ткани, примыкающей к наружным слоям, которые состоят из мышц и стромы радужки. Корень радужки прикреплен непосредственно к цилиарному телу. Интригующая и уникальная онтогенетическая пластичность характеризует радужку. Пигментированные, постмитотические клетки зрелой радужки трансдифференцируются в мышцы сжимающие и расширяющие, открывающие и закрывающие радужку (Volpe et al.,1993). Во время развития клетки радужки теряют свой пигмент, вступают в митоз и становятся этими периферическими мышцами. Эти происходящие из радужки мышцы являются единственными известными мышцами эктодермального происхождения (Imaizumi and Kuwabara,1971).
Онтогенетические аномалии структур переднего сегмента без труда обнаруживаются у людей (Idrees et al.,2006). Заметим, что большинство этих нарушений, затрагивающих передний сегмент, характеризуются высокой степенью ассоциации с глаукомой (Gould et al.,2004). Глаукома, болезнь, характеризующаяся дегенерацией зрительного нерва, обычно связывается с повышением IOP в передней камере, возможно контролируемым секрецией внутриглазной жидкости цилиарным телом (Gould et al.,2004). Др. нарушение, aniridiae, широко распространено и вызывается мутациями в гене Pax6 и характеризуется частичной или полной потерей радужки (Davis-Silberman and Ashery-Padan,2008). Хотя нарушения, описанные выше наиболее распространены, существуют и др. глазные болезни, которые связаны с дефектами развития периферических тканей (Gould et al.,2004; Idrees et al.,2006; Davis-Silberman and Ashery-Padan,2008), хотя в точности мутации, вызывающие эти нарушения ещё не определены.
Хотя цилиарное тело и радужка играют критические роли в зрении и могут служить источником стволовых клеток сетчатки, наше понимание молекулярных механизмов, управляющих развитием этих тканей, ограничено. Было показано, что пертурбации нескольких разных сигнальных путей могут нарушать формирование цилиарного тела и радужки. В частности, передача сигналов BMP , как впервые было продемонстрировано, играет важную роль в этом процессе (Zhao et al.,2002). Цилиарное тело полностью отсутствует у трансгенных мышей, преобразованных, чтобы избыточно экспрессировать Noggin, антагонист BMP, используя специфический для хрусталика промотор (Zhao et al.,2002). Передача сигналов BMP, по-видимому, использует FGFs, т.к. форсированная экспрессия Fgf4 с RPE показывает, что существует взаимодействие между FGF и BMP в генерации домена цилиарного тела (Dias da Silva et al.,2007). Наконец, канонический путь передачи сигналов Wnt также играет критическую роль в детерминации судеб периферического цилиарного и радужного эпителия во время раннего развития оптического пузырька/бокала (Liu et al.,2003,2007; Cho and Cepko,2006).
Помимо связи между развитием цилиарного тела и некоторыми сигнальными путями имеются горстка транскрипционных факторов, которые необходимы для формирования структуры переднего сегмента глаз (Napier and Kidson,2007). Мыши, лишенные Otx1, напр., имеют более маленькие радужки, чем в норме и лишены цилиарных отростков (Acampora et al.,1996). Сходным образом мыши, мутантные по Lmx1b, LIM гомеодоменовому транскрипционному фактору, также обнаруживают гипоплазию радужки и цилиарного тела (Pressman et al.,2000). Интересно, что у людей гаплонедостаточность по локусу
LMX1B приводит к синдрому in nail-patella, наследственному заболеванию, характеризующемуся дефектами развития ногтей, коленных чашечек и локтей (McIntosh et al.,1998; Vollrath et al.,1998). У большинства из этих пациентов возникает также IOP и увеличивается риск развития открытоугольной глаукомы (Dreyer et al.,1998; McIntosh et al.,1998; Vollrath et al.,1998).
Чтобы идентифицировать гены кандидаты, экспрессирующиеся в разных глазных тканях во время развития, мы выявляли профили в одиночных клетках из развивающегося глаза. Была использована схема post hoc классификации, чтобы идентифицировать профили в одиночных клетках, базируясь на кластерах генной экспрессии (Trimarchi et al.,2008). Во время этого анализа стало очевидным, что два типа одиночных клеток, экспрессируют наборы генов, которые отличают их от др. profiled клеток. Путем сравнения профилей экспрессии этих клеток со многими др. типами клеток сетчатки, определены гены кандидаты, детерминирующие качественные особенности этих избранных клеток. Срезы in situ hybridization (ISH) как у мышей, так и кур были использоаны для демонстрации экспрессии этих генов кандида в развивающихся цилиарном теле и радужке. Следовательно, эти клетки, скорее всего, происходят из развивающихся цилиарного тела и радужки и обнаруживают наборы маркерных генов, экспрессирующиеся во время развития этих тканей. Кроме того мы исследовали экспрессию этих генов в сетчатке кур с избыточной экспрессией постоянно активированного β-catenin (CA-β-catenin) (Capdevila et al.,1998). Ранее было показано, что CA-β-catenin превращает клетки ретинальных предшественников в клетки с периферическими судьбами (Cho and Cepko,2006; Liu et al.,2007). Следовательно, эктопическая экспрессия вновь идентифицированных генов после избыточной экспрессии CA-β-catenin подтверждает, что эти гены были пригодными маркерами периферических тканей показывает. что эти гены могут потенциально действовать ниже передачи сигналов Wnt.
Analysis of transcripts expressed in the mouse peripheral margin of the optic cup and developing ciliary body/iris
Проверка данных микромассивов выявила несколько генов, присутствующих на ст. E12 в клетках A6 и на ст. P0 в клетках E8 , и в основном отсутствующих в ранее исследованных RGCs и ACs (Figure 1). Однако проверка профилей этих одиночных клеток выявила, что они обнаруживают некую общую экспрессию с RPCs (Figure 1 and data not shown). Так, некоторые гены широко экспрессировались в RPCs (напр., Sox2), некоторые экспрессировались только в небольшом субнаборе RPCs (напр., Igf2) и некоторые не обнаруживались в RPC (напр.. RIKEN кДНК B130021B11) (Figure 1). Несмотря на общность экспрессии некоторых генов с RPCs, эти два типа клеток не обладают очевидными признаками RPC, согласно нашей схеме классификации (data not shown). Кроме того, большинство экспрессирующихся в RPC генов, в Affymetrix микромассивах обнаруживали более низкие уровни в этих двух клетках, чем в клетках, которые имели высокие уровни, как RPCs.
Среди генов, чья экспрессия была высокой в этих двух клетках, были регуляторы клеточного цикла (Cyclin D2), сигнальные молекулы (Igf2 и Notch2) и транскрипционные факторы (Zic1 and Zic2). Определение генов, которые образуют кластеры с cyclin D2 с коэффициентом корреляции >0.75 выявлены гены (Igf2, Notch2 и Zic1) (Figure 1 and Supplemental Figure S1A). Большинство генов, которые невидны при визуальной проверке, идентифицировали посредством образования кластеров. Сюда входят молекулы клеточной поверхности (CD38 antigen) , которые, как было установлено, присутствуют в пигментированных и не-пигментированных цилиарных телах (Khoo and Chang, 1999) и многие неохарактеризованные RIKEN кДНК (Supplemental Figure S1A).
В этих одиночных клетках осуществляли ISH на замороженных срезах E12.5, E16.5 и P0 глаз мышей. Хорошо видимая экспрессия обнаруживалась или в на периферическом крае оптического бокала или в развивающемся цилиарном теле для каждого из этих тестированных генов (Figure 2 and Supplemental Figure S2). Неожиданно оказалось, что клетки развивающегося цилиарного тела и радужки представлены очень низким процентом от общего числа клеток на данной стадии. Предыдущий анализ профилирования одиночных клеток в этот же временной промежуток ганглиолярных и амакринных клеток, которые также присутствовали в низких количествах в развивающейся сетчатке в это время (Trimarchi et al., 2007).
На всех трех стадиях экспрессия Cyclin D2 наблюдалась в хрусталике и развивающемся цилиарном теле (Figure 2A-C). Не выявлено существенной экспрессии в центральной части сетчатки на ст. E12.5 и E16.5, в то же время некоторое тонкое окрашивание наблюдалось в outer neuroblastic layer (ONBL), где располагались делящиеся клетки предшественники на ст. P0 (Figure 2C). Сходным образом транскрипт для фактора роста Igf2 обнаруживался на высоких уровнях по периферическому краю глазного бокала на ст. E12.5 и затем в развивающемся цилиарном теле на ст. E16.5 и P0 (Figure 2D-F). Было обнаружено также окрашивание для Igf2 в хрусталиках (E12.5, Figure 2D) диске зрительного нерва (E16.5, Figure 2E).
H19, некодирующая РНК, которая располагается в той же самой области хромосомы, что и Igf2 и реципрокно импринтируется с Igf2 (Zemel et al., 1992), была также обнаружена в хрусталике, на развивающейся периферии глазного бокала (Figure 2G) и развивающемся цилиарном теле (Figure 2H and I). Однако в отличие от Igf2, высокий уровень экспрессии также наблюдался у H19 в субнаборе клеток ONBL сетчатки на т. E16.5 и P0 (Figure 2H and I, Supplemental Figure S3A, and B). Предполагается, что эти клетки станут RPCs, исходя из присутствия транскриптов H19 в профилях многих RPCs на ст. E12.5 и P0 (Figure 1). Осуществляли двойной DISH для H19 и Fgf15, ранее охарактеризованных как маркеры для RPCs (Blackshaw et al., 2004; Trimarchi et al., 2008), в диссоциированной P0 сетчатке, которая была помечена [3H]-thymidine в течение часа. Не обнаружено перекрывания между H19+ клетками и [3H]-thymidine+ клетками (Supplemental Figure S3C and D), но сильное перекрывание наблюдалось между Fgf15 и [3H]-thymidine (Supplemental Figure S3F). Эти данные указывают на то, что H19+ клетки в ONBL скорее всего не являются клетками предшественниками в S фазе клеточного цикла. Интересно, что многие H19+ клетки были также Fgf15+ (Supplemental Figure S3E), указывая тем самым, что эти клетки могут быть RPCs или в G1 или G2 фазе клеточного цикла.
Транскрипционные факторы, представляющие др. категорию генов, обнаруживаются в профилях этих двух одиночных клеток. Zic1, напр., обнаруживается как на ст. E12 в клетках A6, так и на ст. P0 в клетках E8, но ни в какой-либо из развивающихся RGCs или ACs, и в субнаборе RPCs (Figure 1).
ISH эксперименты с замороженными срезами сетчатки подтвердили, что Zic1 мРНК обнаруживается на периферическом крае оптического бокала на ст. E12.5 (Supplemental Figure S2A) и затем в развивающемся цилиарном теле на ст. E16.5 и P0 (Supplemental Figure S2B and C). Кроме того, транскрипты для родственного члена семейства, Zic2, также встречались в большом количестве в развивающихся цилиарном теле и радужке, но в отличие от Zic1, окрашивание на Zic2 обнаруживалось также по всему ONBL (Supplemental Figure S2D-F). Эти данные согласуются с предыдущими сообщениями об экспрессии в сетчатке этих zinc finger транскрипционных факторов (Nagai et al., 1997).
В профилях этих двух одиночных клеток наблюдались также неохарактеризованные транскрипты (Figure 1 and Supplemental Figure S1). ISH для одного из них (RIKEN кДНК 5730449L18/riboprobe AW489153) выявил экспрессию в диске зрительного нерва на ст. E12.5 (Figure 2J) и последующую экспрессию в развивающихся цилиарном теле и радужке на ст. E16.5 (Figure 2K) и P0 (Figure 2L). Дополнительная экспрессия была отмечена в субнаборе клеток на стороне обращенной к стекловидному телу развивающегося inner neuroblastic layer (INBL), это согласуется с экспрессией в развивающихся RGCs (Figure 2K and L).
Образуются иерархические кластеры, продуцируемые группой генов, которые сильно связаны с cyclin D2 (Supplemental Figure S1A). Чтобы оценить образование подобных клестеров и полнее изучить паттерны экспрессии некоторых из генов, ассоциированных с cyclin D2, использовали ISH для ninjurin1 и rhomboid family 1 (Rhbdf1). Ninjurin1 является адгезивной молекулой, идентифицированной благодаря её роли в регенерации нервов (Araki and Milbrandt, 1996) , которая выполняет сходную адгезивную роль в развивающемся цилиарном теле. Экспрессия ninjurin1 была очень слабой на ст. E12.5 на периферическом крае оптического бокала,но отсутствовала в самой сетчатке (Figure 2M). На ст. E16.5 и P0 транскрипты ninjurin1 обнаруживаются в развивающихся цилиарном теле и радужке и в ONBL (Figure 2N and O). Rhbdf1 является атипичным членом семейства сериновых протеаз, его гомолог у Drosophila, как было установлено, активирует факторы роста (Urban, 2006). Однако поскольку Rhbdf1 ассоциирует с ростовыми факторами, он лишен ключевых остатков, отвечающих за протеазную активность и поэтому его функцию ещё предстоит установить в полной мере (Nakagawa et al., 2005). Подобно ninjurin1, Rhbdf1 обнаруживает слабую экспрессию на периферическом крае оптического бокала на ст. E12.5 (Supplemental Figure 2G) , а затем более сильный сигнал обнаруживается в развивающихся цилиарном теле и радужке на ст. E16.5 и P0 с более слабым окрашиванием в ONBL на ст. E16.5 (Supplemental Figure 2H and I). Эти эксперименты по ISH показали, что кластеры генов, которые ассоциируют с cyclin D2, экспрессируются в развивающихся цилиарном теле и радужке и являются новыми маркерами этой ткани.
Существуют также транскрипты, которые обогащают на ст. E12 клетки A6 и на ст. P0 клетки E8 и которые также присутствуют в субнаборах развивающихся RGCs и ACs (Figure 1) или в субнаборах RPCs (data not shown). Эти гены включают регуляторы клеточного цикла (cyclin D3), сигнальные молекулы (Tgfb2), IGF связывающий белок (Igfbp5) и транскрипционные факторы (Sox2, Myc). ISH для некоторых из этих транскриптов подтвердила, что они экспрессируются в развивающихся цилиарном теле и радужке (Figure 2 and data not shown), и в то же время имеют и др. домены экспрессии. Tgfb2 мРНК, напр., обнаруживается как в ONBL, так и развивающихся цилиарном теле и радужке на ст. E12.5, E16.5 и P0 (Figure P-R). Окрашивание цилиарного тела и радужки более интенсивное, чем в ONBL на ст. E16.5 и P0 (Figure 2P and R). Кроме того, на ст. P0 окрашивание на мРНК Tgfb2 более выражено в наружном слое развивающихся цилиарного тела и радужки, чем на внутреннем слое (Figure 2R). Cyclin D3 обнаруживает очень сходный паттерн окрашивания, что и Tgfb2, он также довольно богат в цилиарном теле и радужке на ст. E16.5 и P0 , в то же время присутствует также в ONBL (data not shown). Myc, однако, экспрессируется по периферическому краю оптического бокала на ст. E12.5, а затем на ст. E16.5 и P0 более сильно экспрессируется в субнаборе клеток в наиболее vitreal части INBL, что согласуется с экспрессией в развивающихся RGCs (data not shown). Transcobalamin 2 (Tcn2) обнаруживается в профилях одиночных клеток развивающегося цилиарного тела, но не в развивающихся RGCs и ACs (Figure 1). Однако, Tcn2 обнаруживается в субнаборе профилей одиночных клеток RPC (Figure 1). ISH со срезами замороженной сетчатки выявила интенсивное окрашивание на Tcn2 в retinal pigment epithelium (RPE) на ст. E12.5 и P0 и более слабое окрашивание в ONBL (Figure 3A and B). ISH также выявила экспрессию Tcn2 в развивающихся цилиарном теле/радужке, которая особенно выражена на ст. E16.5 и P0 (Figure 3B and data not shown).
Кроме того, транскрипты наблюдались только в одной или другой предполагаемой одиночной клетке развивающегося цилиарного тела (Figure 1). Как это наблюдалось в отношении наборов генов, охарактеризованных выше, категории этих транскриптов включали транскрипционные факторы (Foxp2, Otx1, Tcf3, Etv1), регуляторы клеточного цикла (Wfdc1, cyclin E1) и сигнальные молекулы (Fgf14, Bmp7, Ltbp1). Обнаружение ассоциированных генов с существенными коэффициентами корреляции в иерархических кластерах более затруднено, поскольку они экспрессируются только в профиле одной одиночной клетки. Тем не менее, один кластер выявлен вокруг генов Foxp2 и Aldh1a3 (Supplemental Figure S1B). Как и в случаях кластеров, наблюдаемых выше, многие гены, ассоциирующие с Foxp2, были неохарактеризованными RIKEN кДНК, а др. экспрессировали последовательности тегов (sequence tags) (Supplemental Figure S1B).
ISH с криосрезами сетчатки трех ст. развития подтвердила экспрессию этих генов, которые образуют кластеры с Foxp2 и Aldh1a3 на периферическом крае зрительного бокала на ст. E12.5 и в развивающихся цилиарном теле и радужке на ст. E16.5 и P0 (Figure 3 and data not shown). Riboprobe для ингибитора роста Wfdc1 (Larsen et al., 1998) выявила строгое окрашивание на периферическом крае оптического бокала на ст. E12.5, и т.к. дополнительное окрашивание было обнаружено в клетках, расположенных в ONBL, но наиболее центральная часть сетчатки не была окрашена (Figure 3C). На последующих ст. развития, мРНК Wfdc1 начинала обнаруживаться только в развивающемся цилиарном теле (Figure 3D and data not shown). Дополнительный ген, ингибирующий рост, Gas1 (Del Sal et al., 1992), также обнаружен в профиле одиночной клетки А6 на ст. E12 (Figure 1). ISH подтвердила, что Gas1 экспрессируется на периферическом крае оптического бокала на ст. E12.5 (Figure 3M) а затем ограничивается цилиарным телом и радужкой на ст. E16.5 (Figure 3N). Курьёзно, что несколько генов. ингибирующих рост (Gas1, Wfdc1 и p57), экспрессируются в той же самой клетке, что и гены, которые стимулируют клеточный рост (некоторые cyclin гены, Myc и Notch2) [see figure 1 and (Rowan et al., 2004)]. Одним из возможных объяснений является то, что просто отсутствует корреляция между экспрессией мРНК и экспрессией белка, эти наблюдения оправдывают дальнейшие исследования чтобы понять взаимодействие между генами, управляющими клеточным циклом и теми, что препятствуют ему в развивающихся цилиарном теле и радужке.
Aldh1a1, который кодирует энзим, катализирующий вторую ступень превращения ретиноевой кислоты в retinol (Duester, 2000), экспрессируется на высоком уровне в хрусталике и в ONBL дорсальной части сетчатки на ст. E12.5 и E16.5 (Figure 3E and data not shown), как это было описано и ранее (Fan et al., 2003). Кроме того, этот ген обнаруживается как в дорсальной, так и вентральной части развивающегося цилиарного тела на всех трех стадиях (Figure 3E and F). Aldh1a3, родственен членам семейства aldehyde dehydrogenase, обнаруживается на ст. E12 в клетке A6, подобно Aldh1a1 (Figure 1). ISH криосрезов сетчатки по Aldh1a3 показала сильную экспрессию в периферическом крае оптического бокала на ст. E12.5, и не выявила экспрессии в развивающихся цилиарном теле и радужке на ст. P0 (data not shown), в отличие от Aldh1a1. Другой энзим Dhrs8, член семейства alcohol dehydrogenase, первоначально обнаруживается в субнаборе клеток в дорсальной части ONBL на ст. E12.5 (Figure 3G), но затем экспрессируется в цилиарном теле на ст. E16.5 и P0 (Figure 3H and data not shown).
Несколько транскрипционных факторов были обнаружены в профиле одиночной клетки A6 на ст. Е12, включая Foxp2, Otx1 и Tcf3 (Figure 1). Otx1, как сообщалось ранее , экспрессируется в развивающемся цилиарном теле (Martinez-Morales et al., 2001) а ISH криосрезов сетчатки продемонстрировала сильную экспрессию этого транскрипта на ст. E12.5 на периферическом крае оптического бокала и на ст. E16.5 в цилиарном теле (Figure 3I and J). Foxp2 также обнаруживается на периферическом крае оптического бокала на ст. E12.5 и в развивающемся цилиарном теле на ст. E16.5, но этот ген обнаруживает также дополнительное окрашивание субнабора клеток в INBL (Figure 3K and L). Локализация этих клеток со стороны склеры в INBL указывает на то, что они могут быть развивающимися ACs (Figure 3L). Открытие разных транскрипционных факторов, экспрессирующихся с развивающемся цилиарном теле и радужке, делает возможным дальнейшие исследования по вычленению специфических сетей транскрипционных факторов, экспрессирующихся в развивающихся цилиарном теле и радужке и сделает возможными исследования в будущем по выявлению сетей транскрипционных факторов, оправляющих дифференцировкой этого региона.
Несколько дополнительных генов обнаружено экспрессирующимися в одной из двух предполагаемых клеток цилиарного тела. Insulin receptor substrate белки (Irs1-4) соединяются с инсулиновыми рецепторами после их активации и фосфорилирования и действуют как молекулярные мостики для нижестоящих сигнальных путей (Giovannone et al., 2000). Поскольку др. члены этого семейства играют роль в росте и метаболизме глюкозы, то функция Irs4 не совсем понятна (Fantin et al., 2000). Irs4 обнаружен в профиле транскрипции на ст. E12 клеток A6 (Figure 1) , а ISH на ст. E12.5 выявляет мощную экспрессию на периферическом крае оптического бокала (Supplemental Figure S2J) и в развивающемся цилиарном теле и радужке на ст. E16.5 (Supplemental Figure S2K). Экспрессия Irs4 отсутствует в сетчатке и развивающемся цилиарном теле на ст. P0, указывая тем самым. что этот ген может играть роль в раннем развитии цилиарногог тела. Транскрипт для Ltbp1, который кодирует белок, являющийся частью крупного комплекса, который связывает членов семейства Tgf? и удерживает их в неактивном состоянии, помогая тем самым их сборке и доставке (Oklu and Hesketh, 2000), также был обнаружен в профиле клетки А6 на ст. E12 (Figure 1). ISH по Ltbp1 показала, что этот ген экспрессируется на периферическом крае оптического бокала на ст. E12.5 и затем в развивающемся цилиарном теле и радужке на ст. E16.5 и P0 (Supplemental Figure S2M-O). Vinculin, который кодирует актин связывающий белок, играющий роль в межклеточной и клетка/матрикс адгезии (Ziegler et al., 2006), также обнаруживается в клетке А6 на ст. E12 (data not shown). ISH также демонстрирует, что этот ген экспрессируется в субнаборе клеток ONBL на ст. E12.5 (Figure 3O), но затем обнаруживается в наружном слое развивающегося цилиарного тела на ст. E16.5 и P0 (Figure 3P and data not shown). Дополнительное сильное окрашивание наблюдается в кончике развивающейся радужки как у мышей на ст. P0 , так и кур на ст. E6 и E8 (Figure 3P, Supplemental Figure S2P and R).
Nephronectin (Npnt) является белком, содержащим EGF-повторы, который идентифицирован в тканях, подвергающихся эпителиально-мезенхимному переходу о время развития (Brandenberger et al., 2001; Morimura et al., 2001). Транскрипты Npnt обнаружены в профиле клеток E8 на ст. Р0, но не в клетках A6 на ст. Е12 (Figure 1). ISH на криосрезах сетчатки на ст. E12.5 выявила строгое окрашивание на Npnt в RPE (Figure 2S). На ст. E16.5, окрашивание в RPE существенно снижается и наиболее заметный сигнал обнаруживается на верхушке развивающегося цилиарного тела и в радужке (Figure 2T). Этот паттерн экспрессии продолжается и на ст. P0 с более слабым окрашиванием по Npnt в цилиарном теле и с более выраженным сигналом в развивающейся радужке (Figure 2U). Паттерн экспрессии Npnt указывает на то, что на ст. P0 клетки E8 могут возникать из разных частей развивающегося цилиарного тела и радужки на ст. E12 клетки A6 и , следовательно, этот ген является ещё одним маркером этого региона.
BMP7, белковая сигнальная молекула, как было установлено, играет важную роль в развитии цилиарного тела мыши (Zhao et al., 2002), мы нашли его в профиле одиночной клетки E8 на ст. Р0 (Figure 1). ISH криосрезов сетчатки показала, что
BMP7 экспрессируется на периферическом крае оптического бокала на ст. E12.5 (Figure 3Q). Кроме того, BMP7 обнаруживается в хрусталике и в субнаборе клеток в центре сетчатки, в положении, соответствующем возникновению RGCs на этой ст. (Figure 3Q). На ст. E16.5,
BMP7 сильно экспрессируется в развивающемся цилиарном теле и радужке, но он также обнаруживается в субнаборе клеток в ONBL (data not shown). На ст. P0, экспрессия
BMP7 ограничивается развивающемся цилиарным телом и радужкой (Figure 3R). Эти эксперименты по выявлению профилей микромассивов в сочетании с ISH беспристрастно демонстрируют динамическую природу генной экспрессии на периферическом крае оптического бокала и в развивающемся цилиарном теле и радужке , а существенное разнообразие классов генов, которые экспрессируются в этом регионе развивающегося глаза.
Analysis of transcripts expressed in the developing chick peripheral margin of the optic cup
Было предположено, что прирожденные морфогенетические события, которые появляются во время морфогенеза цилиарного тела могут быть совершенно различными у мышей и кур (Napier and Kidson, 2007). Учитывая такую возможность существования сходства и различий, сравнение экспрессии генов в периферической сетчатке мышей и кур может быть информативным. Для этого в развивающихся глазах кур осуществляли ISH криосрезов сетчатки на ст. E4, E6 и E8 (Figure 4A). Эти стадии выбраны как наиболее полно соответствующие ст. E12.5, E16.5 и P0 развития мыши. Исследуемые гены включали те, которые были идентифицированы в микромассивах одиночной клетки мыши (Figure 1), и гены, про которые уже было известно, что они экспрессируются по периферии галаз мыши (Rowan et al., 2004). Среди генов, идентифицированных у мышей, транскрипты сигнальных молекул BMP4 и BMP7 (Figure 4B and C), Wnt рецептор, Frizzled 4 (Figure 4D), транскрипционные факторы, такие как FoxP2, Zic1, Otx1 и TFEC (Figure 4E 4G, 4I), регуляторы клеточного цикла, такие как GAS1, WFDC1, SGK, c-Myc и Cyclin E1 (Figure 4H, 4K-4L, and data not shown) и др. гены, такие как Transcobalamin 2, Clusterin и Collagen IX (Figure 4J and data not shown) экспрессировались на высоких уровнях на периферии оптического бокала между ст. E4-E8. В целом, сигналы ISH, специфические для периферии сетчатки, были выявлены в двух разных зондах, соответствующих разным частям генов (Supplemental Table 1 and data not shown). Экспрессия была наивысшей на вершине края оптического бокала и снижалась в направлении к центру сетчатки. Кроме того, интенсивность сигнала снижалась со временем, так что экспрессия на ст. E8 была очень низкой в болшинстве случаев. Неясно, обусловлено ли это выраженным истончением цилиарного и радужки эпителия в это время или снижением уровней транскрипции.
Кинетика экспрессии варьировала во время этих стадий развития также. Для некоторых генов сигнал ISH со временем усиливался, тогда как в большинстве случаев экспрессия на ст. E4 и E6 была выше, чем на ст. E8. Уровень экспрессии на периферии варьировал на каждой данной ст. Напр., TFEC и SGK (Figure 4I, 4I1, 4I2 and 4L, 4L1, 4L2) обнаруживали узкий домен экспрессии, расположенный на кончике оптического бокала, который, как полагают, развивается в радужку, тогда как большинство др. генов обнаруживает более широкую экспрессию на периферии оптического бокала на ст. E4.
Хотя большинство протестированных генов экспрессируется у мышей и кур, но некоторые гены (cyclin D2, Igf2, cyclin D3, IGFBP5, Crhbp, REST, FGFR2 и CD63), экспрессируtvst у мышей или едва экспрессировались или не экспрессировались или экспрессировались в др. частях развивающегося оптического бокала у эмбрионов кур (Supplemental Table 1). Поскольку некоторые гены этого класса обнаруживают экспрессию в др. тканях, окружающих развивающийся оптический бокал, то отсутствие экспрессии скорее всего обусловлено межвидовыми различиями скорее, чем техническими подходами. Напр., cyclin D2, CD63 и FGFR2 обнаруживают сильную экспрессию в хрусталике и окологлазной мезенхиме (data not shown), тогда как IGF2 обнаруживает широкую экспрессию в вентральной части оптического бокала (data not shown). Это может указывать на то, что существуют молекулярные различия в развивающемся цилиарном теле и радужке мышей и кур. Напр., известно, что механизм развития окологлазной мезенхимы существенно различен у мышей и кур. В этой ткани клетки. происходящие из нервного гребня и мезодермы, вносят разные вклады в окологлазные мезенхимные клетки, окружающие глаз у мышей и кур (Gage et al., 2005).
Ectopic expression of ciliary body markers upon induction of the Wnt signaling pathway
Канонический путь передачи сигналов Wnt играет важную роль во время ранней спецификации цилиарного тела и радужки на периферии развивающегося оптического пузырька/бокала (Liu et al., 2003; Cho and Cepko, 2006; Liu et al., 2007). Чтобы исследовать, могут ли периферические гены стоять ниже передачи сигналов Wnt, исследовали экспрессию этих генов в сетчатке после избыточной экспрессии конституитивно активной формы beta-catenin (CA-β-catenin) (Capdevila et al., 1998; Cho and Cepko, 2006). В предыдущих экспериментах птичий replication competent retroviral vector, кодирующий N-терминальный делеционный мутантный β-catenin (RCAS:CA-β-catenin), что заставляет его быть постоянно активным, вносился в сетчатку кур. Инфекция этим вирусом приводила к тому. что клетки предшественники сетчатки воспринимали судьбу более периферических частей сетчатки. Кроме того, наблюдается подавление ретинальных генов и активация некоторых уже известных маркеров цилиарного тела и радужки (Cho and Cepko, 2006; Fu et al., 2006).
Чтобы проверить, какой из вновь идентифицированных маркеров цилиарного тела может находиться иерархически ниже передачи сигналов Wnt, RCAS:CA-β-catenin был использован, чтобы инфицировать оптический пузырёк на ст. 10. Инфицированная сетчатка , взатая на ст. E9.5, разрезалась и окрашивалась анти-gag антителами (3C2), чтобы определить распространенность инфицированного региона, который также экспрессирует CA-β-catenin (Figure 5A-D). Эпителий сетчатки без 3C2 окрашивания имел как нормальную толщину, так и нормальный паттерн нейрогенеза, на что указывает анти-?-tubulin окрашивание (Figure 5C), тогда как 3C2+ области обнаруживали постепенное снижение окрашивания ?-tubulin и истончение сетчатки (Figure 5A-D).
Поскольку корреляция между истончением сетчатки и выбором судьбы цилиарного тела и радужки высоко воспроизводима, то эти среды были изучены в отношении экспрессии вновь идентифицированных маркеров цилиарного тела и радужки.
Чтобы застраховаться, что метод избыточной экспрессии вирусов функционален, эктопическая индукция в сетчатке проверялась на ранее идентифицированные гены маркеры цилиарного тела и радужки. Эти гены включали секретируемые сигнальные молекулы (BMP7, Figure 5G, H), регулятор клеточного цикла (WFDC1,
Figure 5W, X), и матричный белок (Collagen IX, Figure 5AA, AB). Экспрессия Wnt рецептора (Fzd4) и сигнального трансдуктора Wnt (Lef1) была охарактеризована ранее в периферической сетчатке (Jasoni et al., 1999; Kubo et al., 2003). Чтобы определить, находится ли экспрессия Fzd4 и Lef1 потенциально ниже передачи сигналов Wnt, оптический пузырёк на ст.10 инфицировали RCAS:CA-β-catenin и газа извлекали на ст. E9.5. И Fzd4 (Figure 5Q, R) и Lef1 (Figure 5Y, Z) эктопически активировались в центральной части сетчатки после активации пути Wnt. Подобная активация Lef1 и Fzd4 может быть вызвана механизмом позитивной обратной связи β-catenin, обеспечиваемого передачей сигналов Wnt (Kubo et al., 2003; Liu et al., 2003).
Вновь охарактеризованные гены, идентифицированные в результате комбинированного анализа микромассивов и ISH срезов от мышей, описанные выше, и дополнительные обогащенные на периферии гены, описанные ранее (Rowan et al., 2004) также были исследованы в отношении свой чувствительности к передаче сигналов Wnt. Все эти результаты наблюдались с помощью ISH срезов от множественных инфицированных с помощью RCAS:CA-β-catenin сетчаток (минимум двух). Сходным образом, как и в случае Fzd4 и Lef1, инфекция RCAS:CA-β-catenin приводила к активации секретируемых сигнальных молекул BMP4 (compare Figure 5E to 5F), транскрипционных факторов FoxP2, Otx1, Zic2 и TFEC (compare Figure 5I to 5J, 5K to 5L, 5M to 5N, and 5O to 5P, соотв.), и регуляторов клеточного цикла Gas1 и SGK (compare Figure 5S and 5U to 5T and 5V, соотв.). В целом индукция этих маркеров присутствовала во всех диапазонах истонченной сетчатки за исключением немногих случаев, где усиление активности было ограничено только небольшой областью истонченного эпителия (see Figure 5F, J and N). Кроме того, в каждом данном срезе сходная активация наблюдалась в любой части эпителия, где происходило истончение. Отсутствие крупной индукции в этих случаях может быть обусловлено потребностью в более высоких уровнях передачи сигналов Wnt, чтобы достичь полной активации транскрипции. Эктопическая индукция негативных регуляторов клеточного цикла, таких как SGK, Gas1 и WFDC1 указывает на то, что каноническая передача сигналов Wnt в развивающейся периферии оптического бокала может участвовать в супрессии клеточной пролиферации. Эта интерпретация согласуется с предыдущими результатами, показавшими, что индекс клеточной пролиферации в периферических частях сетчатки ниже, чем в центре сетчатки, и ниже в центральной сетчатке после инфекции RCAS:CA-β-catenin (Cho and Cepko, 2006).
Поскольку инфекция вирусом с RCAS:CA-β-catenin ведет к преобразованию паттерна глаз, так что центральная часть сетчатки воспринимает судьбу периферической части сетчатки (Cho and Cepko, 2006), поэтому наблюдаемая эктопическая экспрессия в центральной части сетчатки этих генов кандидатов может быть или стоящей ниже непосредственно под передачей сигналов Wnt или просто может быть следствием изменений в судьбе. В любом случае эти эксперименты предоставляют дальнейшую аттестацию этих вновь идентифицированных
bona fide периферических маркеров. А теперь ещё было показано, что они являются нижестоящими мишенями сигнального пути Wnt. Их точная позиция в иерархии экспрессии генов, стоящих ниже передачи сигналов Wnt бужет установлена в дальнейших исследованиях.
Comparison of ciliary body marker studies
Несколько стратегий было применено для идентификации генов, специфически экспрессирующихся в периферических структурах глаз у разных животных. Эти подходы включали ISH скрининг, субтрактивные стратегии гибридизации и микромассивы в структурах передних глаз мышей, человека и кур (Thut et al., 2001; Escribano and Coca-Prados, 2002; Kubota et al., 2004; Diehn et al., 2005). В данном исследовании использовали комбинацию профилирования транскрипции одиночных клеток и ISH для идентификации маркеров цилиарного тела в развивающейся сетчатке мыши и кур. Предыдущий высокопроизводительный скрининг ISH в развивающихся глазах мыши идентифицировал 6 генов, обладающих специфической экспрессией по краю оптического бокала (Thut et al., 2001). Три из этих маркеров (Tgfb2, Col9a1 и Slc16a1) экспрессируются как в профиле одиночной клетки цилиарного тела (CB) , так и наблюдаются в незначительных количествах в профилях одиночных клеток RGC, AC или PR (Supplemental Figure S4A). Tac1 не обнаруживается в предполагаемой одиночной CB клетке, а Ptmb4 оказалось невозможно локализовать с помощью Affymetrix microarray (Supplemental Figure S4A). Боле сильным маркером оказался найденный в предыдущих исследованиях в цилиарном теле Tgfb1i4 (Thut et al., 2001). Др. группа тщательно охарактеризовала экспрессию этого маркера в более зрелых периферических структурах (Napier and Kidson, 2007). Tgfb1i4 не был идентифицирован как маркёр цилиарного тела в нашем скрининге, поскольку мощная экспрессия этого гена обнаруживалась также в профилях одиночных клеток RGCs и ACs между E12.5 и P0 (Supplemental Figure S4A). Чтобы проверить, экспрессируется ли Tgfb1i4 вне развивающегося цилиарного тела, предприняли ISH в сетчатке на ст. E12.5, E14.5, E16.5 и P0. Сильное окрашивание наблюдалось на каждой из этих стадий в развивающихся цилиарном теле и радужке (Supplemental Figure S4B-E). Однако, на ст. E14.5, E16.5 и P0, значительный сигнал обнаруживался также в INBL (Supplemental Figure S4C-E), где располагаются развивающиеся RGCs и ACs, это согласуется с результатами исследования микромассивов одиночных клеток. В то время как Tgfb1i4 обнаруживает высокую экспрессию в развивающемся цилиарном теле, этот ген не маркирует эту область специфически и экспрессируется и в др. ближайших клетках сетчатки.
Предприняты дополнительные поиски маркеров структур цилиарного тела человека. Эти анализы использовали или подходы с микромассивами (Diehn et al., 2005) или анализ базы данных EST (Escribano and Coca-Prados, 2002) , чтобы получить список генов кандидатов, специфичных для цилиарного тела. Чтобы исследовать экспрессию набора этих генов в нашем профилировании транскрипции отдельных клеток, была создана heatmaps с генами, идентифицированными с помощью разработки EST (Supplemental Figure S5A) и с помощью анализа микромассивов (Supplemental Figure S5B). В целом, маркеры, найденные с помощью анализа EST экспрессировались в значительном большинстве одиночных клеток, чем просто в предполагаемых CB клетках (Supplemental Figure S4A). Кроме того, не все из этих маркеров экспрессируются или в А6 клетке на ст. E12 или в E8 клетке на ст. Р0. Напротив, большинство маркеров, идентифицированных при скрининге микромассивов, не экспрессировались ни в одной из двух одиночных клеток в данном исследовании, которые могли происходить из развивающегося цилиарного тела или в др. из профилей др. одиночных клеток (Supplemental Figure S5B). Только два исключения Tpm2 и Bmp7. Принципиальной причиной этих отличий является, скорее всего, то, что эти исследования проводились с использованием тканей взрослых людей, тогда как данное исследование сфокусировано исключительно на развивающихся цилиарных телах мышей и кур.
Наконец, в одном из проведенных исследования найдены гены, специфически экспрессирующиеся в цилиарном эпителии кур. Комбинация subtractive гибридизации и микромассивов кДНК была использована для идентификации генов кандидатов и применена ISH для последующей оценки специфичности экспрессии этих кандидатов маркеров. Большинство генов, идентифицированных в качестве специфических маркеров цилиарного эпителия Kubota et al. (Kubota et al., 2004) не перекрывались с генами нашего исследования. Только три гена genes (Zic2, Tgf?2 и Collagen IX) были видны в обоих этих подходах. Наиболее вероятно, что различия в стадиях взятия тканевых выборок для сравнения. В наших экспериментах использовались эмбриональные и ранние постнатальные клетки у мышей и глаза на ст. E4 - E8 для анализа у кур, тогда как Kubota et al. использовали глаза цыплят спустя 1 день после вылупления (Kubota et al., 2004). Это стадия, когда развитие глазных структур завершается. Напротив, неспособность идентифицировать известные маркеры цилиарного тела может быть обусловлена некоторыми техническими недостатками используемого протокола. Напр., Msh homeobox-содержащие гены Msx1 и Msx2 экспрессируются в развивающихся цилиарных телах во множественных временных точках онтогенеза (Monaghan et al., 1991). Однако эти гены не были обнаружены в транскрипционных профилях двух презумптивных клеток цилиарного тела в этом исследовании. Фактически эти два гена не были никогда обнаружены в любой из профилированных одиночных клеток, указывая тем самым, что или экспрессируемые ими уровни слишком низки, чтобы быть выявлены в профилях одиночных клеток или что последовательности мишени в Affymetrix microarray неспособны гибридизироваться с кДНК этих генов.
Сайт создан в системе
uCoz