Посещений:
КОГЕЗИНОВЫЙ КОМПЛЕКС

Регулятор целосности генома и экспрессии генов

Cohesin: a regulator of genome integrity and gene expression
Katherine M. Feeney, Christopher W. Wasson and Joanna L. Parish
Biochem. J. (2010) 428 (147–161)

Following ДНК replication, chromatid pairs are held together by a proteinacious complex called cohesin until separation during the metaphase-to-anaphase transition. Accurate segregation is achieved by regulation of both sister chromatid cohesion establishment and removal, mediated by post-translational modification of cohesin and interaction with numerous accessory proteins. Recent evidence has led to the conclusion that cohesin is also vitally important in the repair of ДНК lesions and control of gene expression. It is now clear that chromosome segregation is not the only important function of cohesin in the maintenance of genome integrity.
Аккуратное разделение сестринских хроматид по дочерним клеткам является критическим для поддержания целостности генома. Потеря целостности генома из-за W-CIN (нестабильности целых хромосом) имеет отношение к разным патологиям, включая неспособность к репродукции, умственные и физические аномалии [1]. Однако связь между W-CIN и чувствительностью к раку трудно установить. Аберрантные количества хромосом или анеуплоидия это один из молекулярных признаков раковых клеток, но мало доказательств, что анеуплоидия ведет к раку скорее, чем являются следствием туморогенеза [2]. Некоторые мышиные модели W-CIN были использованы для определения является ли анеуплоидия причиной или следствием туморогенеза. Эти модели представили строгие доказательства, что мутации некоторых генов, участвующих в регуляции правильного расхождения хромосом приводят к высокой чувствительности к раку и тем самым указывают на связь между аномальной сегрегацией хромосом и возникновением рака [3].
Механизмы, с помощью которых реплицируются сестринские хроматиды, и аккуратно расходятся по дочерним клеткам, первоначально зависят от их физической ассоциации др. с др., процесса наз. cohesion. Слипчивость сестринских хроматид облегчает отлавливание биполярным митотическим веретеном и расхождение к противоположным полюсам, приводи к образованию двух генетически идентичных дочерних клеток. Без физической ассоциации сестринских хроматид, оппозитные силы, необходимые для биполярного разделения хроматид, не образуются. В этом случае преждевременное разделение хроматид д. происходить до биполярного прикрепления и приводить к неаккуратному расхождению хромосом и геномной нестабильности. Давно известно, что сестринские хроматиды физически ассоциируют вплоть до начала анафазы в результате сплетения или сцепления (catenation) нитей ДНК во время репликации и что ДНК topoisomerase II необходима для разделения хроматид в анафазе [4]. В самом деле, ингибирование topoisomerase II показывает, что сцепление ДНК между сестринскими хроматидами существует и нуждается в разрешении, чтобы сделать возможным аккуратное расхождение сестринских хроматид, но не выход из митоза [5-7]. Хотя эти исследования показали, что сцепление ДНК необходимо для эффективного расхождения хроматид, слипчивость молекул ДНК может, однако, устанавливаться и отсутствие сцепления (catenation) [8]. Более убедительные доказательства для механизма слипчивости сестринских хроматид получены в результате выделения белковых комплексов, существенных для слипчивости, но которые не участвуют в механизме, с помощью которого устраняется catenations. Эти высоко законсервированные белковые комплексы содержат множественные стержневые структурные белки вместе с несколькими ассоциированными регуляторными субъединицами.

MOLECULAR ARCHITECTURE OF THE COHESION COMPLEX


Основные члены белкового комплекса, которые облегчают слипчивость хромосом во время митозов, впервые были изолированы с использованием скрининга дрожжей на чувствительные к температуре мутации, которые вызывают потерю хромосом с высокой частотой. 4 гена были изолированы с помощью этого подхода: два известных гена, относящиеся к SMC (structural maintenance of chromosomes) семейству АТФases (SMC1 и SMC3) и два новых гена, наз. SCC1 и SCC3 благодаря их участию в sister chromatid cohesion [9]. Вторая ключевая находка этих исследований касалось того, что Scc1 субъединица cohesin комплекса специфически деградирует при переходе от метафазы к анафазе с помощью APC (anaphase-promoting complex), способствующего разделению сестринских хроматид [9]. В то же самое время в независимом исследовании был идентифицирован Scc1 [также известный как Mcd1 (mitotic chromosome determinant 1) у Saccharomyces cerevisiae (почкующихся дрожжей) и как Rad21 (radiation-sensitive 21) у Schizosaccharomyces pombe (делящихся дрожжей) и позвоночных] как Smc1-ассоциированный белок, участвующий в слипчивости сестринских хроматид [10]. Позднее было показано, что продукты этих 4-х генов, Smc1, Smc3, Scc1 и Scc3, существуют в комплексе, наз. cohesin, который является центральным механизмом слипчивости сестринских хроматид. Table 1 дает названия субъединиц cohesin и ассоциированных белков у дрожжей, дрозофилы и млекопитающих. 

Table 1 Cohesin subunits and associated proteins 



Alternative names are given in parentheses.
Cap, chromosome-associated protein; CUT, Cell untimely torn; Esp1, extra spindle pole bodies 1;
Mis, minichromosome instability 4.


Process                             S. cerevisiae        S. pombe        D. melanogaster        H. sapiens
Cohesin complex                  Smc1               Psm1                Smc1                          Smc1
                                              Smc3               Psm3            Smc3 (Cap)                     Smc3
                                        Mcd1 (Scc1)         Rad21        Rad21 (Verthandi)           Rad21
                                              Scc3                 Psc3            SA1 (Stromalin)        SA1/SA2/STAG3
Cohesin-loading proteins       Scc2             Mis4                  Nipped-B                   NIPBL
                                                Scc4               Ssl3             Mau-2 (CG4203)              Scc4
Cohesion establishment
/anti-establishment,
protection                         Eco1 (Ctf7)          Eso1                 Eco                          Esco1/Esco2
                                               Pds5                Pds5                 Pds5                          Pds5
                                              Rad61              Wpl1                 Wapl                        Wapal
Cohesin cleavage                  Pds1                Cut3                Pimples                     Securin
                                              Esp1                Cut1                 Separase                Separase


SMC семейство белков очень консервативно у прокариот и эукариот и имеет одну и ту же общую структуру. SMC белки являются крупными (1000-1300 аминокислот) и содержат два нуклеотид-связывающих мотива, известных как Walker A и Walker B мотивы, расположенные на противоположных концах полипептида. Крупный биспиральный мотив расположен между Walker A и Walker B мотивами и образует складки в виде антипаралельного образования, создающего АТФ-связывающий головной домен. На др. конце свернутого белка находится шарнирный (hinge) домен, который облегчает или гомо- или гетеродимеризацию SMC молекул, создавая V-образную структуру [11,12]. Электронные микрографии SMC димеров показывают, что двуспиральные плечи каждой молекулы приблизительно 50 nm в длину и что существует высокая степень гибкости в шарнире, приводящая к широкой изменчивости конформационных состояний между димерами [12,13]. Cohesin комплекс состоит из гетеродимера Smc1 и Smc3 субъединиц, собранных как описано выше. Член семейства kleisin Scc1 соединяется с Smc1 и Smc3 головными доменами, создавая закрытую кольцевую структуру, которая достаточно велика, чтобы окружить волокна хроматина, тогда как 4-я субъединица cohesin, Scc3, ассоциирует с комплексом путем взаимодействия с Scc1 [11] (Figure 1). Существуют известные гомологи Scc3 в клетках позвоночных, SA1 и SA2 (stromal antigen 1 and 2; также известные как STAG 1 и 2; и третий гомолог STAG3 функционирует в мейозе и экспрессируется только в зародышевых клетках). Интересно, что было показано, что cohesin содержат только или SA1 или SA2, но не оба [14,15], хотя функция этих отличающихся белковых комплексов не определена. Однако предполагается, что SA1 и SA2 играют роль в установлении слипчивости на теломерах и центромерах соотв., указывая тем самым на потенциально разные роли ассоциированных с SA1 и SA2 cohesin [16].

Figure 1 Structure of the cohesin complex The SMC proteins contain nucleotide-binding motifs situated at opposing ends of the polypeptide, which fold creating a hairpin structure with a 50 nm coiled-coil domain situated between the АТФ-binding head domain and hinge domain. Smc1 (green) and Smc3 (orange) together form a V-shaped heterodimer via hinge-hinge interaction. The C-terminal domain (C) of Scc1/Rad21 (purple) associates with the head domain of Smc1, whereas the N-terminal domain (N) associates with the head domain of Smc3, thus forming a closed ring structure. The forth subunit of cohesin (Scc3/SA1/SA2; brown) binds directly to Scc1.

ASSOCIATION OF THE COHESIN RING WITH ДНК


Первые же исследования выявили механизм, с помощью которого cohesin ассоциирует с ДНК, показав, что только SMC белки могут ассоциировать с ДНК ATФ-независимым способом [17,18]. Дальнейшее изучение показало, что cohesin может облегчать межмолекулярные ассоциации молекул ДНК скорее, чем завязывание внутримолекулярных узлов, управляемое с помощью родственного condensin комплекса [19]. Эти результаты привели к гипотезе, что Smc1-Smc3 гетеродимер действует как межмолекулярный мостик между двумя молекулами ДНК, создавая когезивные силы, которые удерживают хромосомы вместе. Первоначально образование таких межмолекулрных мостиков, как было подтверждено, регулируется или поддерживается с помощью non-SMC субъединиц, уникальных для cohesin, тем самым объясняло образование межмолекулярных мостиков с помощью cohesin скорее, чем внутримолекулярные взаимодействия, облегчаемые condensin. Однако гипотеза образования мостиков skf модифицирована в дальнейшем на базе структурных и биохимических исследований cohesin комплекса, которые чётко показали образование кольцеобразной структуры между V-образным SMC гетеродимером, соединенным с каждым из концов легко раскалываемой Scc1 субъединицы [11,20,21]. Отсюда было предположено, что cohesin комплекс действует путем окружения кольцом нитей ДНК, удерживая их вместе скорее, чем формируя молекулярные мостики между нитями.
Потребность в ATФ-связывании и гидролизе при становлении и устранении слипчивости по-прежнему остается спорной. Хотя некоторые исследования in vitro показали, что SMC белки могут ассоциировать с ДНК посредством C-терминальных доменов АТФ-независимым способом [17,18], исследования in vivo показали. что гидролиз АТФ необходим для ассоциации cohesin с ДНК [22,23]. Доказательства указывают на то, что две молекулы АТФ удерживаются между головками SMC, которые разделены и связаны с одиночной молекулой Scc1 после гидролиза АТФ [23]. Это может быть запущено присутствием ДНК и поэтому вызывает в результате улавливание нитей ДНК внутрь состоящего из трех частей кольца. Хотя специфичный для cohesion гетеродимер Smc1-Smc3, как было показано, соединяется с ДНК в отсутствие др. белков и АТФ, эта ассоциация очень низкого сродства, указывающая на то, что она не происходит in vivo, тогда как включение субъединицы Scc1 в комплекс существенно повышает сродство связывания [24]. Кроме того, гетеротримерный комплекс ассоциирует с крестообразной ДНК со значительно более высоким сродством, чем с неструктуированной двухничатой ДНК, указывая тем самым, что присутствие вторичной структуры важно для ассоциации cohesin с ДНК [24]. В самом деле, независимое исследование показало, что cohesin комплекс соединяется с хроматином со значительно более высоким сродством, чем один только гетеродимер Smc1-Smc3, указывая тем самым, что holocomplex нуждается во вторичных структурных элементах, чтобы соединиться с ДНК с высоким сродством [25]. ЭМ гетеродимеров SMC показала, что плечи молекул приблизительно 50-60 nm в длину. Включение субъединицы Scc1, чтобы сформировать трехсоставное кольцо, д. позволить окружить нуклеосомную ДНК, которая приблизительно 10 nm в диаметре [11]. Топологический захват ДНК в cohesin кольца подтверждается исследованиями, показавшими, что расщепление Scc1 или Smc3 субъединиц ветёт к диссоциации cohesin от ДНК и преждевременной потере слипчивости [26]. Неужели одно cohesin кольцо обхватывает две нити хроматина, чтобы удерживать их вместе или каждое волокно окружается cohesin кольцом, которые взаимосоединяются, чтобы удерживать нити вместе, установить трудно (Figure 2).


Figure 2 Models of sister chromatid cohesion

(A) Ring model: one cohesin ring encircles two sister chromatids (the ДНК is wrapped around nucleosomes and is 10 nm in diameter). (B) Handcuff model: each sister chromatid is encircled by separate cohesin rings and two rings then associate with each other (1,2) or interconnect (3) resulting in cohesion of sister chromatids.

Модель 'кольца' (Figure 2A) исторически доминирует. Эта модель предполагает, что одно единственное cohesin кольцо может окружать две нити ДНК, удерживая их вместе [20,27,28] и это подтверждается экспериментальными результатами, показывающими, что выпрямление (linearization) циркулярных минихромосом у дрожжей с помощью рестрикционного переваривания вызывает диссоциацию cohesin с ДНК [8]. Кроме того, взаимодействия между множественными cohesin комплексами были необнаружимы с использованием FRET (fluorescence resonance energy transfer) технологии и экспериментов по ко-иммунопреципитации в клетках, экспрессирующих две по-разному нагруженные копии одной и той же cohesin субъединицы [11,29]. Более того, химическое поперечное связывание трехсоставных cohesin колец продуцирует ДНК-cohesin комплексы, которые нечувствительны к денатурации белка, тем самым строго доказывая, что слипчивость между молекулами ДНК обеспечивается с помощью одиночнгго cohesin кольца, которое охватывает обе сестринские хроматиды [30].
Альтернативная модель двух 'наручников' (Figure 2B) , в которой каждая сестринская хроматида окружается одним cohesin кольцом, и дав кольца затем ассоциируют др. с др. или соединяются, приводя к слипанию нитей ДНК. Хотя модели кольца отдается предпочтение в последние годы, новые доказательства возрождают модель наручников. В противоположность исследованиям, описанным выше, само-взаимодействие Scc1 субъединицы было выявлено в дрожжевом двугибридном исследовании, которое было подтверждено на клетках млекопитающих, экспрессирующих нагруженные белки, это подтверждает присутствие более высокого порядка cohesin комплекса [31]. Это согласуется с исследованием, показавшим, что cohesin способен охватывать только одну сестринскую хроматиду в транскрипционно молчащих гетерохроматиновых регионах, которые имеют более крупный диаметр из-за более сильной компакции хроматина [32]. Однако возможно, что этот механизм слипчивости специфичен для транскрипционно молчащих регионов и что транскрипционно активные регионы могут окружаться одиночным кольцом.

COHESIN LOADING


У низших эукариот cohesin ассоциирует с ДНК в конце G1-фазы [9,10,33]. Напротив, cohesin собирается на ДНК в клетках млекопитающих после образования ядерной оболочки во время телофазы [34]. Это отличие может быть обусловлено разными регуляторными механизмами на месте, чтобы поддерживать и удалять cohesin, или может быть обусловлено различием в функциях cohesin помимо его канонической роли в расхождении хромосом (см. ниже). Было продемонстрировано, что взаимодействие cohesin с ДНК как у высших, так и низших эукариот становится более стабильным по мере перехода от G1 к S к метафазе [35,36] и, несмотря на временные отличия, загрузка cohesin у всех организмов, по-видимому, нуждается в гидролизе АТФ [22,23,37] и в белковом комплексе Scc2-Scc4 (Nipped-B у Drosophila) [38-41]. Хотя специфический механизм обеспечиваемой Scc2-Scc4 загрузки cohesin остаётся неясным, предполагается, что белок Scc2 взаимодействует мимолетно с cohesin, чтобы поспособствовать гидролизу АТФ с помощью SMC головок, приводя к тому, что шарнир SMC димера открывается или происходит диссоциация Scc1 [22]. Интересно, что Scc2-Scc4 комплекс не играет роли в поддержании ассоциации cohesin с ДНК, поскольку cohesin быстро и независимо перемещается прочь с места хромосомной загрузки в области конвергентной транскрипции [33].
Хотя загрузка cohesin в целом зависит от Scc2-Scc4, имеются некоторые примеры, когда загрузка cohesin, по-видимому, осуществляется независимо от Scc2-Scc4. В клетках человека комплекс Scc2-Scc4, как было установлено, диссоциирует от хромосом во время митозов, это, по-видимому, ингибирует повторную ассоциацию cohesin вплоть до телофазы, когда Scc2-Scc4 и cohesin воссоединяются [34,41]. Однако во время пре-анафазы центромеры 'breathing', процесс, который происходит, когда сестринские хроматиды скоротечно расщепляются под натяжением митотического веретена, cohesin перезагружается на временно разделившиеся хроматиды независимым от Scc2-Scc4 способом [42], подтверждая, что альтернативный и ещё не установленный механизм загрузки cohesin может существовать на этой стадии клеточного цикла.

COHESION ESTABLISHMENT DURING ДНК REPLICATION


Традиционно слипчивость сестринских хроматид может устанавливаться только во время репликации ДНК. Однако ассоциация cohesin с ДНК происходит рано в клеточном цикле и как полагают не нуждается в новой загрузке cohesin [43]. Становление cohesion, но не поддержание, как было установлено, зависит от lysine acetyltransferase Eco1 (establishment of cohesion 1; известна как Eso у S. pombe и Esco1 и Esco2 у человека)[44,45]. Eco1 физически ассоциирует с многочисленными членами комплекса репликации ДНК, включая два высоко гомологичных RFC (replication factor C) clamp loader белка, Ctf18 (chromosome transmission fidelity 18) и Elg1 (enhanced level of genomic instability 1), каждый из которых играет важную роль в установлении слипчивости [46,47], и PCNA (proliferatingcell nuclear antigen) [48], который генетически ассоциирует с Ctf4 и является частью комплекса, обеспечивающего ход репликации [49]. Интересно, что Eco1, как было установлено, также соединяется с XPD членом семейства ДНК-helicase, Chl1 [chromosome loss 1; DDX11 (DEAD/H box polypeptide 11) у человека], который играет роль в установлении слипчивости [50-53]. Подобно Eco1, Chl1 ассоциирует с членами комплекса репликации ДНК, такими как RFC и PCNA [48,52,54]. Эти результаты предоставляют строгие доказательства того, что становление слипчивости интимно связано с PCNA-зависимой репликацией ДНК и что Eco1 может функционировать, делая возможной диссоциацию cohesin колец или прохождение аппарата репликации через cohesin кольца, гарантируя становление слипчивости и завершение репликации ДНК. В подтверждение этому было показано, что ацетилирование cohesin необходимо для репликационной вилки и в отсутствие RFCCTF18 как репликация, так и ацетилирование cohesin тяжело нарушены, демонстрируя тем самым, что ацетилирование cohesin необходимо для продвижения репликационной вилки [55]. Облегчает ли Eco1 один или в сотрудничестве с Chl1 открытие cohesin кольца и прохождение репликационной вилки, сопровождаемое вторичным лигированием кольца, чтобы окружать обе сестринские (модель кольца), или облегчать закрепление новых cohesin колец, закладываемых в S-фазе на уже загруженных кольцах, как только пройдет аппарат репликации (модель наручников), предстоит определить [56]. Было предположено, что хотя становление слипчивости или скорее повторное установление во время breathing центромер не зависит от Scc2-Scc4, Eco1 необходим, базируясь на доказательстве, что Eco1-зависимое установление слипчивости может происходить в отсутствие репликации ДНК [42].
Eco1, как было установлено, ацетилирует компоненты cohesin комплекса in vitro [57], но потребность в этой активности для установления слипчивости дискуссионна [58]. Однако недавние исследования показали, что субъединица Smc3 в cohesin ацетилируется с помощью Eco1 in vivo по двум высоко консервативным лизиновым остаткам [59-61]. Мутации обоих этих лизиновых остатков в Smc3 ингибируют ацетилирование и приводят к летальному дефекту слипчивости. Напротив, мутации обоих лизиновых остатков на asparagine или glutamine, которые имитируют ацетилированное состояние, устраняет потребность в экспрессии Eco1, во всём остальном важного белка [61]. Ацетилирование Smc3 с помощью Eco1 происходит только в начале S-фазы и супрессируется во время G1, G2 и митотической фазы [60]. Это может предоставить механизм, с помощью которого cohesin только и становится слипчивым по мере синтеза сестринских хроматид. Помимо Eco1, вторая acetyltransferase наз. San, которая существует только у метазоа, как было установлено, важна для стабилизации слипчивости центромерных сестринских хроматид во время митозов [62]. Важна ли эта acetyltransferase становления или поддержания слипчивости центромер, остаётся неясным. Возможно, что активность acetyltransferase San необходима для поддержания слипчивости центромер во время breathing центромер, гипотеза, которую необходимо проверять.
Ассоциирвоанные с cohesin белки Wpl1 [wings apart-like 1; Rad61 у S. cerevisiae, Wapl у Drosophila и Wapal у позвоночных] и Pds5 (precocious dissociation of sisters 5) вместе формируют комплекс [63,64] и играют роль в ингибировании установления слипчивости, в т. наз. anti-establishment. У S. cerevisiae, было показано, что Wpl1-Pds5 комплекс ассоциирует с cohesin кольцами до тех пор, пока не произойдет Eco1-индуцированного ацетилирования субъединицы Smc3, это привело к гипотезе, что Wpl1-Pds5 комплекс ингибирует становление, когда связан с cohesin и что Eco1 действует, чтобы ингибировать это взаимодействие с помощью ацетилирования Smc3 во время S-фазы [65,66]. Эта функция Wpl1-Pds5 комплекса, по-видимому, законсервирована в клетках человека, т.к. поступательное перемещение вилки, как было установлено, нуждается в индуцированной ацетилированием диссоциации Pds5 и Wapal [55]. Кроме того, истощение Wapal, как было установлено, предупреждает удаление cohesin с хромосомных плеч, указывая тем самым, что Wapal также действует, чтобы ингибировать повторное становление слипчивости у высших организмов [63,64]. Исследования на белковых комплексах Xenopus и человека показали, что Wapal ассоциирует с Pds5 и cohesin посредством FGF (Phe-Gly-Phe) мотивов, которые как полагают, связывают HEAT [huntingtin, elongation factor 3, the PR65/A subunit of PP2A (protein phosphatase 2A) and the lipid kinase Tor] повторяющиеся мотивы, обнаруженные в Pds5 и белках семейства SA1/SA2. Предполагается, что ассоциация Wapal с cohesin таким способом может индуцировать конформационные изменения в cohesin кольцах, облегчая тем самым высвобождение с хроматидных плеч во время профазы, функция не существует у дрожжей [67].

COHESIN REMOVAL DURING MITOSIS


Как только все хроматиды залавливаются биполярным митотическим веретеном и выстраиваются в метафазную пластинку, слипчивость устраняется v; протеолитического расщепления Scc1 с помощью активированной cysteine protease separase, ДНК-зависимым способом [26,68]. Активация separase происходит в результате деградации её ингибирующего связывающего партнера securin с помощью ubiquitin ligase APC/C (APC/cyclosome), которая активируется вследствие удовлетворения checkpoint сборки веретена [69] (see [70] for a review on the spindle assembly checkpoint). Хотя это и является давно установленной моделью удаления cohesin во время митозов, предпринято множество работ на низших эукариотах, где доказательства указывают на то, что cohesin остается ассоциированным с хроматидами вплоть до начала анафазы. У метазоа cohesin удаляется сложнее и является высоко регулируемым двух-ступенчатым процессом. Когда клетки переходят от профазы к метафазе слипчивость хромосомных плеч теряется способом, который, по-видимому, не зависит от расщепления Rad21 (Scc1) с помощью separase. Однако слипчивость центромер защищена и остается вплоть до начала анафазы, когда она устраняется с помощью активированной separase, что делает возможной расхождение хромосом к противоположным полюсам веретена [34,71]. Потеря слипчивости плеч у метазоа зависит от активности Plk1 (polo-like kinase 1) [72-74]. Plk1 может фосфорилировать как Rad21, так и SA2 (Scc3) субъединицы cohesin in vitro [72,73]. У S. cerevisiae было показано, что фосфорилирование Scc1 с помощью Plk1 гомолога Cdc5 (cell division cycle 5) усиливает расщепление Scc1 с помощью separase [75,76] , описано также гиперфосфорилирование Scc1 на центромерах метафазных хромосом в экстрактах Xenopus [77]. Сообщалось также, что фосфорилирование SA2 (Scc3) с помощью Plk1 в клетках позвоночных важно для снижения сродства и диссоциации cohesin в хромосомных плеч во время профазы [78].
Хотя профазный путь удаления cohesin, как полагают, отсутствует у низших эукариот, недавнее исследование показало, что это может быть не так. После вступления в митоз динамика cohesin у S. pombe , по-видимому, связана с той, что наблюдается у метазоа как потеря фракции cohesin с хромосом, она наблюдалась, как только клетки вступали в митоз [79]. У высших эукариот cohesin ассоциирует с хроматином с помощью разных способов связывания: один стабильный, устанавливается в S-фазе и удаляется с помощью расщепления Scc1 и др., чрезвычайно динамичный и, как полагают, необходимый для регуляции транскрипции и репарации поврежденной ДНК [36]. Это указывает на то, что существование двух разных способов связывания cohesin в ходе клеточного цикла может быть законсервировано у разных модельных организмов. Однако необходимы дальнейшие работы, чтобы выяснить роль этих способов связывания cohesin у низших эукариот и существуют ли сходные пути удаления cohesin во время митозов в этой модельной системе. В клетках позвоночных, ассоциированный со слипчивостью белок sororin может играть важную роль в регуляции стабильной ассоциации cohesin и хроматина. Sororin, как было установлено, важен для слипчивости сестринских хроматид и деградирует с помощью APC/C в G1 клеточного цикла [80]. Избыточная экспрессия sororin предупреждает расхождение сестринских хроматид в начале анафазы, а истощение вызывает преждевременное расхождение сестринских хроматид. Кроме того, истощение sororin вызывает существенную редукцию в стабильно связанном пуле cohesin, который существует после становления когезии в S-фазе [81]. В свете этих результатов было предположено, что sororin может функционировать в установлении стабильно связанного cohesin, а деградация когда клетки вступают в G1-фазу может предупреждать повторное становление этого стабильного пула cohesin до инициации репликации ДНК.
Активная защита центромерного cohesin вплоть до начала анафазы нуждается в рекрутировании 'guardian spirit' белка Sgo1 [Shugoshin 1; Mei-S332 (meiotic from via Salaria 332) у Drosophila] на центромеры во время профазы [82,83]. Помимо его роли в защите центромерной слипчивости, Sgo1 важен для стабилизации микротрубочек и для зависимого от микротрубочек натяжения между сестринскими хроматидами [83] и, как было установлено, накапливается на кинетохорах вплоть до начала анафазы, когда происходит биполярное присоединение и натяжение внутренних кинетохор. Роль Sgo1 в ощущении натяжения может осуществляться посредством его способности рекрутировать Plk1 на кинетохоры, т.к. недавно было показано, что истощение Sgo1 ведет к снижению накопления Plk1 на кинетохорах и последующему снижению Plk1-зависимого 3F3/2 phospho-epitope, важного для механизма восприятия натяжения [84]. Рекрутирование Sgo1 на центромеры нуждается как в spindle checkpoint kinase Bub1 (budding uninhibited by benzimidazole 1) и в Aurora B kinase [84-88], которые, как было установлено, фосфорилируют Sgo1 in vitro [84]. Интересно, что истощение Bub1 или Aurora B заставляет Sgo1 локализоваться вдоль длины хромосом скорее, чем концентрироваться в центромерах, указывая тем самым, что эти киназы необходимы для определения региона на каждой хромосоме, где персистирует слипчивость [84,86]. Интересно, что Aurora B, как было установлено, играет роль в рекрутировании separase на хромосомы на ранних стадиях митоза [89]. Хотя точная роль рекрутирования separase в раннем митозе неясна, авт. этого исследования полагают, что separase может быть необходима для удаления cohesin с плеч во время профазного пути, но пока это остается спекулятивным.
Figure 3 Model for the role of cohesin at silent domains Top panel: Scc1 associates with the silent domain preventing the establishment of silencing until the creation of cohesin-associated boundary elements. This prevents the unwanted spread of silent heterochromatin. Middle panel: following establishment of the boundary elements, Scc1 is cleaved and the spread of Sir proteins can occur. Bottom panel: once silent heterochromatin is developed, cohesin (orange rings) re-associates to stabilize the domain, preventing unwanted recombination.

Центромерный cohesin теряется вследствие истощения Sgo1 с помощью RNA interference, приводя к преждевременному разделению хроматид. Экспрессия неспособного к фосфорилированию белка SA2 в этих клетках предупреждает потерю центромерной слипчивости, предоставляя тем самым доказательство, что Sgo1 предупреждает фосфорилирование cohesin, расположенного в центромере [82]. Sgo1 соединяется с PP2A с высоким сродством м поэтому считается, что Sgo1 предупреждает фосфорилирование cohesin путем рекрутирования PP2A, быстро переключая фосфорилирование cohesin с помощью Plk1, ингибируя тем самым его высвобождение [90-92]. Интересно, что предупреждение фосфорилирования Scc1 с помощью PP2A, как было установлено, блокирует расщепление Scc1 только в присутствии Sgo1 [93] и поэтому предполагается, что Sgo1-зависимое рекрутирование PP2A на неприкрепленные кинетохоры ингибирует активность separase [94]. Пик уровня белка Sgo1 в митозе имеет в основе APC/C-зависимую деградацию в начале анафазы; было показано, что APC/C-обеспечиваемая деградация Sgo1 необходима для выхода из митоза и аккуратного расхождения хромосом [95]. Однако недавнее исследование противоречит этой находке и указывает на то, что деградация Sgo1 не является критической для прохождения через митоз [96]. Альтернативные механизмы инактивации Sgo1 после начала анафазы могут существовать и д. быть исследованы прежде, чем действительная роль деградации Sgo1 для хода митоза будет выяснена.

COHESIN AND THE CONTROL OF GENE EXPRESSION


Помимо его роли в расхождении хромосом cohesin, как давно уже предполагалось, выполняет и др. клеточные функции. Эта первоначальная гипотеза проистекает из доказательств, по крайней мере, на клетках позвоночных, что cohesin повторно ассоциирует с хромосомами в конце митоза, когда принято думать, что cohesin отсутствует на ДНК [34]. Эта повторная ассоциайия cohesin происходит прежде чем установится слипчивость сестринских хроматид в следующем клеточном цикле и это указывает на то, что cohesin может выполнять функцию, независимую от его роли в слипчивости. Более того, болезни человека, такие как CdLS (Cornelia de Lange syndrome) и Roberts синдром ассоциируют с мутациями субъединиц cohesin, таких как Smc1 и Smc3, или cohesin loader NIPBL [Nipped-B homologue (Drosophila)] (Scc2) [97-99]. Эти заболевания имеют фенотипы, которые включают задержку роста и умственного развития, черепно-лицевые аномалии и микроцефалию, но что неожиданно, дефекты клеточного цикла ограничены и не могут сами по себе объяснить наблюдаемые тяжелые фенотипы. Кроме того, эти мутации не демонстрируют повышенной предрасположенности к карцинома, это подкрепляет доказательства, что cohesin имеет и др. клеточные функции помимо его ролт в слипчивости сестринских хроматид и аккуратном расхождении хромосом.
Первые доказательства, что cohesin важен для контроля за транскрипцией генов были получены в исследовании, показавшем, что позиционирование cohesin на хроматине драматически влияет на транскрипционную активность у S. cerevisae. ChIP (chromatin immunoprecipitation) эксперименты выявили, что инициация транскрипции в сайтах, связанных с cohesin приводит к локальной дисстоциации cohesin м хроматина и что субъединицы cohesin повторно локализуются от их инициального места загрузки в места конвергентной транскрипции [33,100]. Эти результаты указывают на то, что когда аппарат транскрипции перемещается вдоль ДНК и сталкивается с прикрепленными cohesin кольцами, то аппарат настолько велик, что не может проходить сквозь кольца и поэтому толкает их пока не закончится транскрипция. Этот феномен был использован для объяснения, почему молекулы cohesin у дрожжей накапливаются в местах конвергентной транскрипции.
Figure 4 Structure of the β-globin locus Looping of the β-globin locus is created by the interaction of CTCF (green) and cohesin (orange rings), allowing for long-range spatial interactions between the LCR (dark blue) and active genes. The association of cohesin rings at the CTCF-binding sites within the 5? and 3? ДНКse I-hypersensitive regions creates as a barrier, preventing interaction of the β-globin locus and regulatory elements of neighbouring genes.

Активная функция накопления cohesin в местах конвергентной транскрипции позднее была открыта у S. pombe [101]. Это исследование показало, что накопление cohesin колец может действовать как барьер между кодирующими регионами с целью эффективного окончания транскрипции. Конвергентные гены у S. pombe, как было установлено, генерируют перекрывающиеся транскрипты в G1 из-за неэффективного завершения транскрипции, тогда как в G2, когда присутствует cohesin, перекрывающиеся транскрипты более не обнаруживаются. Подтверждает это то, что потеря члена семейства HP1 (heterochromatin protein 1) Swi6 (switching deficient 6), необходимого собственно для доставки cohesin в центромеры, или самого cohesin в G2-фазе, ведет к появлению перекрывающихся транскриптов, которые обычно отсутствуют на этой стадии клеточного цикла [101]. Завершение транскрипции особенно важно для генов, расположенных в конвергентной ориентации, поскольку неспособность polymerase II комплексов завершить транскрипцию ведет к ингибированию генной экспрессии из-за коллизии комплексов элонгации [102].

Chromatin silencing


Гетерохроматиновые регионы по большей части транскрипционно молчащие и, как полагают, выполняют несколько функций от генной регуляции до защиты целостности хромосом. Эти области ДНК транскрипционно молчащие поскольку они недоступны для ДНК-модифицирующих энзимов и поэтому транскрипционная элонгация блокирована [103]. У S. cerevisiae существует три класса молчащих доменов: молчащие локусы типов спаривания, HMR и HML, теломеры и rДНК (ribosomal ДНК). HMR и HML молчащие домены содержат скрытые копии аллелей локусов спаривания MATa и MATα, соотв. Эти гены в HML и HMR не экспрессируются, но служат в качестве хранилища генетической информации, которая после транспозиции с помощью HO endonuclease вызывает у дрожжей переключение с одного типа спаривания на др. Домены HMR и HML остаются молчащими благодаря действию фланкирующих регуляторных элементов, известных как silencers [104]. rДНК состоит из тандемного набора единиц в 9.1 kb, повторенных 100-200 раз на хромосоме XII [105]. Такая повторяющаяся ДНК является предметом рекомбинации, а избыточная рекомбинация домена rДНК может быть вредной. Регуляция рекомбинации, как полагают, использует Sir2 (silencing protein 2) [106]. 4 SIR гена имеются у дрожжей и были идентифицированы с помощью мутаций, которые активируют молчащие гены типов спаривания [107]. Sir2, Sir3 и Sir4 важны для замалчивания, поскольку их роль служить структурными компонентами молчащего хроматина [108]. Как только эти SIR белки рекрутируются на silencer, то кооперативные взаимодействия позволяют им распространиться по всему молчащему локусу, при этом Sir3 и Sir4 соединяются с деацетилированными хвостами гистонов H3 и H4 [109].
Cohesin-связывающие сайты были открыты в молчащих локусах S. cerevisiae, включая области, соседствующие с теломерами и MR локус [110]. Интересно, что концентрация cohesin была описана в LTR (long terminal repeat) Ty2 ретротранспозона, который, как было установлено, вносит вклад в функцию пограничного элемента в границах HMR [110]. Накопление cohesin в молчащих доменах привело исследователей к предположению, что cohesin играет важную функцию в молчании хроматина. В самом деле, накапливаются доказательства, что cohesin играет позитивную роль в формировании молчащего хроматина у дрожжей. Первоначально было показано, что cohesin рекрутируется на HMR локус Sir-protein-зависимым способом [32]. Это согласуется с результатами, показавшими, что Sir2 обеспечивает ассоциацию Scc1 с rДНК [111]. Гены, которые кодируют рРНК, образуют кластер в LTRs , а гены с такой повторяющейся структурой, в целом, как полагают нестабильны из-за высокой частоты рекомбинантных событий. Sir2 играет важную роль в снижении частоты рекомбинации rДНК [106]. Интересно, что снижение ассоциации cohesin субъединицы Scc1 с rДНК было описано в мутантных Sir2 линиях [111]. Поэтому было предположено, что Sir2 предупреждает неравную рекомбинацию сестринских хроматид, возможно путем образования ДНК с помощью cohesin. Молчащим хроматином обусловленное рекрутирование cohesin может выполнят сходную функцию с молчащими локусами типов спаривания, где пострепликативная рекомбинация между гомологичными последовательностями в HMR, HML и MAT может приводить к незапрограммированному переключению типов спаривания или летальным хромосомным делециям. В подтверждение этому мутантные по cohesin клетки обнаруживают подобные перестройки [112].
Идея, что cohesin может стабилизировать молчащий хроматин и предупреждать рекомбинацию также был продемонстрирован на S. pombe [113]. Область типа спаривнаия содержит три сцепленных локуса, наз. MAT1, MAT2 и MAT3, при этом MAT2 и MAT3 служат в качестве доноров для переключения MAT1 в механизме, сходном с таковым для HMR и HML локусов у S. cerevisiae. Было показано, что дискретная область в 20 kb содержащая MAT2 и MAT3 собирается в гетерохроматиновую структуру, а cohesin рекрутируется на эту область Swi6-зависимым способом. Хотя cohesin, , по-видимому, не влияет на локализацию Swi6 и замалчивание MAT локуса, он , как было показано, у мутантов продуцирует колонии, дефектные по переключению, со скоростью почти в 100 раз большей чем у особей дикого типа [113]. Кроме того, дефекты рекрутирования cohesin у Swi6 мутантов могут быть частично ответственны за усиление перестроек в локусе MAT. Эти результаты указывают на то, что cohesin рекрутируется на молчащий хроматин, чтобы регулировать рекомбинацию и является важным для предотвращения нежелательной рекомбинации в таких нестабильных регионах (Figure 3).
Напротив, cohesin, как было установлено, ингибирует становление молчащего хроматина. Исследование Lau et al. [114] показало, что замалчивание HMR домена предупреждается присутствием Scc1 во время G2/M, даже в присутствии Sir белков. Разрыв или репрессия Scc1 во время клеточного цикла ведет к молчанию HMR домена, а ингибирование разделения Scc1 репрессирует молчание [114]. Кроме того, предполагается, что последовательности вблизи раздела доменов молчания и не-молчания д. включать элементы границ. Чтобы проверить это ряд элементов границ целенаправленно удалялся, чтобы установить, станут ли соседние репортерные гены неактивными из-за распространения молчащего хроматина от HMR локуса. Из многочисленных протестированных структурных белков хромосом только мутации в субъединицах Smc1 и Smc3, как было установлено, обнаруживают существенные эффекты на функцию границ [115]. Smc белки, как было установлено, являются частью ядерного каркаса и, как полагают, используются для организации хромосомных петель [116], т.о., выявляется связь insulator функции cohesin в HMR с моделями, в которых функция insulator элемента зависит от архитектуры хромосом (Figures 4 and 5). Исследование Donze et al. [115] подтвердило, что белки, участвующие в структурах высшего порядка хромосом, могут участвовать в функциональном вычленении хромосом и что образование крупных мультипротеиновых комплексов на границе молчащего хроматина предупреждает распространение гетерохроматина (Figure 3).

Control of transcription


В клетках млекопитающих cohesin не концентрируется в местах конвергентной транскрипции, но на гиперчувствительных к ДНКse I сайтах [117]. Эти сайты, как было установлено, содержат избыточное содержание консенсусной последовательности CTCF (CCCTC-binding transcriptional insulator protein) [117,118]. CTCF является повсеместно экспрессирующимся белком, который содержит 11 zinc-finger мотивы. Его экспрессия регулируется клеточным циклом, с пиком с S- по G2-фазу [119]. Известно, что истощение CTCF нарушает специфическое позиционирование субъединиц cohesin Rad21 (Scc1) и Smc3, но истощение cohesin не влияет на позиционирование CTCF [117]. CTCF-связывающие сайты часто оказываются на флангах групп генов, которые транскрипционно ко-регулируются, указывая тем самым, что большинство CTCF-связывающих сайтов функционируют в качестве изоляторов (insulators) [120]. Инсуляторы это генетические элементы вблизи границ хроматиновых доменов, которые участвуют в изменении генной экспрессии. Они действуют как барьеры, которые защищают гены от позиционных эффектов, чтобы предупреждать распространение репрессивного гетерохроматина с одного домена на следующий [121]. Кроме того, они могут предупреждать коммуникации между удаленными элементами, такими как энхансеры, чтобы влиять на экспрессию генов, эта функция известна как блокирование энхансеров [122].
Существует ряд генов, которых ограничиваются (insulated) с помощью CTCF. Первый набор генов, которые ограничиваются CTCF, чтобы insulate способом блокирования энхансера, это локус β-globin гена, который содержит ряд онтогенетически регулируемых erythroid-специфичных генов. CTCF обнаруживается на 5' и 3' границах хроматина локуса β-globin кур [123] и CTCF-связывающие сайты были также обнаружены на флангах эквивалентных генных локусов мыши и человека [124]. Исследования блокирования энхансеров показали, что связывание CTCF на границах генных локусов у мыши и человека приводит к транскрипционной insulation за счёт предупреждения несанкционированных взаимодействий между регуляторными элементами β-globin и таковыми в соседних доменах [124]. Получены доказательства, что CTCF обеспечивает образование петель хроматина на большие расстояния в β-globin локусе (Figure 4) [125]. У мышей три CTCF-связывающих сайта, два выше и один ниже локуса, они участвуют в пространственных взаимодействиях между LCR (locus control region) и активными β-globin генами, формируя активный хроматиновый узел (hub) [126]. Нарушение связывания CTCF в нижестоящем сайте связывания приводит к дестабилизации петли [125]. Чтобы определить, важен ли cohesin для insulator функции CTCF, клетки истощались или по CTCF или по Rad21 белку, транскрипционные изменения измеряли с помощью ДНК-chip технологии. Одинаковые транскрипционные изменения наблюдались после подавления CTCF или Rad21, а гены внутри сайтов в 25 kb, богатых cohesin, обнаруживали сильную тенденцию усиливать свою активность скоре, чем подавлять её, это согласуется с заключением, что cohesin обеспечивает инсуляторную функцию CTCF [118]. Было также показано, что cohesin играет роль в инсуляторной функции CTCF благодаря инсерции двух копий известного CTCF-зависимого insulator между геном neomycin и ассоциированным SV40 (simian virus 40) энхансерным и промоторным элементом. Истощение CTCF в клетках, содержащих эту конструкцию, приводит к усилению экспрессии neomycin и неожиданно сходные результаты получены после истощения Rad21 [117]. это указывает на то, что cohesin участвует в CTCF-зависимой транскрипционной insulation благодаря созданию барьера в CTCF сайтах, где ассоциированный cohesin блокирует гены от ассоциированных энхансерных элементов. Тот факт, что он нуждается в двух CTCF-зависимых insulator последовательностях между геном и энхансерным/промоторным элементами, чтобы обеспечить insulation, указывает на то, что cohesin вызывает insulation путем создания структуры петли внутри ДНК (Figure 4).
CTCF также участвует в импринтинге IGF2 (insulin-like growth factor 2)/H19 (H19 fetal liver mRNA) локуса мыши. Гены IGF2 и H19 расположены на хромосоме 7 на расстоянии 90 kb один от др. Эти два гена реципрокно импринтируются у развивающихся эмбрионов с отцовской экспрессией IGF2 и материнской экспрессией H19 [127]. Ряд энхансеров, стоящих ниже гена H19 участвует в регуляции экспрессии IGF2 и H19. Считается, что CTCF ограничивает этот локус благодаря связыванию с DMRs (differentially methylated regions), тем самым insulating материнский локус IGF2 [128] (Figure 5B). DMRs в IGF2 локусе соединяются др. с др. посредством взаимодействий с CTCF и др. белками, создавая петли, которые участвуют в insulation локуса [129,130]. Подтверждает это то, что ассоциация CTCF с ДНК , как было установлено, чувствительна к метилированию, т.к метилирование DMR в отцовском локусе предупреждает связывание CTCF, приводящее к пренебрежению локуса H19 и к активации экспрессии IGF2 (Figure 5C) [131]. Для подтверждения этих результатов, исследовали эффект метилирования H19/IGF2 локуса с помощью Hcy (homocysteine), который вызывает гипометилирование ДНК. Воздействие Hcy ведет к гипометилированию CTCF-связывающих сайтов выше локуса H19 и к увеличению мРНК H19 одновременно со снижением экспрессии мРНК IGF2 [132].
Cohesin также участвует в CTCF-зависимой insulation локуса IGF2/H19 [133]. Используя чувствительный к метилированию PCR, было показано, что субъединица cohesin SA1 ассоциирует с CTCF-связывающими сайтами в локусе IGF2/H19 аллель-специфическим способом. CTCF , как было установлено, участвует в образовании петель между хромосомами в β-globin [125] и IGF2/H19 локусах [129]. Следовательно, вполне возможно, что cohesin помогает создавать такие петли путём создания мостиков с помощью модели наручников, рассмотренной выше (Figures 2, 4 and 5). Создание межхромосомных петель в локусе IGF2/H19с помощью cohesin и CTCF было подтверждено с использованием метода 3C (chromosome conformation capture) и с помощью RNA interference деплеции cohesin [134]. Когда cohesin был истощен, то конформация хроматина высшего порядка в локусе разрушалась, это в свою очередь нарушало insulation гена IGF2 [134]. Кроме того, было показано, что cohesin необходим для дальнодействующий CTCF-зависмых взаимодействий в онтогенетически регулируемом локусе IFNG (interferon γ) cytokine [135]. Используя 3C метод, было показано. что локус IFGNсодержит топологические петли, а истощение или CTCF или cohesin ведет к потере этих петель, тем самым продемонстрировано, что CTCF и cohesin важны для дальнодействующих взаимодействий между сайтами ДНК [135]. CTCF и cohesin также необходимы для транскрипционной insulation IL-3 (interleukin 3) и GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating-factor) кластера генов. Эти гены ответственны за те же самые сигналы, но регулируются независимо с помощью ткане-специфических энхансеров. Расположенные между двумя генами CTCF-связывающие сайты, которые рекрутируют CTCF и cohesin, чтобы блокировать взаимодействия между различными энхансерными и промоторными элементами, делая возможной независимую регуляцию генной экспрессии [136].


Figure 5 Arrangement of the IGF2/H19 locus and structural rearrangements resulting in maternal and paternal imprinting (A) Situated between the IGF2 and H19 genes are three DMRs. Each gene is transcribed from a unique promoter (arrows). (B) The maternal locus contains unmethylated DMR allowing association of CTCF (green) and cohesin rings (orange rings) with these domains. This leads to the formation of a loop between DMR1 and DMR, blocking the access of IGF2 to the enhancer elements resulting in insulation of the gene. (C) The paternal locus contains methylated DMRs, which results in abrogation of CTCF and cohesin binding. This allows interaction of DMR2 and DMR resulting in enhancement of IGF2 gene expression from cis-acting enhancer elements.




Известно, что сходная CTCF-зависимая роль cohesin наблюдается в KSHV (Kaposi's sarcoma-associated herpes virus). CTCF-связывающие сайты существуют в большой латентной контролирующей области у KSHV, а cohesin ко-локализуется с CTCF в этой области, указывая тем самым, что CTCF и cohesin действуют как insulators в геноме KSHV [137]. Истощение CTCF приводит к потере ассоциации cohesin и к несоотв. Экспрессии литических генов. Интересно, что экспрессия генов,регулируемых с помощью CTCF и cohesin, контролируется зависимым от клеточного цикла образом, а мутации CTCF-связывающих сайтов приводят к нарушению фазово-зависимой экспрессии генов. Это указывает на то, что CTCF и cohesin комплекс совместно играют роль в регуляции зависимой от клеточного цикла экспрессии генов во время латентности, предупреждая тем самым нарушение пролиферации клетки хозяина [138]. Сходная роль CTCF в предупреждении несоответствующей экспрессии литических генов, как это было продемонстрировано на HSV1 (herpes simplex virus type 1), подтверждает, что это может быть консервативным механизмом, который ДНК вирусов используют для контроля генной экспрессии.

COHESIN AND ДНК DAMAGE REPAIR


В последние годы стало очевидным, что cohesin играет важную роль в репарации повреждений ДНК. Эукариоты используют два механизма репарации повреждений ДНК: NHEJ (non-homologous end-joining) и HR (homologous recombination). HR осуществляется с использованием гомологичной матрицы для репарации повреждений. Обычно матрицей является сестринская хроматида, , следовательно, HR происходит с S- по G2-фазу. NHEJ вызывает непосредственное воссоединение концов ДНК и поэтому склонна к ошибкам в отличие от HR. Легко предвидеть, как cohesin может облегчать HR путем удержания гомологичных матриц в тесной близости к поврежденной нити ДНК. В самом деле исследования на дрожжах продемонстрировали, что слипчивость возникающая в S-фазе необходима для эффективной репарации поврежденной ДНК в G2-фазе [141]. Более того, повреждения ДНК вызывают пострепликативную загрузку cohesin в район DSB (double strand break) [142,143]. Это оказалось неожиданным, поскольку ранее было показано, что загрузка cohesin и возникновение слипчивости происходят в поздней G1- и S-фазе, соотв. [38,144].
Каковы же молекулярные компоненты необходимы для этого процесса? Вообще-то неудивительно, что когезин загружающий белок Scc2 необходим для этой вызываемой повреждениями пострепликативной загрузки cohesin [142,143]. Кроме того, первичные checkpoint киназы Mec1 (mitosis entry checkpoint 1) и Tel1 (telomere maintenance 1) необходимы, но действуют перекрывающимся способом [143]. Фосфорилирование гистона H2AX с помощью Mec1/Tel1 генерирует то, что известно как γ-H2AX. Сигнал γ-H2AX распространяется, по крайней мере, на 60 kb места разрыва, тогода как cohesin простирается на 40-50 kb от разрыва. Линии, экспрессирующие не фосфорилированный H2AX неспособны рекрутировать cohesin, указывая тем самым, что γ-H2AX может действовать как сигнал для сборки cohesin. Mre11 (meiotic recombination 11), компонент комплекса, определяющего повреждения ДНК MRX [Mre11/Rad50/Xrs2 (X-ray-sensitive 2)], также необходим для сборки cohesin вокруг DSB, но он не устраняет образование γ-H2AX, указывая тем самым, что Mre11 используется независимым путём [143]. Помимо загрузки cohesin на места DSB, повреждения ДНК индуцируют также пострепликативное возникновение слипчивости [142,145] и как было установлено, индуцированная повреждениями ДНК слипчивость устанавливается по всему геному и не ограничена только местом разрыва [146,147]. Любопытно, что вызванная повреждением слипчивость нуждается в Eco1 и Scc2, подтверждая тем самым, что вновь загруженный cohesin используется для становления индуцированной повреждениями слипчивости.
У S. cerevisiae, митотический и мейотический cohesin содержит разные субъединицы kleisin, Scc1 и Rec8 (recombination 8) соотв. Замена Scc1 на Rec8 в митотических клетках ведет к неспособности репарировать DSB [148]. Важно, что Rec8 когезина неспособен стать когезивным после повреждения ДНК. Дальнейший анализ выявил, что Chk1 (checkpoint kinase 1)-обусловленное фосфорилирование Ser83 в Scc1 является критическим детерминантом для индуцированной DSB слипчивости. DSB-индуцированное фосфорилирование Ser83 готовит (primes) Scc1 к ацетилированию с помощью Eco1 и противодействует активности Wpl1 (see above) [149]. Слипчивость в S-фазе, с др. стороны, зависит от ацетилирования Smc3. Т.о., Eco1-обеспечиваемое ацетилирование определенных мишеней в зависимости от фазы клеточного цикла, облегчает установление слипчивости за счёт противодействия Wpl1.
Во время не измененного клеточного цикла активный сайт separase блокирован с помощью белка securin, а деструкция securin в анафазе облегчает расщепление cohesin [69]. В ответ на повреждение ДНК дрожжевой гомлог securin, Pds1, стабилизируется, это, по-видимому, поддерживает слипчивость до тех пор, пока checkpoint клеточного цикла активирован и/или повреждение не будет репарировано [150]. Pds1 стабилизация, обеспечивается с помощью checkpoint киназ клеточного цикла Chk1 и Rad53. Chk1-зависимое фосфорилирование предохраняет Pds1 от ubiquitination с помощью APC, тогда как Rad53 предохраняет Pds1 от взаимодействия с ассоциированным с APC белком Cdc20 [151]. Было также предположено, что дефософорилирование Pds1 происходит после репарации повреждения ДНК [151].
Как упоминалось ранее, повреждения ДНК вызывают загрузку cohesin и возникновение слипчивости. Эти исследования были осуществлены с использованием S. cerevisiae, у которых одиночный DSB генерировался внутри локуса MAT на хромосоме III благодаря индукции HO endonuclease [143]. Однако недавнее исследование на S. pombe установило, что эпитопом-нагруженная версия Rad21 (Scc1) не загружается вокрух места DSB [152]. Отражает ли это на самом деле дивергенцию в реакции на повреждения ДНК между делящимися и S. cerevisiae или это отражает различия в условиях опыта, неясно. Было бы интересно посмотреть, происходит ли вызванная DSB слипчивость у S. pombe. Adachi et al. [152] идентифицировали множественные сайты фосфорилирования в Rad21 в экстрактах из асинхронных и митотически арестованных клеток. Один из таких сайтов фосфорилирования, Ser553, может играть роль в реакции на повреждения ДНК. Повреждения вследствие облучения УФЛ вызывали фосфорилирование Ser553 в Rad3 (который является гомологом Mec1)-зависимым способом. Фосфорилирование Ser553 наблюдалось ~2 ч спустя после передачи сигнала γ-H2AX, это указывает на то. что фосфорилирование Ser553 может играть роль в повторном вступлении в клеточный цикл после ареста checkpoint или выходя из митоза. Rad3-зависимое фосфорилирование Rad21 вследствие облучения УФЛ было продемонстрировано ранее, хотя сайты фосфорилирования не были установлены [153]. Хотя сигнальный путь может варьировать , Rad21/Mcd1 фосфорилирование после повреждения ДНК происходит как у делящихся дрожжей, так и S. cerevisiae. Остается посмотреть, обеспечивает ли повреждением индуцированное фосфорилирование Rad21 Eco1 ацетилирование и последующую слипчивость, как это наблюдалось у S. cerevisiae [149].
В клетках позвоночных существуют доказательства, что cohesin рекрутируется на DSBs. Удивительно, рекрутирование cohesin на DSBs зависит от др. SMC комплекса, Smc5-Smc6 [154]. У S. cerevisiae комплекс Smc5-Smc6, как было установлено, ко-локализуется с cohesin на неповрежденных хромосомах [155]. Более того, Smc5-Smc6 необходим для репарации повреждений ДНК и выполняет специфическую роль при HR [156]. Однако исследования с использованием делящихся дрожжей и S. cerevisiae получили противоречивые доказательства о рекрутировании комплекса Smc5-Smc6 для рекрутирования cohesin на DSBs [146,157]. У S. cerevisiae Smc6 необходим для индуцированной повреждениями слипчивости по всему геному, но не для повреждениями индуцируемой загрузки cohesin, тогда как у S. pombe, cohesin всё ещё рекрутируется в область DSBв отсутствие функционального Smc6 [146,157]. Интерпретация результатов этих исследований осложнена находкой, что истощение Smc5 [and Mms21 (mitochondrial splicing system 21) не-SMC субъединицы комплекса Smc5-Smc6] ведет к тяжелым неправильным расположениям хромосом в пластинке, тогда как деплеция Smc6 не ведет. Это указывает на то, что функция Smc5 не всегда зависит от её взаимодействия с Smc6 [158]. Дальнейшие исследования этого неясного комплекса Smc5-Smc6 помогут выяснить его роль в репарации DSB и динамике cohesin (rev. [159]).
Существуют и др. линии доказательств, подчеркивающих роль cohesin в DSBs. Рекрутирование cohesin на повреждение ДНК иллюстрируется иммунофлюоресцентным окрашиванием Smc1 и SA1 в месте индуцированного лазером повреждения ДНК [160]. Однако в последующем сообщении накопление cohesin не было выявлено после повреждения ДНК, индуцированного с помощью IR (ionizing radiation), а обнаруживалось только, когда использовался лазер высокой энергии [161]. Авт. считают, что такой высокой интенсивности лазер индуцирует локальное разрушение ядерной структуры и не отражает классических IRIF (IR-induced foci). В самом деле, когда использовались умеренные дозы IR (3-10 Gy) то обнаруживались фокусы образования на повреждениях ДНК checkpoint белков [напр., γ-H2AX, ATM (ataxia telangiectasia mutated), BRCA1 (breast cancer early-onset 1) и 53BP1 (p53-binding protein 1)] , но не субъединиц cohesin [161]. Это безусловно противоречит исследованию Potts et al. [154], которые продемонстрировали Smc5-Smc6-зависимое рекрутирование cohesin на DSBs с помощью метода ChIP; однако эти противоречивые результаты могут отражать различия в чувствительности между использвоанными методами. Недавнее исследование показало, что субъединицы cohesin локализуются на IR-индуцированных DSBs только во время S- и G2-фазы, но не в G1 [162]. Это указывает на активную роль комплекса cohesin в репарации DSBs, которая может быть уникальной для G2-фазы клеточного цикла и , следовательно, для реплицирующегося хроматина [162]. Данное исследование может дать некоторое объяснение расхождениям, описанным выше, и зависимому от клеточного цикла рекрутированию cohesin на DSBs, но необходимо более тщательное исследование.
Интересно, что Smc1 фосфорилируется по Ser957 и Ser966 вследствие повреждения от IR и УФ облучения, поддерживаемого с помощью ATM и ATR (ATM- и RAd3-related) соотв. [163-166]. Фосфорилированный Smc1 располагается на γH2AX фокусах, это отражает находки у S.cerevisiae, что когезин загружается на DSBs в тот же самый регион, что и сигнал γH2AX [143, 161,167, 168]. Фосфорилирование Smc3 также происходит вследствие IR ATM-зависимым способом [169]. Мутации в Smc1 или Smc3, которые предупреждают фосфорилирование приводят к упраздению реакции на повреждения ДНК, хотя точный механизм этого остается неясным [167, 169]. Предполагается, что АТМ-зависимое фосфорилирование субъединиц когезина вызывает слипчивость сестринских хроматид; однако доказательства индуцированной повреждениями ДНК слипчивости в клетках млекопитающих отсутствуют. Недавнее исследование показало, что расстояние между сестринскими хроматидами уменьшается вследствие индукции DSB [170]. Хотя непосредственная роль когезина не была продемонстрирована, разрушение локуса АТМ ведет к расстояниям между сестринскими хроматидами, сходными с таковыми в неповрежденных клетках [170]. Это указывает на то, что вследствие повреждения ДНК АТМ фосфорилирует когезин, приводя к возникновению слипчивости. Необходимы дальнейшие исследования для тестирования этого и в самом ли деле предполагаемые индуцированные повреждениями ДНК слипчивости ограничиваются местом DSB.
Подобно Pds1, securin также вовлечен в реакцию на повреждения ДНК. Securin взаимодействует с р53 и репрессирует транскрипционную активность р53 [171]. Securin также взаимодействует с NHEJ белками Ku70 и Ku80 [172]. В противоположность дрожжам повреждения ДНК индуцируют деградацию securin человека [173,174]. Принимая во внимание, что деградация securin высвобождает separase и последующее расщепление когезина, не является неожиданным, что securin деградирует вследствие повреждения ДНК. Однако securins необходимы для активности и локализации separase, это указывает на то, что securin прекрасно выполняет роль в патогенезе опухолей гипофиза. Вовлечение securin в возникновение опухолей вообще-то является результатом его роли в динамике когезина, репарации повреждений ДНК и его недавно выявленной роли в качестве транскрипционного фактора, который специфически регулирует G1->S переход [177].

COHESIN AND HUMAN DISEASES


Две болезни человека, известные как когезинопатии, характеризуются мутациями в субъединицах когезина и факторах становления когезина: CdLS и Roberts синдром. Интересным свойством этих болезней является то, что мутации в когезиновом комплексе оказывают ограниченный эффект на слипчивость сестринских хроматид и клеточные деления и, следовательно, вызываются изменениями в экспрессии генов. Эта гипотеза подтверждается исследованием на S.cerevisiae, мутации которых воспроизводят мутации, обнаруживаемые при когезинопатиях. Эти мутации оказывают незначительный эффект на слипчивость сестринских хроматид или жизнеспособность клеток, но ведут к дефектам транскрипционного контроля, молчанию генов и суб-нуклеарной организации хроматина [178]. CdLS вызывается мутациями или в гене NIPBL, который описан выше и кодирует человеческий ортолог Nipped B/Scc2 [98] или в Smc1- или Sms3-кодирующих генах [99]. У дрозофилы Nipped И, как было установлено, ослабляет когезином-обусловленное блокирование коммуникаций между промотором и энхансером благдаря способствованию дальнодействующих взаимодействий между промотором и энхансером. Nipped B и когезин ко-локализуются на активных транскрипционных единицах, а проверка когезин-связывающих сайтов показала, что когезин преимущественно соединяется с промоторной областью генов [179]. Связывание когезина с этими сайтами существенно снижается у NIPBL-мутантных CdLS пациентов, приводя к активации ассоциированных с когезином генов [180]. Картирование мутаций Smc1 и Smc3 у ряда пациентов с CdLS в известной структуре SMC шарнирного домена у Thermotoga maritima [181] и в Smc1 S.cerevisiae головном домене [182]. показало, что мутации преимущественно картируются в двуспиральном и шарнирном домене белков [97]. Эти мутации, как полагают, или вызывают angulation белков, нарушающую аппроксимацию головных доменов SMC, или мешающих связыванию акцессорных белков с когезиновым кольцом, таких как Scc2, которые д. устранять загрузку когезина на хроматин [97].
Синдром Roberts вызывается мутациями в гене ESCO2 , человеческом гомологе Eco1 S.cerevisiae [183]. Клетки, происходящие от пациентов с синдромом Робертса, как было показано, имеют дефекты слипчивости сестринских хроматид [184], характеризуются антипатией (repulsion) к гетерохроматину [185], указывая тем самым, что Esco2 может быть важным для становления когезина на гетерохроматиновых регионах. Интересно, что генные мутации, обнаруженные у пациентов с синдромом Робертса, преимущественно ассоциируют с потерей ацетилтрансферазной активности Esco2 [186], предоставляя тем самым доказательства, что его активность в самом деле важна для возникновения слипчивости. Интересно, что репликационные вилки в клетках при синдроме Робертса замедлены, демонстрируют, что перемещение вилки, регулируемое с помощью ацетилирования когезина и потеря этого механизма ведут к накоплению повреждений ДНК, которые могут вносить вклад в аномалии, наблюдаемые при синдроме Робертса [55].

SUMMARY


For a number of years cohesin has been seen as the master regulator of chromosome segregation. This tightly regulated function of cohesin has been explored in depth but there are still many unanswered questions as to how cohesin is loaded on to and associates with ДНК. Whether АТФ hydrolysis is required for hinge opening, Scc1 binding or Scc1 dissociation needs to be definitively answered. In vitro single molecule studies of fluorescently tagged proteins would enable determination of whether АТФ binding and hydrolysis occur simultaneously with hinge opening and/or Scc1 dissociation. In addition, careful analysis of the timing of АТФ hydrolysis within the cell cycle would help to determine whether hydrolysis is required for loading on to chromatin prior to S-phase or for replication-coupled cohesion establishment. Determining the stage at which АТФ hydrolysis occurs may also shed light on how cohesin holds ДНК strands together. If АТФ hydrolysis is indeed required for hinge opening and occurs during ДНК replication, one could hypothesize that this reflects ring opening as the replication fork progresses and would imply sister chromatid cohesion by single cohesin rings rather than a higher-order complex as described in the handcuff model. The molecular trigger for АТФ hydrolysis is also unclear. Determining the molecular events that lead to АТФ binding and hydrolysis will provide new insight into the requirement for АТФ in the multiple functions of cohesin. Possible stimuli could include post-translational modification of one of more cohesin complex subunits or interaction with other proteins at specific stages of the cell cycle. Indeed interaction with the cohesin loader Scc2/Nipped-B appears to promote АТФ hydrolysis, although the specific mechanism of action remains unknown. It is important to determine whether Scc2 has inherent enzyme activity or whether it functions in the cohesin loading pathway simply by recruiting other proteins to the cohesin complex. It would also be interesting to determine the timing and localization of the Scc2 interaction with cohesin and whether this only occurs during ДНК replication.
Whether the handcuff or ring model, or both, accurately reflect the mechanism by which chromatin is captured by cohesin in vivo remains unresolved. FRET and cross-linking studies would suggest the ring model to be most accurate, but such biochemical assays could be misinterpreted in the context of the whole cell. Studies showing self interaction of cohesin subunits suggest that cohesin forms a higher-order complex and thus holds chromatids together via the handcuff model. It is of course possible, and highly likely, that both models are correct and that cohesin can associate with chromatin in multiple ways depending on chromatin structure and specific function (cohesion, transcription control or ДНК damage repair). The biochemical assays that have been used to study the molecular architecture of cohesin rings on ДНК should be utilized to specifically isolate the structure of cohesin complexes involved in transcriptional control and gene silencing compared with cohesin rings that are involved in sister chromatid cohesion. Any differences observed will help to determine whether cohesin rings do indeed self-associate to hold chromatin together and whether this is a feature of cohesin specifically involved in sister chromatid cohesion. We hypothesize that there are multiple forms of cohesin that each have their own function and differ in their specific mechanism of association with ДНК.
In addition to sister chromatid cohesion, cohesin has a major role in ДНК damage repair and gene regulation. The mounting evidence shows that cohesin accumulates at sites of damage and mutation of cohesin subunits results in impairment of repair. The majority of these studies have been performed in yeast and work in mammalian cells has produced conflicting results. This is probably due to differing complexity in the pathways involved in ДНК damage repair between higher and lower eukaryotes because the cohesin proteins themselves appear highly conserved between yeast and humans. Differences in the mechanism of cohesin-mediated transcriptional insulation in higher and lower eukaryotes have also been highlighted. Whereas in lower eukaryotes cohesin is enriched at sites of convergent transcription, in higher eukaryotes, cohesin appears to be actively recruited to ДНКse I-hypersensitive sites by CTCF, a protein that has no known homologue in lower eukaryotes. The discovery that the association of cohesin with chromatin is vitally important in the control of gene transcription has helped explain the defects observed in cohesinopathies, such as CdLS and Roberts syndrome. As these syndromes are characterized by developmental defects, with little or no association with cancer predisposition, it is hypothesized that the insulator function of cohesin is significantly disturbed, contributing to the phenotypes seen, whereas the impact on sister chromatid cohesion and chromosome segregation is less severe. These newly emerging and novel functions demonstrate that cohesin is not only essential for chromosome segregation, but is the master regulator of multiple aspects of genome integrity in all eukaryotes.
Сайт создан в системе uCoz