Сетчатка млекопитающих состоит из семи основных классов клеток с внутренне присущими сигналами, достаточными для спецификации большинства клеточных типов (Cayouette et al., 2003; Cepko, 1999; Hatakeyama and Kageyama, 2004; Livesey and Cepko, 2001). Фоторецепторы сетчатки представлены двумя основными классами, палочками и колбочками, которые воспринимают тусклый и яркий свет, соотв. Идентифицировано несколько транскрипционных факторов , которые регулируют дифференцировку фоторецепторов. Некоторые из них, такие как гомеодоменовые факторы Otx2 и Crx, необходимы для дифференцировки и жизнеспособности как палочек, так и колбочек (Chen et al., 1997; Furukawa et al., 1997; Nishida et al., 2003). Др.,включая Rorβ, Nrl и Nr2e3, репрессируют экспрессию специфичных для колбочек генов в предшественниках фоторецепторов палочек, в то же время часто также активируют экспрессию специфичных для палочек генов (Akhmedov et al., 2000; Haider et al., 2000; Jia et al., 2009; Mears et al., 2001). Идентифицирован ряд, экспрессируемых колбочками, транскрипционных факторов, включая Trβ (Thrβ), Rxrγ и Rorα, которые вместе с E3 SUMO лигазой Pias3 одновременно управляют экспрессией опсинов (opsin) колбочек, чувствительных к средней длине волны (Mop; Opn1mw) , в то же время репрессируя экспрессию опсинов колбочек, чувствительных к коротким длинам волн (Sop; Opn1sw) (Fujieda et al., 2009; Onishi et al., 2010a; Roberts et al., 2005; Roberts et al., 2006).

Синапсы фоторецепторов образуются как с биполярными промежуточными нейронами, так и GABAergic интернейронами, известными как горизонтальные клетки. Горизонтальные клетки посылают боковые ингибирующие проекции ко множественным соседним фоторецепторам посредством своих крупных древообразных ветвлений, что усиливает пространственно разрешение восприятия света. Горизонтальные клетки выходят из митозов между эмбриональным днем (E) 12 и E16 у мышей и первоначально мигрируют в направлении ганглиолярного клеточного слоя, но затем меняют направление и мигрируют в направлении своей окончательной позиции на наружном крае внутреннего ядерного слоя (Edqvist and Hallbook, 2004). Некоторые транскрипционные факторы регулируют дифференцировку горизонтальных клеток, включая Foxn4, Ptf1a и Prox1 (Dyer et al., 2003; Fujitani et al., 2006; Li et al., 2004). Prox1 регулирует экспрессию Lhx1, который необходим горизонтальным клеткам для достижения своей соответствующей ламинарной позиции. Горизонтальные клетки Lhx1^-/- мышей неспособны осуществлять радиальную миграцию и вместо этого занимают позиции во внутренней части внутреннего ядерного слоя, напоминая в широком смысле амакринные клетки своей морфологией и ветвлениями дендритов, в то же время продолжают экспрессировать молекулярные маркеры горизонтальных клеток (Poche et al., 2007).

Ранее мы идентифицировали транскрипционный фактор цинковые пальчики Sall3 как высоко и избирательно экспрессируемый в развивающейся сетчатке мыши (Blackshaw et al., 2004). Sall3 является гомологом гена spalt дрозофилы, который играет критическую роль во многих аспектах развития фоторецепторов (Domingos et al., 2004; Mollereau et al., 2001; Sprecher et al., 2007). Чтобы определить, играет ли Sall3 эволюционно консервативную роль в дифференцировке сетчатки млекопитающих, мы осуществили анализ как избыточности, таки недостаточности функции Sall3 в развивающейся сетчатке мыши. DISCUSSION Наши находки демонстрируют, что Sall3 играет критическую роль в регуляции развития как фоторецепторов колбочек, так и горизонтальных промежуточных нейронов. Наша модель действия Sall3 суммирована на Рис. 11. Sall3 необходим для экспрессии ряда специфичных для колбочек генов, при этом лишь очень незначительное количество Sop-позитивных и Arr3-позитивных клеток обнаруживается в Sall3^-/- сетчатке. Эксперименты с микромассивами выявили, что многие др. концентрирующиеся в колбочках транскрипты избирательно подавляются в Sall3^-/- сетчатке, включая гены Pde6c, Pde6h и Crb1, тогда как некоторые, такие как Gnat2 и Gnb3, не обнаруживают или обнаруживают незначительные отклонения. Поразительно, избыточная экспрессия Sall3 c помощью электропортации достаточна для индукции экспрессии как Sop, так и Arr3, не только в фоторецепторах, но и также в субнаборе клеток в INL, но не затрагивала экспрессию Mop. Палочковидные фоторецепторы, избыточно экспрессирующие Sall3 в сетчатке после электропортации, были морфологически неотличимы от контрольных. Эти палочковидные фоторецепторы, избыточно экспрессирующие Sall3 сохраняли свою нормальную морфологию, ламинарную позицию и паттерн экспрессии клеточно-специфических маркеров.

Fig. 11. Role of Sall3 in horizontal cell and S-cone photoreceptor development. (A) Sall3 and Lhx1 expression is activated in postmitotic horizontal cell precursors, which express Ptf1a and Prox1. Expression of Sall3 maintains Lhx1 expression in differentiating horizontal cells. Loss of Sall3 expression results in horizontal cells being displaced radially to the IPL and losing expression of calbindin. Blue, M-phase retinal progenitor cell; green, newly postmitotic horizontal cell beginning inward radial migration; yellow, horizontal cell precursor beginning outward radial migration; orange, horizontal cell precursor that has completed outward radial migration; red, mature wild-type horizontal cell; maroon, displaced mature Sall3?/? horizontal cell. (B) Expression of Sall3 in Rxr?-positive cone precursors directly activates the expression of Sop and Arr3 but not the cone alpha transducin subunit (Gnat2). ONL, outer nuclear layer; OPL, outer plexiform layer; INL, inner nuclear layer; IPL, inner plexiform layer; GCL, ganglion cell layer.

Эти данные указывают на то, что Sall3 активируется в Sop-экспрессирующих фоторецепторах, испытывающих терминальную дифференцировку, и что Sall3 сам по себе может непосредственно активировать субнабор специфичных для колбочек генов скоординированным способом, аналогично рецепторам орфановых ядерных гормонов Errβ (Esrrb) в палочковидных рецепторах (Onishi et al., 2010b). Некоторые др. рецепторы ядерных гормонов вместе с транскрипционным корегулятором Pias3, как было установлено, необходимы для колбочек, чувствительных средним длинам волн, чтобы активировать экспрессию Mop, с одновременной репрессий экспрессии Sop. Sall3, однако представляет первый экспрессируемый колбочками транскрипционный фактор, который селективно активирует Sop.

Строгая активация S-cone-специфических транскриптов c помощью Sall3 выявляет неожиданную функциональную гомологию с комплексом генов Spalt дрозофилы в регуляции дифференцировки фоторецепторов. У Drosophila, Spalt гены необходимы для спецификации внутренних R7 и R8 фоторецепторов, которые ответственны за различение цветов и во многих отношениях формируют класс колбочко-подобных фоторецепторов в компаундных глазах. Неожиданно, потеря функции генов Spalt приводит к эктопической экспрессии Rh1 opsin (NinaE), который обычно экспрессируется в наружных R1-R6 фоторецепторах, в R7 и R8 клетках, тогда как экспрессия Rh3-Rh6 теряется (Domingos et al., 2004; Mollereau et al., 2001). Однако проекции аксонов от внутренних фоторецепторов остаются неизменными у Drosophila sal мутантов. Такой частичный сдвиг в качественных особенностях фоторецепторов напоминает таковой, который обнаруживается вследствие избыточной экспрессии Sall3 в палочковидных фоторецепторах. Эти клетки, по-видимому,морфологически нормальны и продолжают экспрессировать родопсин, но теперь крепко экспрессируют специфичные для колбочек гены. Особенно, Spalt гены избирательно экспрессируются в чувствительных к голубому свету Rh5-позитивных R8 фоторецепторах и необходимы для экспрессии Rh5 opsin (Sprecher et al., 2007).

У мышей мы наблюдали, что Sall3 как необходим, так и достаточен для экспрессии чувствительных к голубому свету опсинов колбочек, но не чувствительных к зеленому опсинов колбочек. Такая непосредственная консервация генных функций при развитии фоторецепторов необычна и даже довольно неожиданна, поскольку чувствительные к голубому зрительные опсины насекомых и позвоночных развиваются независимо (Shichida and Matsuyama, 2009). Хотя такое наблюдение может означать эволюционную конвергенцию, это может альтернативно указывать на то, что предшественники bilateria обладали специфическими короткой длины волны чувствительными типами клеток фоторецепторов, дифференцировка которых контролировалась c помощью семейства генов Spalt, с чувствительными к голубому опсиновыми генами, экспрессируемыми клетками, оказались измененными в разных ветвях; фоторецепторы могут с одной точки зрения, коэкспрессировать как чувствительные к голубому цилиарные, так и рабдомерные опсины. Эта возможность имеет прецедент, т.к. известно, что фоторецепторы позвоночных и беспозвоночных коэкспрессируют разные гены opsin со сходной спектральной чувствительностью (Mazzoni et al., 2008; Porter et al., 2009). В некоторых случаях, гены опсинов со сходной спектральной чувствительностью, но которые тем не менее сильно разошлись на молекулярном уровне, коэкспрессируются, такие как чувствительный к голубому melanopsin и опсины колбочек сетчатки кур (Bailey and Cassone, 2005; Bellingham et al., 2006). Анализ экспрессии генов семейства Spalt у беспозвоночных из многих филетических групп с хорошо охарактеризованным цветовым зрением поможет в дальнейшем прояснить эту находку.

Sall3 играет также жизненно важную роль в регуляции дифференцировки горизонтальных клеток, одного их двух типов непосредственно постсинаптических по отношению к фоторецепторам колбочек и может осуществлять это посредством поддержания экспрессии Lhx1. Мы не наблюдали дефекты экспрессии др. ранее описанных транскрипционных факторов, экспрессирущихся в горизонтальных клетках в сетчатке Sall3^-/- , включая Pax6, Foxn4 и Ptf1a, хотя подсчет клеток выявляет уменьшение количества Prox1-позитивных клеток в дорсальной части сетчатки на ст. P0. Однако финальная ламинарная позиция Sall3^-/- горизонтальных клеток очень напоминает ту, которая обнаруживается у мутантов Lhx1. Горизонтальные клетки Chx10-Cre; Lhx1lox/lox мутантов неспособны испытывать инициальную, направленную наружу радиальную миграцию, приводя к эктопическому расположению во внутреннем INL и к расширению их дендритных разветвлений во IPL (Poche et al., 2007; Poche et al., 2008). Горизонтальные клетки сетчатки Sall3^-/- , по-видимому, инициируют экспрессию Lhx1 и осуществляют обычную наружную радиальную миграцию. Однако на ст. P0, экспрессия Lhx1 резко снижается и на поздних стадиях большинство тел горизонтальных клеток обнаруживается на границе со склерой в IPL, и в конечном итоге оказываются расположенными с амакринными клетками и распространяют свои дендриты в IPL, фенокопируя мутантов Lhx1. Феномен эктопических горизонтальных клеток, ассоциированных с внутренним ядерным и плексиформным слоем наблюдался также в экспериментах по избыточной экспрессии Sall3, в которых Sall3, по-видимому, достаточен, по крайней мере, частично, чтобы специфицировать горизонтальные клетки, включая активацию Prox1 и NF165. Отсутствие совместной экспрессии с маркерами, специфичными для AII амакринных клеток, указывает на то, что Prox1-экспрессируемые wide-field клетки, генерируемые в экспериментах по электропортации Sall3 не являлись дизморфной популяцией AII. Это не исключает возможности, что избыточная экспрессия Sall3 приводит к генерации редкого Sall3⁺ Prox1⁺ субкласса wide-field амакринных клеток. В частности, Spalt гены также регулируют экспрессию prospero в развивающихся фоторецепторах Drosophila, которая затем действует, чтобы направить дифференцировку в сторону субтипа R7 фоторецепторов (Cook et al., 2003; Domingos et al., 2004). Избыточная экспрессия Sall3 в сетчатке новорожденных оказалась недостаточной, чтобы индуцировать экспрессию Lhx1, и, следовательно, клеток, подобных горизонтальным, демонстрируя то же самое эктопическое расположение, которое наблюдается у мутантов Lhx1 и Sall3.

Критическая роль Sall3 в регуляции экспрессии Lhx1 была проанализирована с использованием микромассивов, было показано, что Lhx1 является одним из наиболее строго подавляемых генов в сетчатке Sall3^-/- . Итак, эти данные указывают на то, что устойчивая экспрессия Lhx1 может регулироваться на множественных стадиях миграции горизонтальных клеток и что Sall3 необходим для поддержания экспрессии Lhx1 во время постнатальной дифференцировки горизонтальных клеток. Ограниченные количества Sall3⁺ NF165⁺ и Sall3⁺ Prox1⁺ горизонтальных клеток, присутствующих в Six3-Cre; Lhx1lox/lox сетчатке, указывают на то, что Sall3 регулирует аспекты развития горизонтальных клеток, по крайней мере частично, посредством Lhx1-независимого пути и что экспрессия самого Sall3 может не нуждаться в Lhx1.

Субнабор биполярных интернейронов, избирательно экспрессирует Sall3. Идентифицированы предназначенные стать S-cone-избирательными биполярными клетками в сетчатке мышей, которые аналогичны S-cone-selective биполярными нейроцитами внутреннего ядерного слоя приматов (Haverkamp et al., 2005). Существует возможность, что Sall3 может регулировать дифференцировку S-колбочек и соответствующих им биполярных интернейронов. Однако анализ микромассивов не выявляет каких-либо существенных изменений в известных генах, экспрессируемых биполярными клетками, и роль Sall3 в развитии биполярных интернейронах ещё предстоит решить.