Точный контроль элонгации актиновых филамент в клетках эукариот является фундаментальным для становления скоординированных клеточных перемещений, управляемых с помощью образования выдающихся вперед структур, подобных филоподиям и ламеллиподиям, чтобы собирать контрактильное кольцо в борозде расщепления во время клеточных делений и чтобы координировать эндоцитоз и фагоцитоз (Chhabra and Higgs, 2007; Chesarone and Goode, 2009; Faix et al, 2009; Insall and Machesky, 2009). Единственные пока известные белки, которые непосредственно усиливают элонгацию филамент путем взаимодействия с растущим колючим концом и рекрутирования мономерного актина для полимеризации, это formins и Ena/VASP белки. Члены семейства Ena/VASP, как было установлено ранее, локализуются зависимым от выпячиваний образом на кончиках ламеллиподий (Rottner et al, 1999) и влияют на длину актиновых филамент, также как и на их видимую плотность ветвления внутри ламеллиподий (Bear et al, 2002) и на хвосты комет Listeria monocytogenes (Plastino et al, 2004). Ena/VASP белки необходимы для образования филоподий у млекопитающих и Dictyostelium (Schirenbeck et al, 2006; Applewhite et al, 2007; Dent et al, 2007) и как было установлено, усиливают управляемое актином продвижение вперед (propulsion) L. monocytogenes (Laurent et al, 1999; Loisel et al, 1999; Geese et al, 2002) а также кусочки, смоченные ActA (Samarin et al, 2003). Кроме того, они участвуют в образовании нейритов и развитии коры (Kwiatkowski et al, 2007, 2009) , а также в развитии и прогрессировании опухолей (Hu et al, 2008; Philippar et al, 2008).
Ena/VASP белки обладают консервативной трехсоставной архитектурой, состоящей из N-терминального Ena/VASP homology 1 (EVH1) домена, необходимого для субклеточной доставки, центрального богатого пролином домена, участвующего в рекрутировании комплексов profilin-actin (Jonckheere et al, 1999; Ferron et al, 2007), и C-терминального EVH2 домена, отвечающего за тетрамеризацию и взаимодействие с мономерным и филаментозным актином (Bachmann et al, 1999; Huttelmeier et al, 1999; Breitsprecher et al, 2008). G-actin-binding site (GAB) внутри домена EVH2 обнаруживает тесную гомологию последовательностей с WASP homology 2 (WH2) мотивами, которые присутствуют во многих актиновых регуляторах (Supplementary Figure S1; Paunola et al, 2002; Dominguez, 2007, 2009). Кроме того, соседний F-actin-binding site (FAB) , как полагают, также обладает WH2-подобными свойствами (Dominguez, 2007, 2009).
Хотя и Ena/VASP белки и formins ускоряют удлинение колючего конца актиновой филаменты in vitro, но лежащие в основе молекулярные механизмы различны (Faix and Grosse, 2006; Breitsprecher et al, 2008; Chesarone and Goode, 2009; Dominguez, 2010). Formin димеры поступательно ассоциируют с растущим колючим концом филаменты за счет преимуществ своего димерного FH2 домена по мере инсерции тысяч актиновых мономеров, тем самым эффективно защищают филаменту от гетеродимерных capping proteins (CPs) (Zigmond et al, 2003; Harris et al, 2004; Schirenbeck et al, 2005; Kovar et al, 2006). Более того, обеспечиваемое форминами усовершенствование элонгации филаменты строго зависит от рекрутирования комплексов profilin-actin с помощью соседнего богатого пролином FH1 домена (Chang et al, 1997; Sagot et al, 2002; Kovar et al, 2006).
Захват поверхность иммобилизирующим VASP растущих колючих концов (Pasic et al, 2008) и когда плотность кластеров на поверхности становится достаточно высокой, он может транслоцироваться поступательно с концом растущей филаменты (Breitsprecher et al, 2008). В отличие от форминов, profilin, по-видимому, необязателен для VASP-обеспечиваемой элонгации филамент in vitro (Samarin et al, 2003; Schirenbeck et al, 2006; Breitsprecher et al, 2008). Примечательным свойством VASP является разное влияние CPs, когда VASP свободен в растворе или собран в кластеры на поверхности кусочка. После образования кластера, VASP запускает последовательное удлинение филаменты при высоких концентрациях CP, который блокирует VASP-обеспечиваемую элонгацию филамент в растворе (Breitsprecher et al, 2008). Итак, это указывает на то, что собранные в кластеры VASP тетрамеры кооперируют в закрепленных и удлиняющихся актиновых филаментах на поверхности, такой как клеточная оболочка и поверхность патогенов, таких как L. monocytogenes (Laurent et al, 1999; Breitsprecher et al, 2008; Footer et al, 2008). Хотя активность VASP по удлинению филамент может быть приписана их GAB и FAB мотивам, лежащие в основе общие механизмы VASP-обеспечиваемой сборки актина остаются неизвестны, так, human VASP (hVASP) обнаруживает резкое снижение активности по удлинению филамент in vitro, если сравнивать с ортологом из высоко подвижной почвенной амебы Dictyostelium discoideum (DdVASP) (Breitsprecher et al, 2008).
Чтобы выяснить молекулярный механизм Ena/VASP-обеспечиваемой элонгации филамент, мы использовали подход по перетаскиванию доменов, замещая GAB, FAB и соединяющую их линкерную область hVASP таковыми же из быстро удлиняющейся DdVASP и WH2 мотивами из др. актин-связывающих белков. Полученные результаты позволили разработать количественную математическую модель сродства, базирующуюся на WH2-доменом-обеспечиваемой сборе актина с использованием Ena/VASP белков, при этом скорость удлинения филамент коррелировала с насыщением GAB актиновыми мономерами.
Discussion
Здесь мы раскрыли базирующийся на сродстве механизм, с помощью которого Ena/VASP белки дифференциально усиливают элонгацию актиновых филамент в растворе и на функционализированных поверхностях и представили, пригодную к проверке, математическую модель Ena/VASP-обеспечиваемой элонгации актина. Сравнение hVASP химер, представленных WH2 мотивами с разным сродством к актину, выявило, что скорость удлинения филамент является результатом непосредственного соединения и инкорпорации актиновых мономеров с их WH2-подобными G-actin-связывающими мотивами, и более того, что их насыщение G-actin коррелирует непосредственно с усилением скорости элонгации филамент. Наши результаты четко объясняют различия в активности полимеризации актина Ena/VASP белками от разных видов in vitro и демонстрируют, что Ena/VASP белки от эволюционно удаленных организмов используют общий механизм для обеспечения сборки актиновых филамент.
В модели 'actoclampin' привязанной элонгации (Dickinson et al, 2002; Dickinson, 2009), гипотетический мультимерный белок actoclampin обеспечивает элонгацию филамент с помощью двух соседних актин-связывающих модулей, одного поступательно отслеживающего и связывающего конец растущей филаменты и другого, связывающего и поставляющего мономерный актин для элонгации. Скорость ограничивающие факторы элонгации филамент, следовательно, имеют скорость транслокации филамент-связывающих модулей на колючем конце, скорость связывания мономеров, кинетику переноса мономеров и избавления GAB с колючего конца или количеств мономеров, рекрутируемых с помощью модулей связывания мономеров. Эта модель может быть в принципе приложима к действию как форминов, так и Ena/VASP белков. Однако из-за значительных структурных и биохимических различий в их взаимодействиях с G- и F-actin, эти два семейства белков используют разные молекулярные механизмы для усиления элонгации филамент (Kovar et al, 2006; Ferron et al, 2007; Breitsprecher et al, 2008; Chesarone and Goode, 2009): formins поступательно отслеживают растущий колючий конец филамент за счет своих димерных FH2 доменов, которые однако обладают лишь незначительным сродством в отношении G-actin (Pring et al, 2003; Kovar et al, 2006). Заметим, что FH2-собираемые актиновые филаменты растут медленнее, чем спонтанно собираемые актиновые филаменты, что согласуется со скорость ограничивающим эффектом транслоцирующегося связывающего филаменты модуля на скорость элонгации филамент в модели actoclampin (Kovar and Pollard, 2004; Dickinson, 2009; Paul and Pollard, 2009). Этот ингибирующий эффект FH2 домена выражается количественно с помощью 'gating factor', который описывает долю времени, проводимую formin в открытом состоянии, которое позволяет инкорпорацию актинового мономера (Paul and Pollard, 2009). Торможение элонгации филамент с помощью FH2 домена компенсируется с помощью FH1 домена, который рекрутирует мономеры в виде profilin-actin комплексов, которые затем переносятся на FH2-связанный колючий конец, чтобы улучшить элонгацию филамент (Kovar et al, 2006). Скорость элонгации formin-обеспечиваемой сборки актина, как было установлено, коррелирует с количеством profilin-связывающих сайтов внутри FH1 домена и , следовательно, с количеством рекрутируемых мономеров (Paul and Pollard, 2008).
Напротив, Ena/VASP тетрамеры состоят из малых G- и F-actin-связывающих модулей и не ожидается поступательного отслеживания колючего конца филамент тем же способом, что димерным FH2 доменом форминов (Breitsprecher et al, 2008; Dominguez, 2009). Кроме того, profilin, как было установлено, безразличен к VASP-обеспечиваемой сборке актина in vitro (Breitsprecher et al, 2008; Hansen and Mullins, 2010), указывая тем самым, что рекрутирование мономеров достигается непосредственно с помощью его WH2-подобных мотивов. Поскольку инсерция др. WH2 мотивов с разным сродством к G-actin в основу hVASP оказалась достаточной, чтобы ускорить элонгацию филамент в разной степени в зависимости от из сродства к G-actin, мы предположили, что непосредственное рекрутирование мономеров является ключом для быстрой Ena/VASP-обеспечиваемой элонгации филамент. Наши находки показали, что функция GAB в элонгации филамент может быть воспроизведена др. WH2 мотивами и что общий модулятор расположения G-actin-связывающего WH2 мотива и FAB в VASP достаточен для генерации элонгаторов актиновых филамент, которые делают возможным быструю и поступательную элонгацию филамент в присутствии CP, образующих кластеры на поверхности.
Важно, что скорости элонгации, обеспечиваемые с помощью Ena/VASP белков, как было установлено, коррелируют со сродством своих GAB к мономерам актина при низких концентрациях актина. Поскольку сродство к актину hGAB мотива скорее низкое и более того сильно зависит от ионной силы реакционного буфера, то не является неожиданнм, что предыдущие исследования описывали несогласующиеся результаты по влиянию Ena/VASP белков позвоночных на элонгацию колючих концов in vitro при использовании относительно низких концентраций актина и VASP в буферах с разными концентрациями солей (Skoble et al, 2001; Samarin et al, 2003; Barzik et al, 2005; Pasic et al, 2008).
Хорошее согласие между экспериментальными данными и математической моделью, представленной здесь, подтверждают поступательный (processive) механизм, причем множественные свободные GABs из тетрамерных VASP отлавливают актиновые мономеры из раствора и переносят их на кончики филамент (Figure 5), это сходно с механизмом отслеживания концов филамент (Dickinson et al, 2004). Отметим, что индивидуальные филаменты удлиняются из VASP-покрытых кусочков приблизительно с той же самой скоростью, как и в растворе VASP (Figures 1, 2 and 4; Breitsprecher et al, 2008), указывая тем самым, что количество участвующих GABs (N) является фиксированным значением независимо от того, является ли VASP иммобилизированными на поверхности или находятся в растворе. Полученные данные строго подтверждают, элонгация филамент обеспечивается с помощью одиночного VASP тетрамера в данный момент времени. Эти находки согласуются с недавним исследованием Hansen and Mullins (2010) , сообщающих о поступательной элонгации филамент с помощью одиночного VASP тетрамера в растворе. На кусочках элонгация филамент может сходным образом сопровождаться одним VASP тетрамером, но поскольку необходимо образование кластеров для поступательной элонгации (Breitsprecher et al, 2008), то наши эксперименты не могут исключить возможность, что в данном геометрическом контексте 4 собранных в кластер VASP тетрамера могут оперировать вместе, с одним EVH2 доменом, закрепленным на филаменте, тогда как каждый др. трех EVH2 доменов участвует в доставке мономеров вокруг центральной актиновой филаменты.
Итак, наша модель не только объясняет разные скорости элонгации, обеспечиваемые Ena/VASP in vitro, но и также предсказывает, что все Ena/VASP белки являются мощными элонгаторами филамент in vivo, где концентрация компетентного к полимеризации актина значительно выше, чем в условиях in vitro (Figure 7) (Pollard et al, 2000). Ранее было предположено, что Ena/VASP усиливает выпячивания ламеллиподий и толчкообразное продвижение ActA-покрытых кусочков и восстановление подвижности у Listeria косвенно путем предупреждения покрытия шапочкой (capping) колючих концов с помощью CP, при снижении количества Arp2/3-зависимых веточек филамент или при обеспечении быстрых циклов прикрепления-открепления актиновых филамент делается возможным как связывание F-actin, так и инсерцию мономеров с помощью Броуновского движения (Laurent et al, 1999; Bear et al, 2000, 2002; Samarin et al, 2003). Мы показали здесь, что эти находки лучше всего объясняются увеличением скорости элонгации актиновых филамент, обеспечиваемым поступательным взаимодействием Ena/VASP белков с колючими концами филамент, это согласуется с гипотезой actoclampin мотора, следящего за концами (Dickinson and Purich, 2002; Dickinson et al, 2002, 2004; Dickinson, 2009). Наконец, поскольку наша гипотеза показывает, что спонтанное добавление актиновых мономеров скорее всего не происходит во время поступательной (processive) VASP-обеспечиваемой элонгации филамент на поверхности и поскольку белки Ena/VASP обнаруживаются в большом количестве в местах активной сборки actin, то кажется вполне объяснимым, что большая часть ,если не всех актиновых филамент, элонгация в клетке непосредственно контролируется следящими за концами (end-tracking) белками.
Сайт создан в системе
uCoz 
