Посещений:
ЭНХАНСЕРЫ ТРАНСКРИПЦИИ

Роль в инициации и поддержании транскрипции

Memories of lost enhancers
Ranjan Sen and Rudolf Grosschedl
doi: 10.1101/gad.1930610 Genes & Dev. 2010. 24: 973-979

Transcriptional enhancers are key determinants of developmentally regulated gene expression. Models of enhancer function must distinguish between analog or digital control of transcription, as well as their requirement to initiate or maintain transcriptional activity of a gene. In light of a recent study by Chong and colleagues (pp. 659–669) providing evidence of a transient requirement of an enhancer associated with the CD4 gene, we discuss possible mechanisms by which transcriptional memory can be propagated in the absence of enhancers.


Рис.1.  |  Models of enhancer-induced transcriptional memory.

Транскрипционные энхансеры определяются как цис-регуляторные последовательности, которые действуют независимо от ориентации и расстояния до сайта инициации транскрипции (Bulger and Groudine 2010). На момент их открытия это определение служило для отличения энхансеров от генных промоторов, которые находились в тесной близи и часто имели точное положение в отношении сайта инициации транскрипции. Напротив, энхансеры обычно располагаются на значительных расстояниях от 5' и 3' сайтов инициации транскрипции клеточных генов. Энхансеры являются также важными компонентами locus control regions (LCRs), которые включают дополнительные цис-регуляторные модули, которые часто определяются по их гиперчувствительности к DNase I (Palstra et al. 2008). В комбинации с такими вспомогательными элементами энхансеры делают возможной корректную экспрессию в исследованиях по трансформации зародышевой линии мышей. Помимо своего варьирующего местоположения, более ранние исследования энхансеров, базирующиеся на исследованиях по трансфекции, в которых ассортимент промоторов, энхансеров и генов комбинировался в плазмидах, чтобы тестировать эффекты на транскрипцию. В таких экспериментах энхансеры активировали транскрипцию, если располагались 5' или 3' относительно репортерного гена, тем самым было подтверждено мнение, что они не зависят от расстояния. Действительно, энхансеры варьируют значительно по своей способности активировать транскрипцию даже когда тестируются с рекомбинантной репортерной конструкцией, но эффекты перемещения энхансеров в разные позиции в контексте клеточных генов неизвестны. Др. недооцененный аспект функции энхансера это то, что большинство энхансеров предпочитают активировать транскрипцию в некоторых промоторов относительно др. Идея, что энхансеры действуют одинаково на все промоторы также появилась в результате раннего использования немногих хорошо известных последовательностей промоторов для изучения функции энхансеров в исследованиях по трансфекции. Более того, присутствие множественных промоторов вблизи энхансера может влиять на избирательность активации промотора с помощью энхансера.

Enhancer function I: analog versus digital response


На основном базовом уровне энхансеры "работают" путем рекрутирования сиквенс-специфических ДНК-связывающих белков на генный локус. Типичные энхансеры содержат сайты связывания для множественных транскрипционных факторов, а мутации этих сайтов влияют на функцию энхансеров. Однако существенная редукция активности энхансеров часто нуждается в одновременных мутациях более, чем одного сайта связывания транскрипционного фактора. Это наблюдение было интерпретировано как указание на функциональную избыточность (redundancy) (Dang et al. 1998) среди нескольких факторов, рекрутируемых на энхансер, но может также отражать природу подхода, использованного для изучения функции энхансеров. Субнабор белков, связываемых энхансером, может обеспечить активность в контексте синтетических энхансеров, которые содержат сайты связывания мультимеризованных факторов, тогда как др. не может. Логика, по которой разные сайты связывания транскрипционных факторов сводятся вместе, чтобы генерировать функциональные энхансеры, остается неизвестной. Кроме того, большинство белков, связываемых энхансером, могут также функционировать как промоторные факторы. Отсутствие очевидного функционального различия между энхансер-связывающими белками и с промоторами-ассоциированными факторами делает расплывчатым различие между промоторами и энхансерами.
Тесное соответствие между энхансер- и промотор-связывающими белками является основой для наиболее распространенной и принятой модели функции энхансера, что энхансеры усиливают инициацию транскрипции с промоторов. В этой модели энхансеры служат в качестве хранилища или сайтов переноса ДНК-связывающих белков и ассоциированных белков, включая медиатор и RNA polymerase II, которые необходимы для транскрипции генов. Ассоциированные с энхансером белки могут "доставляться" на промотор за счет непосредственных взаимодействий между промотором и энхансером за счет образования петли из находящейся между ними ДНК. Такие петли и в самом деле были обнаружены с помощью метода chromosome conformation capture (3C). Напр., LCR для локуса β-globin мыши, который существенен для эффективной транскрипции всех β-like генов, находится в физической близости к промотору, активному на соотв. ст. развития (de Laat et al. 2008). Такое петлеобразование необходимо для транскрипционного фактора CTCF, который связан с DNase I-гиперчувствительными сайтами на 5' и 3' концах локуса (Splinter et al. 2006). Сходным образом, дальнодействующие петли были обнаружены в локусах рецепторов антигенов (Oestreich et al. 2006; Wuerffel et al. 2007) и локусах генов цитокинов в лимфоцитах (Spilianakis and Flavell 2004; Sekimata et al. 2009). Согласно этой модели предполагается, что промоторные факторы не могут быть рекрутированы или неспособны стать активными, если энхансер не дает "добро", включая коактиваторы транскрипции, факторы ремоделирования хроматина и/или гистон-модифицирующие комплексы. Сильный энхансер позволяет многим молекулам polymerase инициировать и/или осуществлять транскрипционную элонгацию, приводя тем самым к более высоким уровням транскрипции. Петлеобразование также расширяет гибкость разных энхансеров, действующих на один и тот же генный промотор, а также независимую регуляцию генов в образованной в петлю части генома. Др. модели доставки компонентов транскрипции, рассматривались ранее, такие как перенос важных молекул вдоль генома от энхансера до промотора. В этом случае было бы значительно труднее независимо регулировать ДНК, находящуюся между энхансером и промотором. Кстати, нет прямых доказательств модели слежения (tracking model) функции энхансера.
Альтернативное мнение о функции энхансера утверждает, что энхансеры увеличивают вероятность того, что промотор будет активирован к инициации транскрипции (Walters et al. 1995; Fiering et al. 2000). Решающим моментом этой модели, который отличает её от модели загрузки полимераз, описанной выше, является то, что промотор достаточен сам по себе для полной активации транскрипции. Однако в отсутствие энхансера меньше промоторов в популяции клеток достигают этого состояния; те же что достигают его, однако, будут транскрибировать ген на том же самом уровне как и когда присутствует энхансер. Экспериментально эти две модели может быть оценены только если активность энхансера оценивается на уровне одной клетки. В самом деле, эксперименты, предпринятые, чтобы специфически решить этот вопрос, дали результаты, согласующиеся с этой идеей. Напр., как SV40 энхансер (Weintraub 1988) так и энхансер β-globin LCR увеличивает пропорцию стабильно трансфицированных клеток, которые экспрессируют ассоциированный транспортер. Напротив, делеция β-globin энхансера из стабильной трансфицирующей плазмиды, которая транскрипционно активна ведет к мозаичной (variegated) экспрессии (Walters et al. 1996). Следовательно, некоторые клетки экспрессируют репортер с делетированным энхансером на том же самом уровне, что и репортер в присутствии энхансера, тогда как др. клетки не экспрессируют репортер совсем. Сходные наблюдения были сделаны при делеции интронного энхансера (Eµ) из эндогенного гена immunoglobulin heavy chain (IgH) в B-клеточной гибридоме (Ronai et al. 1999, 2004). После делеции энхансера, IgH белок экспрессируется только в субнаборе клеток. В клетках, экспрессирующих IgH, однако, уровень экспрессии был сравним с таковым в клетках, в которых энхансер остался интактным. Интересно, что Ronai et al. (1999) установили, что "on" состояние аллеля при делеции энхансера стабильно поддерживается в течении около 100 клеточных делений, тогда как состояние "off" длится значительно дольше. Эти наблюдения привели к идее эпигенетически распространяемых on и off состояний, причем переход между состояниями управляется с помощью Eµ энхансера. Недавно изучали digital всё-или-ничего транскрипционные ответы с помощью непосредственного мониторинга синтезируемых транскриптов в живых клетках, которое показало, что гены транскрибируются в виде пульсов с характерной продолжительностью, частотой и интенсивностью (Larson et al. 2009). Более того, предложены модели стохастических флюктуаций экспрессии генов (Pedraza and Paulsson 2008). Поскольку стохастическая (probabilistic) модель говорит против доставки компонентов транскрипции, она целиком согласуется с пространственным соприкосновением промоторов и энхансеров. Вообще-то повышенная вероятность возбуждения (firing) промотора в присутствии энхансера обусловливается с помощью такой близости энхансер/промотор. Альтернативно, энхансеры могут влиять на структуру хроматина более широко, приводя тем самым к беспрепятственному доступу промотора для транскрипционных факторов и РНК полимеразы. В подтверждение хроматиновой модели функционирования энхансера, соприкосновение Eµ энхансера с промотором бактериофага T7, вместо промотора для RNA polymerase II, делает эффективным доступ к прокариотическому промотору в pro-B клетках из трансгенных мышей (Jenuwein et al. 1997). Т.о., доступность зависимого от энхансера промотора наблюдается независимо от обнаружимой транскрипции с помощью RNA polymerase II. Наиболее вероятно, что энхансеры действуют с помощью обоих механизмов, чтобы стимулировать функцию промотора.

Enhancer function II: initiation or maintenance


Одним из аспектов функции энхансера является то, что он имеет прямое отношение к своим механизмам действия, независимо от того, необходимо ли однажды инициировать транскрипцию с промотора или необходимо непрерывно поддерживать транскрипцию гена. Вопрос возникает в биохимических исследованиях транскрипции, однажды возникнув преиниационный комплекс, состоящий из нескольких общих факторов транскрипции, генерируемый на TATA боксе, является ли достаточным для подержания нескольких событий инициации транскрипции. Возможно, что однажды энхансером активированный промотор и в результате этого образовавшийся функциональный промоторный комплекс, делают присутствие далее энхансера необязательным для поддержания транскрипции с промотора. Однако биохимические исследования, на которых базируется эта идея, проведены на голых матричных ДНК, а стабильность преиниационных комплексов в более естественных контекстах ещё не была оценена систематически. Более того, эти исследования in vitro не были адресованы вопросу, что д. происходить с базирующейся на промоторе транскрипцией преиниационного комплекса после репликации ДНК. Т.о., необходим ли энхансер или нет для поддержания транскрипционной активности промотора необходимо проверить в присутствии клеточного деления.
Не существует совпадения самых ранних исследований, предназначенных для непосредственного тестирования вопроса инициация в противовес поддержанию, с использованием впервые охарактеризованных вирусных и тканеспецифических энхансеров. Wang and Calame (1986) , используя температурочувствительную линию клеток, которая позволяет SV40T антиген-зависимую репликацию внехромосомной плазмиды, чтобы индуцибельно амплифицировать количество копий SV40 энхансеров, присутствующих в клетке. параллельно они описали экспрессию с репортерной плазмиды, которая сохраняла фиксированное число копий и была контролируема SV40 энхансером. В этих экспериментальных условиях амплификация SV40 энхансерных последовательностей д. была оттитровать SV40 энхансером-связываемые белки с SV40 энхансера, которые контролирует экспрессию репортерного гена. Wang and Calame (1986) установили, что конкуренция между SV40 энхансерными последовательностями в самом деле снижала активность репортера, если конкуренция происходила одновременно с установлением транскрипционной компетентности репортера. Однако, если сначала устанавливалась транскрипция репортера, а затем увеличивалось количество SV40 устанавливаемых последовательностей, то отсутствовало влияние на экспрессию репортера. Wang and Calame (1986) интерпретировали результаты как показатель. что SV40 энхансер не нужен, как только репортер становится транскрипционно активным.
Почти одновременно Grosschedl and Marx (1988) разработали элегантную стратегию тестирования, необходим ли тканеспецифический IgH энхансер для поддержания транскрипции функционально перестроенного IgH гена. Они создали конструкции, в которых IgH энхансер вместе с gpt геном в качестве позитивного и негативного селекционного маркера, был фланкирован с помощью рекомбинационной сигнальной последовательности, которая использовалась для делеции энхансера после установления стабильных transfectants в трансформированной вирусом Abelson линии клеток. Лишенный энхансера IgH ген, расположенный вблизи этой кассеты, как было установлено, зависит от gpt-ассоциированного энхансера в отношении транскрипции. Grosschedl and Marx (1988) нашли, что IgH-экспрессирующие клоны теряют транскрипцию после рекомбинацией индуцированной делеции сопровождающего энхансера. Ergo, энхансер IgH был постоянно необходим для поддержания транскрипции IgH. Существенные различия в экспериментальной процедуре в двух исследованиях исключили прямое сравнение. Однако полученные разные результаты подчеркивают важность этого вопроса в терминах базового понимания механизма функционирования энхансеров.
Первое аналогичное исследование для проверки роли энхансеров в контексте эндогенного гена были проведены Groudine с коллегами (Reik et al. 1998). Они вносили cre и flp recombinase сайты мишени в локус гена β-globin человека с помощью целенаправленной рекомбинации. Хромосома человека, несущая модифицированный локус, была перенесена в мышиные erythroleukemia клетки с помощью слияния генов. Установив, что целевой локус β-globin человека транскрипционно активен в этих клетках, Reik et al. (1998) временно вводили cre или flp, recombinase, чтобы делетировать разные комбинации DNase I-гиперчувствительные сайты, которые ставят под угрозу β-globin LCR. Они нашли, что транскрипция достоверно снижалась на LCR-делетированных аллелях, это привело их к заключению, что LCR постоянно необходим для поддержания высокого уровня транскрипции β-globin генов. Интересно, что LCR-делетированные аллели сохраняли несколько аспектов "открытого" хроматина, такие как генерализованная чувствительность к DNase I, указывая, что эти свойства недостаточны для загрузки RNA polymerase II на промотор. Последние исследования подтвердили эти заключения о структуре хроматина на первичных эритроцитах от LCR-делетированных мышей (Epner et al. 1998; Bender et al. 2000). Однако эти новые исследования не имели непосредственного отношения к вопросу об инициации в противовес подержанию, поскольку LCR-делетированные аллели, по-видимому, никогда не транскрибировались на высоких уровнях.

A new definitive study


Недавнее исследование в лаб. Littman (Chong et al. 2010) было адресовано вопросу инициации или поддержания более определенным и сегодня доступным способом. Они анализировали роль T-lymphocyte-специфического энхансера (E4p) который локализован на 13 kb 5' гена Cd4 мыши. Во время дифференцировки T лимфоцитов в тимусе, Cd4 активируется сначала в т. наз. дважды позитивных (DP) тимоцитах, которые экспрессируют CD4 и CD8 корецепторы на клеточной поверхности. DP тимоциты экспрессируют также гетеродимерный T-cell receptor (TCR) и представляют собой самую большую пропорцию клеток тимуса. Поскольку большинство DP клеток гибнет в тимусе, то небольшая пропорция DP клеток "позитивно отбирается" , чтобы далее дифференцироваться в single-positive (SP) тимоциты. которые экспрессируют или CD4 или CD8 корецептор. SP тимоциты являются более зрелыми Т клетками в тимусе и после экспорта из тимуса генерируют периферический пул функциональных CD4+ или CD8+ T клеток. Более ранние трансгенные исследования показали, что E4p был сам по себе активен в DP клетках и как в CD4+, так и в CD8+ SP клетках. Отсутствие экспрессии CD4 в CD8+ клетках сегодня понимается как детерминированное с помощью Cd4 silencer (S), также охарактеризованного в лаб. Littman (Taniuchi and Littman 2004). Делеция в зародышевой линии E4p в данном исследовании устраняло экспрессию CD4 в большинстве DP тимоцитов. Несмотря на отсутствие экспрессии CD4 в DP тимоцитах, экспрессия CD4 обнаруживалась в 40% клеток, которые были позитивно отобраны и действительно 100% клеток достигли наиболее зрелой CD4+ SP стадии тимоцитов. Однако средний уровень экспрессии CD4 на поверхности был ниже и более широко распределен в E4p-делетированных CD4+ SP клетках как в тимусе, так и селезенке.
Chong et al. (2010) также установили, что эта E4p-независимая экспрессия CD4 была потеряна после пролиферации E4p-делетированных CD4+ T клеток. Они заключили, что в настоящее время неидентифицированная регуляторная последовательность частично компенсирует отсутствие E4p после позитивной селекции, чтобы активировать экспрессию Cd4. Однако этот элемент не полностью воспроизводит паттерн экспрессии нормального локуса. Чтобы строго установить, может ли потеря экспрессии Cd4 в пролиферирующих E4p-делетированных клетках указывать на постоянную потребность в E4p, Chong et al. (2010) "floxed" E4p, позволив CD4 клеткам развиваться нормально. Когда E4p был делетирован в зрелых CD4 T клетках с помощью ретровирусной экспрессии cre recombinase, то экспрессия CD4 стабильно поддерживалась в течение нескольких раундов клеточных делений несмотря на отсутствие E4p. Поразительным заключением является то, что CD4 T клетки, которые развиваются с интактным E4p не нуждаются в нём для поддержания экспрессит в ходе нескольких клеточных делений. Chong et al. (2010) пришли к заключению, что присутствие E4p во время развития создает эпигенетическое состояние, которое распространяется при пролиферации без E4p.

Mechanisms of enhancer-induced transcriptional memory


Эти наблюдения ставят несколько ваожных вопросов для будущих анализов. Во-первых, каков механизм, с помощью которого E4p "метит" локус Cd4, так что эта информация может передаваться посредством клеточных делений даже в отсутствие E4p? Chong et al. (2010) адресовали этот вопрос, изучая гистоновые модификации, ассоциированные позитивно или негативно с транскрипционной активностью в разных местах локуса Cd4. Когда E4p был делетирован в зародышевой линии, то они нашли, что локус Cd4 не содержит acetylated histone H3 (H3ac) или H3 триметилированного по Lys 4 (H3K4me3) в DP тимоцитах (которые не экспрессировали Cd4), тогда как CD4+ тимоциты, содержащие H3ac и низкие уровни H3K4me3, соответствовали более низкой транскрипционной активности E4p-делетированного гена по сравнению с E4p-достаточными аллелями. Во время пролиферацией индуцированной variegation экспрессии CD4 в E4p-делетированных селезеночных клетках, уровни H3ac стремительно падали, тогда как они оставались неизменными в клетках CD4 дикого типа. Поскольку они являются важной ступенью на пути к ответу, эти наблюдения в действительности не предоставляют информации о том, как раннее присутствие E4p маркирует локус на сохранение H3ac во время последующей пролиферацию Более того, др. механизм может быть ответственен за более низкую и более variegated транскрипционную активность CD4 в E4p-делетированных клетках.
Анализ опубликованной литературы позволил понять эти наблюдения. Одним из примеров является ген печень-специфической tyrosine-amino transferase (Tat), который2 регулируется глюкокортикоидами. Индуцибельная чувствительность к глюкокортикоидам была картирована в позиции ~2.5 kb 5' от сайта инициации транскрипции, которая содержит несколько сайтов связывания для глюкокортикоидных рецепторов и др. транскрипционных факторов. Эта область гена подвергается быстрому индуцируемому глюкокортикоидами ремоделированию хроматина и деметилированию ДНК, совпадающему с индуцибельной транскрипцией гена. Известно, что хотя ремоделирование хроматина и транскрипция являются обратимыми после удаления глюкокортикоидов, область в 2.5-kb остается деметилированной (Thomassin et al. 2001). Последующая индукция гена Tat происходит быстрее и на более высоком уровне. Thomassin et al. (2001) нашли доказательство существования чувствительного к метилированию транскрипционного фактора, который соединяется с этой областью, которая может размножать память об инициальном воздействии кортикостероида. В более физиологичных условиях деметилирование этой области ДНК происходит во время эмбриогенеза крыс между 15 днем плодного развития и рождением, преимущественно в ответ на увеличение концентраций кортикостерола, которое происходит приблизительно в это время. Заметим, что ген Tat остается транскрипционно молчащим во время этого периода деметилирования ДНК. Согласно рабочей модели деметилирование области ~2.5-kb "подготавливает" ген для последующей мощной индукции. Красота модели в том, что она легко делает видимой, как память деметилированной области ДНК может быть размножена даже через несколько раундов клеточных делений.
Сходным механизм был предположен для эффективной индукции гена interleukin 2 (IL-2) после вторичного стимула (Bruniquel and Schwartz 2003; Murayama et al. 2006). Используя человеческие T лимфоциты, Murayama et al. (2006) показали, что специфический CpG сайт в промоторе гена IL-2 специфически деметилируется после активации клеток с помощью TCR. Деметилированная область связывает конституитивный транскрипционный фактор Oct-1, который остается связанным с промотором IL-2 после того как активационные стимул был удален. Murayama et al. (2006) полагают, что Oct-1-связавший деметилированный промотор умножает память до активации гена IL-2 для эффективной реакции на вторичный стимул. Концепция, которая вытекает из обоих этих примеров очень сходна. А именно, индуцибельное деметилирование ДНК и последующее связывание транскрипционного фактора, маркирует локус для эффективной транскрипции для вторичной стимуляции (Fig. 1). Мы отмечаем, что оба эти примера являются генами, запрограммированными для индуцибельной активации во время физиологических реакций. Приложимы ли эти принципы к др. неиндуцибельным тканеспецифическим генам, таким как ген Cd4, изученный Littman с коллегами (Chong et al. 2010), или даже ко всем тканеспецифическим генам, предстоит установить. Chong et al. (2010) отмечают, что их более ранние исследования показали, что CD4 ген не контролируется с помощью деметилирования ДНК. Однако это наблюдение согласуется с функцией silencer, и оставляет открытым вопрос, вносят ли события метилирования ДНК вклад в E4p-зависимую память в зрелых CD4 T клетках.

Figure 1. Models of enhancer-induced transcriptional memory. The top line shows a hypothetical gene with two enhancers (E1 and E2) and a promoter (P) in the off state (hatched). (Middle line) Gene transcription is initiated by activation of a developmentally regulated enhancer (E1). Thereafter, gene transcription may be maintained by several mutually nonexclusive mechanisms discussed in the text, such as tethering to a specialized nuclear subcompartment (a); covalent epigenetic modifications, such as histone methylation and DNA demethylation of the promoter or other cis-regulatory sequences (stars) (b); incorporation of variant histones, such as H3.3 and H2A.Z (green stars) (c), and activation of a "maintenance" enhancer (E2) (d).

Как ещё может ген оставаться маркированным для независимой от пролиферации экспрессии в отсутствие энхансера? Вследствие количественных исследований транскрипции генов, которые были связаны с анализом индивидуальных транскриптов в реальном времени (Larson et al. 2009), Chubb и коллеги (Muramoto et al. 2010) показали недавно, что средняя частота транскрипции модифицированного act5 гена поддерживается во время клеточных делений у Dictyostelium. Путем внесения множественных копий последовательностей, распознающих РНК, для бактериального MS2-GFP слитого белка в 5' нетранслируемую область (UTR) гена act5, они смогли определить, что модифицированный act5 ген транскрибируется в виде характерных пульсов из 5.5 мин. в час. Известно, что мутации в гене, кодирующем гистоновую H3K4 methyltransferase set1 ведут к потере поддержки частоты пульса транскрипции act5 между генерациями, не нарушая устойчивого уровня транскрипции (Muramoto et al. 2010). Напротив, эффект на поддержку частоты транскрипции наблюдался у мутантов по H3K36 метилтрансферазе Set2 и по ДНК метилтрансферазе dnmA (Muramoto et al. 2010). Эти данные указывают на то, что метилирование H3K4 может быть необходимо для умножения существующего состояния транскрипции помимо его широко известной ассоциации с активной транскрипцией. Т.о., H3K4 может представлять собой метку, которая наделяет дочернюю клетку памятью о программе транскрипции материнской клетки (Fig. 1). Мы заметили, что монометилирование H3K4 также было связано со специфической сигнатурой хроматина энхансеров (Cui et al. 2009), последующие эксперименты позволят определить маркирует ли H3K4 также компонент зависимой от энхансера транскрипционной памяти у высших эукариот.
Кроме того, гистоновый вариант H3.3 может участвовать в распространении эпигенетической памяти о состоянии актиной транскрипции. Ng and Gurdon (2008) изучали экспрессию гена MyoD в ядрах трансплантированных эмбрионов, которые были получены в результате переноса ядер от MyoD-экспрессирующих сомитных клеток в энуклеированные оплодотворенные яйца. Они установили, что более половины возникающих в результате эмбрионов экспрессируют ген MyoD в чужеродных типах клеток. Ng and Gurdon (2008) полагают, что эта "несоответствующая" экспрессия результат "памяти" о состоянии транскрипции генов в ядрах, использованных для трансплантации и предоставили доказательства, что может быть связано с H3.3. Хотя механизм, с помощью которого H3.3 закрепляет транскрипционно активные гены, неясен, роль энхансеров в становлении генной транскрипции указывает на то. что они могут участвовать непосредственно или опосредованно. Как только вариант гистона инкорпорируется в активный ген, передача этого состояния дочерним клеткам может служить способом для поддержания транскрипционной активности гена без необходимости в постоянном присутствии. энхансера. Вытекающим из этой модели является мнение, что функциональные промоторные комплексы могут быть собраны в доменах, маркированных H3.3 в отсутствие энхансера. Это мнение напоминает вероятностную модель активации энхансера и может случаться, напр., путем исключения линкерного гистона H1 из промоторов (Braunschweig et al. 2009). H3.3, как было установлено, также ассоциирует с др. гистоновым вариантом , H2A.Z (Jin et al. 2009), чтобы образовывать нестабильные двойные варианты (double-variant) нуклеосом, которые могут увеличивать доступ транскрипционных факторов к промоторам, чтобы активировать транскрипцию. Одной из причин, почему гистоновые варианты могут быть столь привлекательными кандидатами на роль передачи эпигенетического состояния, могут модификации, подобные ацетилированию гистонов, присутствующие в состоянии динамического равновесия, как было установлено, напр., по громадному увеличению уровня ацетилированных гистонов после воздействия на клетки ингибиторами гистоновой деацетилазы, таких как trichostatin A.
Др. механизм передачи памяти об активации генов может быть связан с изменениями в ядерном позиционировании генов (Fig. 1). Несколько недавних исследований подчеркивают передислокацию тканеспецифических генов с периферии ядра в более центральные части ядра (Ruault et al. 2008; Takizawa et al. 2008), ассоциацию транскрипционно активных генов с регионами, обогащенными RNA polymerase, обозначаемых как транскрипционные фактории (Sutherland and Bickmore 2009; Cook 2010) и пространственную ассоциацию функционально родственных генов (Spilianakis et al. 2005; Schoenfelder et al. 2010). Такие наблюдения указывают на присутствие специализированных ядерных субкомпартментов и регулируемых перемещений генов в и из них. У дрожжей, локус GAL перемещается на периферию ядра одновременно с индукцией; это обеспечивается с помощью субъединиц SAGA гистонового acetyltransferase комплекса (Cabal et al. 2006). Интересно, что локализованные на периферии гены GAL1 и INO1 ассоциированы с гистоновым вариантом H2A.Z, который важен для из быстрой реактивации (Brickner et al. 2007). Вполне возможно, что регуляция генов, обусловленная ядерной локализацией, обеспечивается также с помощью цис-регуляторных последовательностей у высших эукариот. В самом деле, LCR-делетированные β-globin локусы неспособны перемещаться с периферии ядра вл время дифференцировки эритроцитов, а по IgH Eµ энхансеру делетированные аллели преимущественно располагаются вблизи периферии ядра по сравнению с аллелями дикого типа (R Sen, unpubl.). необходимо определить могут ли др. классические энхансеры также участвовать в ядерных перемещениях генных локусов.

Concluding remarks


Accumulating evidence supports a broader role for enhancers beyond delivering transcriptional coactivators and/or RNA polymerase to responsive promoters. This broader role is most likely manifested at the level of chromatin structure, and may involve histone modifications, incorporation of variant histones, DNA demethylation, and/or changes in nuclear location. However, the effect of an enhancer on one or more of these chromatin structural features may vary depending on the gene. For example, deletion of the IgH enhancer E? results in significant reduction of histone acetylation up to several hundred kilobases (Chakraborty et al. 2009), whereas deletion of the ?-globin LCR does not affect histone acetylation at all. Yet, both deletions lead to drastically reduced transcription and maintenance of deleted alleles at the nuclear periphery. Reduced histone acetylation characterizes enhancer-deleted alleles of all antigen receptor genes (Mathieu et al. 2000; McMurry and Krangel 2000), and it remains to be determined whether this is a special feature of these genes or, perhaps, a distinction between enhancers that work by themselves or in the context of LCRs. The chromatin structural model of enhancer function does not preclude a requirement for looping of enhancers to other parts of the locus. Indeed, one possibility is that structural chromatin changes created by enhancers may even be necessary to permit looping. The altered chromatin structure may facilitate recruitment of chromatin remodeling complexes or looping-associated DNA-binding proteins, such as CTCF, YY1, and SATB family members. The complexity of enhancer function is exemplified by the observation that the binding of YY1 to the E? enhancer impairs looping without affecting IgH locus transcription (Liu et al. 2007). Perhaps this kind of multitasking by enhancers is one reason for their complex organization and the presence of multiple protein-binding sites.
Finally, what about initiation versus maintenance models of enhancer function? Whereas the data presented by Chong et al. (2010) definitively demonstrate that E4p is required to initiate, but not maintain, Cd4 gene expression, it remains an open question whether this ability is a common feature of enhancers. It is likely that the dispensability of an enhancer after initiation of gene expression will depend on the presence of other regulatory sequences within the locus, the composition of promoters that are activated by an enhancer, and the regulatory complexities associated with the gene. For example, the expression of the Cd4 gene does not seem to require regulation after maturation of cells to the CD4 SP stage. Therefore, the “responsibility” of maintaining gene expression can be transferred to another less-complex enhancer or the Cd4 promoter itself. In contrast, genes that respond to signals by up- or down-regulation may continuously require an enhancer that ensures appropriate modulation of transcriptional activity. Irrespective of the properties of individual enhancers, they initiate a cascade of locus-specific events. Analysis of the sequence of these events and understanding of the function of the molecular players involved remain important goals for the future.
Сайт создан в системе uCoz