С момента открытия, что MEFs могут быть репрограммированы в iPSCs, значительные усилия были направлены на выяснение фундаментальных механизмов этого процесса. Наши результаты впервые показали, что пост-транскрипционная регуляция генов происходит во время репрограммирования и что вмешательство с помощью RNAi аппарата может существенно изменить эффективность репрограммирования. Мы идентифицировали три кластера микроРНК, значительно активируемых с помощью 4-х факторов, используемых для индукции iPSCs и установили, что микроРНК этих кластеров скорее всего воздействуют на два важных пути репрограммирования: передача сигналов TGF-β и контроль клеточного цикла. Когда эти эксперименты были в ходу несколько исследователей также сообщили, что путь p53, который включает нижестоящие опухолевые репрессоры, такие как p21, является главным барьером для индукции iPSC (Banito et al, 2009; Hong et al, 2009; Kawamura et al, 2009; Utikal et al, 2009; Li et al, 2009a). Многочисленные доказательства показывают, что эктопическая экспрессия четырех факторов (OSKM) охотно активирует p53 и инициирует клеточные 'программы защиты', такие как арест клеточного цикла, апоптоз или реакция на повреждения ДНК. Эти реакции, скорее всего, лежат в основе низкой эффективности репрограммирования, которую мы наблюдали равной ~0.1%. Однако эти данные не объясняют, как успешно репрограммированные клетки преодолевают эти барьеры, чтобы стать iPSCs. Наши данные показывают, что это делают частично за счет индукции экспрессии микроРНК, которые нацелены на пути, которые противодействуют успешному репрограммированию. С помощью модуляции уровней микроРНК в первичных фибробластах мы оказались способны достичь существенного увеличения эффективности репрограммирования.

Передача сигналов TGF-β является важным путем, который действует в столь разнообразных процессах, как гаструляция, орган-специфический морфогенез и тканевой гомеостаз (Moustakas and Heldin, 2009). Современная модель канонической трансдукции TGF-β показывает, что TGF-β лиганд соединяется с TGFBR2, который затем гетеродимеризуется с TGF-β receptor 1 (TGFBR1) , чтобы трансдуцировать сигнал через с рецепторами ассоциированные Smads (Kahlem and Newfeld, 2009). Передача сигналов TGF-β по сообщениям действует как в hES , так и mES для самообновления клеток, а FGF2, широко используемый фактор роста для культуры ES клеток, индуцирует экспрессию TGF-β лиганда и супрессирует BMP-подобные активности (Greber et al, 2007; Ogawa et al, 2007). Блокирование семейства киназ TGFBR1 с помощью химических ингибиторов ставит под угрозу самообновление ES клеток (Ogawa et al, 2007). Эти находки особенно важны для индукции iPSC, поскольку эти ингибиторы, по-видимому, выполняют совершенно другие роли во время репрограммирования. Недавний химический скрининг показал, что малые молекулы ингибиторов TGFBR1 действительно повышают шансы индукции iPSC и могут замещать потребность в Sox2 путем индукции экспрессии Nanog (Ichida et al, 2009). Более того, обработка репрограммируемых клеток TGF-β лигандами оказывает негативный эффект на индукцию iPSC (Maherali and Hochedlinger, 2009). Следовательно, хотя передача сигналов TGF-β является важной для самообновления ES клеток, она является барьером для репрограммирования. Наши результаты устанавливают, что в дополнение к TGFBR1, активность постоянно активной киназы TGFBR2 также противодействует репрограммированию. Здесь впервые мы продемонстрировали, что miR-93 и члены её семейства непосредственно нацелены на TGFBR2, чтобы модулировать её передачу сигналов и репрограммирование.

p21, белок лишь из 165 аминокислот функционирует как опухолевой репрессор за счет обеспечения p53-зависимого ареста роста G1 и способствуя дифференцировке и клеточному старению. (Abbas and Dutta, 2009). Наши данные (Supplementary Figure S11) и данные др. (Kawamura et al, 2009) продемонстрировали, что экспрессия p21 активируется, когда четыре фактора (OSKM) вносятся в MEFs и что эта активация противодействует репрограммированию, т.к. избыточная экспрессия p21 почти полностью блокирует индукцию iPSC (Supplementary Figure S16). Индукция p21 в репрограммирующихся клетках может зависеть или не зависеть от p53, т.к. репрограммирующий фактор Klf4 по сообщениям соединяется с промотором p21 и увеличивает транскрипцию p21 (Abbas and Dutta, 2009). Эти находки ставят интересные вопросы относительно функции четырех репрограммирующих факторов, т.к. тот же самый транскрипционный фактор может как способствовать, так и противодействовать индукции iPSC. Фактически мы не может сегодня исключить возможность, что определенный уровень индукции p21 благоприятствует процессу репрограммирования. Помимо хорошо известной роли в p53-зависимом аресте клеточного цикла, p21 по сообщениям также обладает онкогенной активностью путем защиты клеток от апоптоза, функции, не связанной с его обычной ролью в клеточном цикле (Abbas and Dutta, 2009). Потенциальный успех для p21 в репрограммировании может зависеть от его способности регулировать экспрессию генов посредством межбелковых взаимодействий (Abbas and Dutta, 2009). Напр., p21 непосредственно соединяется с некоторыми белками, регулирующими апоптоз, такими как caspases 8 и 10 и procaspase 3. Он также супрессирует проапоптическую активность Myc благодаря ассоциации с Myc N-концом. чтобы блокировать гетеродимеризацию Myc-Max (Abbas and Dutta, 2009). В самом деле, когда Myc сам по себе избыточно экспрессируется в MEFs, наблюдается существенное увеличение клеточной гибели в культуре клеток, тогд как в 4 факторами трансдуцированных клетках клеточная гибель минимальна по сравнению с Myc-only выборками (data not shown). Следовательно, индукция p21 может не только служить в качестве барьера репрограммированию, но и может поддерживать уровни p21, необходимые для снижения апоптоза и таким образом увеличения эффективности репрограммирования. Наши данные служат частичным доказательством, подтверждающим эту гипотезу, т.к. воздействие miR-93 и miR-106b оказывает более значительные эффекты улучшения репрограммирования, чем это делает трансфекция p21 siRNA (Figures 3C, 5A and C). Также возможно, что этот эффект обусловлен задействованием множественных белков, таких как TGFBR2 в добавление к p21 с помощью этих микроРНК.

Наконец, поскольку кластеры микроРНК, идентифицированные здесь, такие как miR-17~92, miR-106b~25 и miR-106a~363, индуцируются во время индукции iPS и законсервированы у мышей и людей, то улучшающие эффекты miR-93 и miR-106b могут быть пригодны для репрограммирования у человека. Дальнейшие исследования д. сфокусироваться на активности этих микроРНК в клетках человека и в различных моделях болезней.