Полярность и слипчивость клеток, как полагают, являются ключевыми детерминантами в развитии организмов и в пролиферации и дифференцировке клеток. У Drosophila опухолевой супрессор, discslarge (dlg), как было установлено, является критическим регулятором этого процесса (Woods et al., 1996; Bilder and Perrimon, 2000). В данном исследовании рассмотрим значение Dlg-1, мышиного гомолога Drosophila dlg, для развития глазного хрусталика мыши.
Глазной хрусталик мыши является идеальной моделью для понимания того, как клеточная полярность и адгезия модулируются in vivo и как они влияют на развитие ткани. Состоя целиком из эпителиальных клеток он является довольно простым органом, являясь частью более сложной органной системы, глаза. Морфологические признаки развития хрусталика прекрасно охарактеризованы. Образование хрусталика начинается с индукции головной эктодермы в хрусталиковую плакоду с помощью лежащей под ней оптического бокала приблизительно на эмбриональный день (E) 9.5 и с его последующей инвагинации, чтобы сформировать хрусталиковый пузырек на ст. E10.5. Вскоре после этого клетки задней половины хрусталика подвергаются терминальной дифференцировке в клетки хрусталиковых волокон, во время которой они удлиняются, чтобы заполнить пузырёк, полностью заполняя пузырек на ст. E13.5 (Piatigorsky, 1981). В этот момент хрусталик состоит из массы дифференцированных клеток хрусталиковых волокон, которые ограничиваются на своей передней поверхности монослоем эпителия. Хрусталик продолжает расти за счёт непрерывного добавления вновь дифференцирующихся клеток из эпителия в компартмент клеток хрусталиковых волокон. К моменту рождения клетки переднего региона эпителия в основном молчащие, тогда как в периферическом регионе, обозначаемом как зародышевая (germinative) зона, активно делятся. Разделившись клетки, мигрируют или смещаются кзади в переходную зону, где они постоянно выходят из клеточного цикла и дифференцируются в клетки хрусталиковых волокон. Будучи дифференцированными клетки хрусталиковых волокон становятся чрезвычайно удлиненными и экспрессируют маркеры дифференцировки, включая β- и γ-crystallins, MIP26 и filensin, и в конечном итоге теряют все связанные с мембранами органеллы (Piatigorsky, 1981). Таким способом хрусталик продолжает расти в течение всей жизни организма, хотя с всё более медленной скоростью по мере старения, это связано, по крайней мере частично, с более медленной скоростью пролиферации эпителия (Piatigorsky, 1981).
Многие факторы, как известно, участвуют в развитии хрусталиков. Среди них pRb из семейства карманных (pocket) белков (Morgenbesser et al., 1994; Pan and Griep, 1994), множественные факторы роста сигнальных путей. такие как FGF, IGF-1, TGF, BMP и Wnt (reviewed in Lovicu and McAvoy, 2005) и белки клеточной адгезии, включая 6 integrin (Walker et al., 2002), 1 integrin (Simirskii et al., 2007) и E- и N-cadherin (Ferreira-Cornwell et al., 2000; Pontoriero et al., 2009). Хотя наше знание индивидуальных факторов, которые вносят вклад в регуляцию пролиферации и дифференцировки хрусталиков, обширны, однако остается неясным, как эти факторы координируются, чтобы гарантировать собственно регуляцию роста и дифференцировки хрусталика.
(PSD-95-Dlg-ZO-1) домен-содержащие белки (PDZ белки) содержат общий домен межбелкового распознавания из приблизительно 80-90 аминокислот (Harris and Lim, 2001). PDZ белки благодаря своим множественным доменам межбелковых взаимодействий (включая PDZ домен), как полагают, действуют как каркасные молекулы, способные собирать крупные макромолекулярные сигнальные комплексы на клеточной мембране. У беспозвоночных, таких как Drosophila melanogaster и Caenorhabditis elegans, два PDZ доменовых белка, Discs large (Dlg) и Scribble (Scrib), как было установлено, играют роль в позиционировании и поддержании компонентов слипчивых соединений и апикальных детерминантов, которые являются критическими для межклеточной слипчивости (Woods et al., 1996; Bilder et al., 2000; Bilder and Perrimon, 2000; Bossinger et al., 2001; Firestein and Rongo, 2001; Koppen et al., 2001; McMahon et al., 2001; Segbert et al., 2004). Мутации Drosophila, dlg или scrib приводят к эктопической локализации слипчивых соединений и апикальных белков в различных эпителиальных тканях, включая эмбриональный эпидермис, имагинальные диски и фолликулярный эпителий. Эпителиальные клетки у этих мутантов Drosophila теряют свою столбчатую форму и обнаруживают дезорганизованный многослойный эпителий. Благодаря этим характеристикам, dlg и scrib были классифицированы как супрессоры неопластических опухолей у этого организма (Woods and Bryant, 1989; Woods et al., 1996; Bilder et al., 2000; Bilder and Perrimon, 2000).
Недавно мы собрали доказательства в подтверждение гипотезы, что PDZ домен-содержащие белки являются критическими факторами в регуляции роста и дифференцировки клеток хрусталиковых волокон. Dlg-1, Scrib, и многочисленные др. PDZ белки экспрессируются по всему глазному хрусталику (Nguyen et al., 2003). Dlg-1 и Scrib ко0-локализуются др. с др. и белками клеточной адгезии E-cadherin, N-cadherin и апикальным белком ZO-1 (Nguyen et al., 2005). Dlg-1 концентрируется на высоком уровне в апикальной области клеток хрусталиковых волокон, как и N-cadherin (Nguyen et al., 2005), где располагаются zonula adherens (Lo et al., 2000; Zampighi et al., 2000) и на базальных кончиках клеток хрусталиковых волокон (Nguyen et al., 2005), где обнаруживается базальный мембранный комплекс (Bassnett et al., 1999). Экспрессия в хрусталике мыши онкопротеина E6 из человеческого papillomavirus type 16 (HPV-16), который соединяется с и инактивирует множественные PDZ белки, включая Dlg (Kiyono et al., 1997; Glaunsinger et al., 2000; Nakagawa and Huibregtse, 2000; Thomas et al., 2002), приводит к дезорганизации и гиперпролиферации эпителия хрусталика, а также к ингибированию дифференцировки клеток хрусталиковых волокон (Pan and Griep, 1994; Nguyen et al., 2002, 2003); и это свойство E6 коррелирует с его способностью соединяться и инактивировать PDZ белки, включая Dlg-1 (Nguyen et al., 2003; Yamben and Griep, unpublished observations). Измененный паттерн пролиферирующих клеток, также как и общее увеличение клеток хрусталикового эпителия мышей, несущих инсерционную мутацию в Dlg-1 (Caruana and Bernstein, 2001; Nguyen et al., 2003), подтверждает, что Dlg-1 может играть важную роль в развитии собственно хрусталика. HPV E6 трансгенные мыши не предоставляют нам возможности различать между эффектами Dlg-1 в противовес др. PDZ белкам. нарушаемым с помощью E6, и они не позволяют нам исследовать эпителиальные фенотипы, которые д. возникать во время эмбриогенеза, т.к. K14 управляемые HPV трансгены экспрессируются только постнатально в хрусталике. Кроме того, фенотипы, наблюдаемые у Dlg gene trap мутантных мышей необходимо рассматривать как некую reservation, т.к.
Dlggt аллель всё ещё содержит три интактных PDZ домена (Caruana and Bernstein, 2001) и, следовательно, не может быть нулевым аллелем. Чтобы понять, необходим ли Dlg-1 специфически для развития хрусталика и если так, то какую роль он играет, мы оценивали эффекты условных делеций Dlg-1 в хрусталиках мышей. Зависимая от условий, делеция
Dlg-1 на ст. хрусталикового пузырька вызывает множественные дефекты как эпителиального компартмента, так и компартмента клеток хрусталиковых волокон, включая дефекты регуляции клеточного цикла, дифференцировки, адгезии и полярности. Напротив, условная делеция
Dlg-1 специфически в клетках хрусталиковых волокон воспроизводит в клетках хрусталиковых волокон дефекты, только указывающие на то, что эффекты Dlg-1 в этих клетках были непосредственными. Эти результаты указывают на то, что Dlg-1 необходим для множественных аспектов развития эпителия и клеток хрусталиковых волокон клеточно-автономным способом.
DISCUSSION
Мы показали, что потеря
Dlg-1 специфически влияет на интегральность, рост и жизнеспособность эпителиальных клеток. Независимо от этого потеря Dlg-1 затрагивает структуру дифференцировку и жизнеспособность клеток хрусталиковых волокон. Мы показали, что эти дефекты коррелируют с дефектами клеточной адгезии, организации цитоскелета и факторов апикально-базальной полярности. Наконец, мы показали, что потеря Dlg-1 ведет к снижению уровней α-catenin, MIP26 и активированного pERK1/2, факторов, которые существенны для поддержания нормальной клеточной архитектуры и дифференцировки клеток хрусталиковых волокон. Т.о., получены доказательства, что Dlg-1 необходим для множественных независимых аспектов образования хрусталика в эпителии и волокнах автономным способом.
Dlg-1 Is Required for Maintaining the Structural Integrity of the Epithelium
С помощью условной целенаправленной делеции Dlg-1 в хрусталиках, начиная со ст. E10.5, мы обнаружили, что потеря Dlg-1 на ст. E13.5 ведет к дезорганизации эпителия, характеризующейся нерегулярными формами клеток и позиционированием, областями многослойности и увеличением общего количества клеток (Figs. 2, 3, 4). Одним из возможных объяснений многослойности является то, что она может быть связана с дефектами ориентации клеточных делений, которые выглядят случайными (data not shown). Хотя многослойность может вносить вклад в дезорганизованное проявление эпителия, огромная часть всё же остается не многослойной (Figs. 2, 3); следовательно, скорее всего, вовлекаются дополнительные факторы. До начала работы предполагалось, что Dlg является негативным регулятором перехода между G1/S фазами (Ishidate et al., 2000; Brumby et al., 2004; Nagasaka et al., 2006). Более того, хрусталики на ст. E19.5 Dlggt/gt
эмбрионов обнаруживали увеличение общего количества эпителиальных клеток и пролиферирующих клеток в переходной зоне (Nguyen et al., 2003). Следовательно, измененная регуляция клеточного цикла в эпителии хрусталика Dlg10 эмбрионов до ст. E13.5 может вносить вклад в увеличение общего количества клеток в эпителии на ст. E13.5 и 17.5. Однако поскольку на ст. P2 не обнаруживается расхождения в количестве эпителиальных клеток между Dlg10 и контрольными мышами (Fig. 4), значит любой эффект потери Dlg-1 в эпителии на регуляцию клеточного цикла является регулируемым во времени. Повышенные количества TUNEL-позитивных клеток в эпителии в этом возрасте указывает на то, что апоптоз задействован (Fig. 5). Однако апоптоз может быть лишь одним из факторов, поскольку увеличение TUNEL-позитивных клеток было небольшим. Необходимы дальнейшие исследования для выяснения роли Dlg-1 в регуляции клеточного цикла в эпителии.
Одним из дополнительных факторов, который может вносить вкад в нерегулярности форму клеток и дезорганизацию эпителия могут быть дефекты апикально-базальной полярности. Исследования на Drosophila показывают. что Dlg необходим для собственно апикально-базальной полярности и образования и поддержания слипчивых соединений (Bilder et al., 2003). В нашем исследовании мы установили, что белок плотных соединений и маркер полярности ZO-1 больше не ограничивается точечными регионами на апикальной поверхности центральных эпителиальных клеток в хрусталиках Dlg10 мышей; вместо этого, ZO-1 кроме того обнаруживался вдоль базально-латеральной поверхности (Fig. 12). Конечно плотные соединения обнаруживаются только в центральном эпителии хрусталика (Lo et al., 2000; Zampighi et al., 2000) и , следовательно, плотные соединения могут подвергаться риску в Dlg-1-дефицитном эпителии. Др. факторами, которые могут вносить вклад в неправильности клотчных форм в эпителии могут быть дефекты межклеточной адгезии. Предыдущие исследования культур клеток млекопитающих показали. что Dlg-1 локализуется в местах межклеточной адгезии (Reuver and Garner, 1998). В нашем исследовании мы наблюдали, что нормальное распределение E-cadherin в эпителиальных клеточных мембранах и перекрывающегося с ним α-catenin нарушается в эпителии Dlg10 мышей (Fig. 8), указывая тем самым, что потеря Dlg-1 в этих клетках вызывает дефекты межклеточной адгезии. Т.о., потеря Dlg-1 в хрусталиках вызывает нарушение распределения и уровней факторов полярности и адгезии, указывая тем самым, что Dlg-1 необходим для образования и/или поддержания апикально-базальной полярности и слипчивых соединений в хрусталике.
В нашем исследовании мы идентифицировали
in vivo пример потребности в Dlg-1 для собственно локализации факторов полярности таких как ZO-1 и факторов адгезии, таких как E-cadherin. Интересно, что изменения распределения ZO-1 или E-cadherin не обнаруживают дефектов мочеполового тракта у
Dlggt/gt (Naim et al., 2005) или
Dlg-1 нулевых (Iizuka-Kogo et al., 2007) мышей. Т.о., потеря Dlg-1 не оказывает ткане-специфических эффектов на клеточную полярность и адгезию у мышей. Единственным объяснением этих различий может быть то, что в мочеполовом тракте др. факторы, такие как др. члены Dlg семейства могут выполнять перекрывающую роль и/или компенсировать потерю Dlg-1.
Dlg-1 Is Required in Fiber Cells for Cell Structure and Differentiation
У Dlg10 и Dlg39 мышей потеря Dlg-1 ведет к множественным дефектам в морфологии клеток хрусталиковых волокон, включая дефекты в организации bow региона, элонгации клеток хрусталиковых волокон и к дефектам шва, рыхло упакованных волокон и вакуолей, и к дефектам вогнутого (concave) изгиба волокон (Figs. 2, 3). Кроме того, TUNEL-позитивные ядра сохранялись в ядре хрусталика (Fig. 5H,I,K,L), указывая, по крайней мере, на задержку программы денуклеации. Тот факт, что тот же самый фенотип может наблюдаться в клетках хрусталиковых волокон у Dlg39 мышей указывает на то, что Dlg-1 играет в клетках хрусталиковых волокон автономную роль в развивающемся хрусталике. Более того, наблюдение, что TUNEL-позитивные ядра наблюдаются в кортикальных волокнах только на ст. P2 (Fig. 5H,I,K,L), тогда как дефекты в дифференцировке уже очевидны на ст. E17.5 (Figs. 2E-I, 6A-F), может указывать на то, что эти дефекты накапливаются определенное время и в конечном итоге становятся достаточно тяжелыми, чтобы запустить апоптоз в хрусталиках. Альтернативно могут существовать зависимые от времени сигналы, необходимые для запуска апоптоза в хрусталиках Dlg10 и Dlg39 мышей. Морфология и перемещения клеток хрусталиковых волокон существенно зависят от пластичности межклеточной адгезии, адгезии клетка-матрикс и взаимодействия этих адгезий с подлежащим цитоскелетом (Zelenka, 2004). В частности, N-cadherin необходим для дифференцировки клеток хрусталиковых волокон (Pontoriero et al., 2009) , а связи с участием N-cadherin (Ferreira-Cornwell et al., 2000) и актинового цитоскелета (Maddala et al., 2008) , как было установлено, важны для этого процесса. Ранее мы показали, что Dlg-1 концентрируется в большом количестве на апикальном и базальном концах клеток хрусталиковых волокон, где он строго ко-локализуется с N-cadherin (Nguyen et al., 2005). В данном исследовании мы показали, что морфологические аномалии, наблюдаемые в хрусталиках Dlg10 и Dlg39 мышей (Figs. 2, 3) ассоциированы с нарушением перекрывания между N-cadherin и α-catenin (Figs. 9A-D, 10A-F) and α-catenin и β-actin (Fig. 10G-L) в клетках кортикальных хрусталиковых волокон. Кроме того, организация актинового цитоскелета (Fig. 11) нарушалась, особенно в апикальных регионах клеток хрусталиковых волокон, это может быть результатом нарушения zonula adherens, области, где Dlg-1 обычно обнаруживается в высокой концентрации и строго ко-локализуется с N-cadherin (Nguyen et al., 2005). В базальной капсуле накопление α-catenin (Fig. 10B,E) и регулярная организация кончиков клеток хрусталиковых волокон по отношению к капсуле хрусталика нарушены (Fig. 9I-K). Эти данные указывают на то, что дефицит Dlg-1 может приводить к наблюдаемым дефектам структуры клеток хрусталиковых волокон из-за дефектов сцепления между адгезией и цитоскелетом. Дефекты в удлинении клеток хрусталиковых волокон, аномальное накопление ядер в переходной зоне, дезорганизация актинового цитоскелета и обширная вакуолизация клеток хрусталиковых волокон наблюдаются в хрусталиках мышей с условно лишенными Cdh2 (N-cadherin) (Pontoriero et al., 2009). Эти сходства фенотипов Dlg-1-дефицитных и Cdh2-дефицитных хрусталиков подтверждают гипотезу, что Dlg-1 является модулятором функции N-cadherin.
Интересно, что окрашивание на α-catenin, по-видимому, уменьшается в клетках хрусталиковых волокон у
Dlg10 и Dlg39 мышей (Figs. 9E-G, 10B,E), наблюдение, подтвержденное immunoblot анализом с использованием белковых экстрактов из клеток хрусталиковых волокон от
Dlg39 мутантов (Fig. 7). Отметим, что роль Dlg-1 в поддержании уровней α-catenin ранее не была описана. Выраженная дезорганизация актинового цитоскелета может быть следствием снижения уровня α-catenin и аберраций в сигнальных путях, которые ассоциируют с организацией цитоскелета. Недавно было показано, что повышенные концентрации α-catenin позволяют этой молекуле гомодимеризоваться, это наделяет её способностью взаимодействовать с филаментами актина (Drees et al., 2005). Организация цитоскелета также ставится под угрозу, когда активность RhoGTPase подавляется в клеток хрусталиковых волокон (Maddala et al., 2008). Необходимы дальнейшие исследования для выяснения механизма, с помощью которого потеря Dlg-1 ведет к снижению уровней α-catenin и дезорганизации актинового цитоскелета.
Dlg-1 as a Modulator of ERK1/2 Activation
Мы прорверяли эффект потери Dlg-1 на экспрессию маркеров клеток хрусталиковых волокон β-crystallin и MIP26 (Graw, 1997; Chepelinsky, 2003) и на повышение уровней pERK1/2 (Lovicu and McAvoy, 2001). Мы не наблюдали очевидных изменений в уровне или паттерне экспрессии β-crystallin (Fig. 6J-L, and data not shown). Это согласуется с предыдущими сообщениями, показавшими с помощью иммунофлюоресценции, что активация β-crystallin во время дифференцировки клеток хрусталиковых волокон не зависит от pERK1/2 (Lovicu and McAvoy, 2001). Мы также наблюдали небольшое уменьшение MIP26 (Fig. 7), хотя паттерн экспрессии MIP26 не менялся (Fig. 6G-I). Уменьшение MIP26 согласуется с находками Golestaneh et al. (Golestaneh et al., 2004), которые установили, что фармакологическое ингибирование активности ERK в системе эксплантов крыс ведет к снижению экспрессии MIP26. Интересно, что уровни pERK1/2, по-видимому, снижены во вновь дифференцирующихся клетках хрусталиковых волокон у Dlg10 и Dlg39 мышей (Fig. 6A-F). Анализ экстрактов из клеток хрусталиковых волокон от Dlg39 мышей подтвердил, что уровни pERK1/2 были снижены, тогда как уровни общей ERK1/2 оставались неизменными (Fig. 7). Это первое сообщение. указывающее на роль Dlg-1 в регуляции активации ERK.
Одним из объяснений пониженных уровней pERK1/2 при потере Dlg-1 является то, что клеточная адгезия (Figs. 7, 9, 10) и актиновый цитоскелет нарушены (Fig. 11). В соответствии с ролью Dlg-1 как каркасной молекулы, ассоциированном с этим нарушением д. быть неспособность собирать корректно белковые комплексы для эффективного ERK фосфорилирования. Каркасные белки, как было установлено, необходимы для корректной локализации ERK1/2 на белковые комплексы для фосфорилирования (Ramos, 2008). Один известный белок является каркасной и актин связывающей молекулой IQGAP1, который может связывать несколько членов ERK1/2 пути и может активировать ERK1/2 в ответ на стимулы ростового фактора (Brandt and Grosse, 2007; Ramos, 2008).
Др. возможным объяснением пониженных уровней pERK1/2 в дефицитных по Dlg-1 клетках хрусталиковых волокон является то, что Dlg-1 модулирует ростовой фактор сигнальных путей, которые участвуют в дифференцировке клеток хрусталиковых волокон посредством активации ERK. Было показано, что передача сигналов FGF необходима для дифференцировки клеток хрусталиковых волокон (McAvoy and Chamberlain, 1989; Chow et al., 1995; Robinson et al., 1995, 1998; Lovicu and Overbeek, 1998; Stolen and Griep, 2000; Zhao et al., 2008) и что FGF-индуцированная дифференцировка нуждается в непрерывных пульсовых воздействиях pERK1/2 (Iyengar et al., 2007). Др. факторы роста сигнальных путей, такие как BMP (Faber et al., 2002), TGF (de Iongh et al., 2001; Faber et al., 2002), integrin (Walker et al., 2002; Simirskii et al., 2007) и неканоническая передача сигналов Wnt(Chen et al., 2004, 2006, 2008) также известны, как влияющие на дифференцировку клеток хрусталиковых волокон, а эти сигнальные пути связаны с активацией pERK1/2 (Walker et al., 2002; Golestaneh et al., 2004; Lyu and Joo, 2004; Iyengar et al., 2007). Сходство хрусталиковых фенотипов мышей , у которых FGF (Chow et al., 1995; Robinson et al., 1995; Stolen and Griep, 2000), Wnt (Chen et al., 2008) и integrin (Walker et al., 2002) пути ингибированы указывает на то, что они могут быть возможными мишенями для Dlg-1. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить какой путь или пути и сигнальные каскады модулируются с помощью Dlg-1 в хрусталиках.
CONCLUSIONS
Dlg-1 is required in both the epithelium and the fiber cell compartment for regulating epithelial structure and fiber cell differentiation and may do so, at least in part, through the regulation of cell polarity, cell– cell adhesion and cytoskeletal organization. Our findings also describe novel roles for Dlg-1 in maintaining α-catenin and MIP26 levels and pERK1/2 activation, which are essential for maintaining normal cell architecture and fiber cell differentiation.
Сайт создан в системе
uCoz 