Полученные результаты выявили незаменимую роль Dicer в развитии хрусталика и роговицы мыши. Поскольку Dicer прежде всего катализирует созревание miRNA у млекопитающих (Ambros et al., 2003; Lippman and Martienssen, 2004; Calabrese et al., 2007; Babiarz et al., 2008), поэтому наше исследование выявило участие miRNAs в ключевых аспектах развития хрусталика и роговицы. Хотя Dicer, как было установлено, участвует в биогенезе эндогенных siRNAs в ооцитах мыши (Tam et al., 2008; Watanabe et al., 2008), секвенирование видов малых РНК от Dicer-нулевых стволовых клеток (Calabrese et al., 2007) подтвердило, что дефекты, наблюдаемые при делеции Dicer возникают в результате потери miRNAs скорее, чем др. видов малых РНК.

Прогрессирующая дистрофия хрусталиков у DicerCN эмбрионов мыши сопровождалась микрофталмией и подтвердила идею, что хрусталик является организатором развития переднего сегмента глаза (Coulombre, 1969; Beebe and Coats, 2000; Yamamoto and Jeffery, 2000; Kurita et al., 2003; Strickler et al., 2007). Тяжелая микрофталмия у DicerCN мышей напоминает таковую у трансгенных мышей, у которых хрусталики устранялись в результате хрусталик-специфической экспрессии трансгена дифтирийного токсина (Zhang et al., 2007). Индуцированные дифтирийным токсином микрофталмические глаза имели плохо дифференцированные цилиарное тело и радужку, складчатую сетчатку и не обнаруживали признаков передней камеры. Помимо основных аномалий в передних регионах DicerCN глаз, сетчатка DicerCN мышей, хотя и была сморщенной (convoluted), оставалась многослойной и имелр дифференцированные слои клеток у новорожденных. Мы наблюдали, однако, усиление клеточной гибели в сетчатке DicerCN на ст. E16.5 (data not shown), указывая тем самым на роль хрусталика в жизнеспособности клеток сетчатки , особенно внутренней части сетчатки (Strickler et al., 2007).

Развивающиеся веки были неспособны мигрировать и сливаться во время эмбриогенеза, вызывая дефект eye-open at birth (EOB) у DicerCN мышей. Было показано, что слияние век выполняет защитную роль для развивающихся глаз, особенно роговицы (Teramoto et al., 1988). Т.о., неспособность к слиянию век может влиять на созревание роговицы у DicerCN мышей. С др. стороны, развитие роговичного эпителия было затронуто в меньшей степени, чем хрусталика, несмотря на одновременную делецию fioxed Dicer в обеих тканях. Роговичный эпителий взрослых DicerCN мышей, однако, плохо стратифицирован и обнаруживает крупные вакуоли. Пока неясно, эти дефекты стратификации роговичного эпителия обусловлены автономной ролью Dicer и miRNA в развитии роговицы или они вторичны, обусловлены дистрофией хрусталика и/или дефектами век.

Повышенный апоптоз в DicerCN хрусталиках вместе с пониженной клеточной пролиферацией приводят к массивной дистрофии хрусталиков между E14.5 - E18.5. Анализ микромассивов дифференциальной генной экспрессии в хрусталиках DicerCN на ст. E13.5 показал, что многие гены, участвующие в P53 пути, были активированы. Среди них, Tp53inp1, Cdkn1a (p21Cip), Serpine2, и Tnfrsf10A являются ключевыми регуляторами клеточной гибели и ареста клеточного роста (Okamura et al., 2001; Baetu and Hiscott, 2002; Jackson and Pereira-Smith, 2006; Kortlever and Bernards, 2006). Более того, фенотипы хрусталиков DicerCN напоминают P53-зависимую дистрофию хрусталиков у Creb2-дефицитных мышей (Tanaka et al., 1998; Hettmann et al., 2000). В обоих случаях инициальные стадии развития хрусталиков, включая образование оптического пузырька и элонгацию первичных хрусталиковых волокон, были нормальными. Однако, приблизительно на ст. E14.5 эпителиальные клетки хрусталиков подвергались массивному апоптозу, вызывая афакию у новорожденных. Наши данные т.о. показывают, что активация сигнального пути P53 может играть важную роль в дистрофии хрусталиков, индуцированной с помощью делеции Dicer и miRNA. В самом деле, недавние исследования выявили участие множественных miRNAs в P53 сети, или в качестве нижестоящих эффекторов (He et al., 2007), или вышестоящих регуляторов P53 и/или его модификаторов (Rane et al., 2009). Развитие хрусталика нуждается в последовательной активации сигнальных путей множественных транскрипционных факторов и факторов роста. Наше исследование микромассивов и иммуноокрашивание показали, что после глобального удаления miRNAs, уровни экспрессии транскрипционных факторов (Pax6, Prox1, Pitx3, Foxe3, Tcfap2a и Sox2), которые, как известно, управляют развитием хрусталика (Ogino and Yasuda, 2000; Cvekl and Duncan, 2007) не были достоверно изменены (прямо или косвенно) перед дистрофией хрусталиков. Прогрессирующая дистрофия хрусталиков у DicerCN мышей контрастирует с фенотипом микрофталмии, вызываемой делециями одного из упомянутых выше транскрипционных факторов. Напр., дефекты образования хрусталикового пузырька обнаруживались самое раннее на ст. E10.5, если Pax6 (Ashery-Padan et al., 2000) был условно накаутирован с использованием той же самой Le-Cre трансгенной линии, используемой у DicerCN мышей. Кроме того, делеция Foxe3 (Miller et al., 2006) или Tcfap2a (Miller et al., 2006; Pontoriero et al., 2008a) приводила к дефектам отделения хрусталикового пузырька от поверхностной эктодермы между E9 и E10. В данном исследовании потеря экспрессии Pax6 на поздних ст. развития совпадала с прогрессирующей дистрофией хрусталиков. Возможно, что целенаправленная делеция Dicer влияет на экспрессию Pax6 на поздних стадиях развития благодаря относительно продолжительному периоду полу-жизни участвующих зрелых miRNAs. Альтернативно, наши наблюдения могут указывать на то, что потеря критических транскрипционных факторов в DicerCN хрусталиках была скорее следствием, чем причиной дистрофии хрусталиков; и что регуляция развития хрусталиков с помощью miRNAs оперирует ниже последовательной активации специфичных для хрусталиков транскрипционных факторов. Наши данные по микромассивам открывают возможность того, что пониженная экспрессия генов β- и γ-crystallin вносит вклад в дистрофию хрусталиков у DicerCN мышей. γ-crystallins, в частности, специфичны для хрусталиков (Sinha et al., 1998), а γS-crystallin, который присутствует на высоком уровне в клетках хрусталиковых волокон, связан с дистрофией хрусталика и катарактой (Sun et al., 2005). Экспрессия Fgfr2 также подавляется в DicerCN хрусталиках.

Передача сигналов FGF участвует в индукции хрусталиков (Faber et al., 2001) и в дифференцировке клеток хрусталиковых волокон (Lang, 1999). Fgfr2 необходим для дифференцировки клеток хрусталиковых волокон (Robinson, 2006). Fgfr2 условно нулевые хрусталики обнаруживают усиленный апоптоз на ст. E12.5, как и в DicerCN хрусталиках, и дегенерируют после рождения (Garcia et al., 2005). Фенотипическое сходство между Dicer и Fgfr2 условными нокаутными мышами указывает на то, что регуляция уровней Fgfr2 в развивающихся хрусталиках может быть путем. посредством которого Dicer и miRNAs способствуют развитию хрусталиков.

Наконец, хотя и спекулятивно, может быть интересным рассмотрение возможности, что некоторые miRNAs вносят вклад в дифференцировку хрусталиков за счёт супрессии экспрессии белок-кодирующих генов, которые управляют non-ocular клеточными судьбами. Itgb8 является примером активации гена в хрусталиках DicerCN, который участвует сосудистом морфогенезе скорее, чем в дифференцировке хрусталиков (Zhu et al., 2002). Др. активируемые гены в DicerCN хрусталиках участвуют в развитии различных тканей, это Eya1 (ear and kidney) (Xu et al., 1999), Klf-10 (bone morphogenesis) (Subramaniam et al., 2005; Hawse et al., 2008), Prkcd (immune tolerance) (Miyamoto et al., 2002), и Pik3cg (thymocyte development) (Sasaki et al., 2000). Функции miR-133 в развитии мезодермы (Ivey et al., 2008) и miR-196 в развитии конечностей (Hornstein et al., 2005) представляют собой примеры такого "fail-safe" механизма супрессии экспрессии генов, которые не участвуют в развитии соответствующей специфической ткани. Т.о., мы полагаем. что хрусталиковые miRNAs могут служить на вторичном уровне, ограничивая экспрессию генов, которые могут вмешиваться в собственно развитие хрусталиков. Идентификация генов мишеней для miRNA позволит дальнейшие исследования роли многих miRNAs, которые динамически экспрессируются в развивающихся хрусталике и роговице.