Исследовали стоукьуру хромосом и гистоновые модификации в первичных фибробластах человека, происходящих из нескольких анатомических мест¹², и установили достоверные отличия по локусу HOXA. High throughput chromosome conformation capture (5C)¹³ по HOXA показало, что его высшего порядка структура зависит от качественных особенностей расположения. В анатомически удаленных клетках (напр., фибробласты крайней плоти и ног), мы выявляли обильные взаимодействия хроматина с транскрипционно активным локусом 5' HOXA (с учетом направлений транскрипции избранных Hox генов), указывающие на компактную и петлеобразную конформацию. Напротив, не выявлено дальнодействующих взаимодействий хроматина внутри транскрипционно молчащих 3' HOXA, которые, по-видимому, в основном линейны (Fig. 1a). Поразительно, анатомически близкие клетки (напр., легочные фибробласты) имели диаметрально противоположные паттерны. Состояния ВКЛ и ВЫКЛ Hox и др. ключевых онтогенетических генов поддерживаются с помощью MLL/Trithorax (Trx) и polycomb group (PcG) белков, которые обеспечивают триметилирование гистона H3 по лизину 4 (H3K4me3) , чтобы активировать гены, или по лизину 27 (H3K27me3), чтобы репрессировать гены¹⁴. Пропорции HOXA в тесном физическом взаимодействии маркированы с помощью широких доменов H3K4me3, тогда как H3K27me3 маркирует физически расширенные и транскрипционно молчащие регионы (Fig. 1a).

На каждом 5' и 3' краю из двух соотв. кластеров взаимодействия имеются два локуса lincRNA , которые обладают разными модификациями хроматина. 3' элемент был идентифицирован ранее как с миелопоэзом ассоциированная lincRNA HOTAIRM1 (ref. 15). 5' элемент, для которого мы предложили название HOTTIP для 'HOXA transcript at the distal tip', обладает бивалентом H3K4me3 и H3K27me3, паттерном гистоновой модификации, ассоциированным с уравновешенной регуляторной последовательностью¹⁶. Сравнение расположения RNA polymerase II и экспрессии РНК, показало, что бивалент модификаций H3K4me3 и H3K27me3 на HOTTIP гене, не требует транскрипции HOTTIP, но транскрипция HOTTIP ассоциирует с повышенным H3K4me3 и пониженным уровнем H3K27me3 (Fig. 1a, left). Chromatin immunoprecipitation (ChIP) анализ подтвердил, что HOTTIP ген оккупируется как polycomb repressive complex 2 (PRC2), так и MLL комплексом, в соответствии с бивалентными гистоновыми метками (Supplementary Fig. la).

Транскрипция HOTTIP дает в 3,764-нуклеотидов, сплайсированную и полиаденилированную lincRNA, которая дает начало ~330 основаниям выше HOXA 13. Транскрибируется лишь антисмысловая нить HOXA генов (Supplementary Fig. lb). Гены вблизи 5' конца каждого HOX кластера обнаруживают тенденцию экспрессироваться в более задних и/или дистальных анатомических положениях. В соответствии с её геномной локализацией на 5' конце HOXA 13, HOTTIP экспрессируется в дистальных и/или задних анатомических сайтах (Fig. 1b). In situ гибридизация развивающихся эмбрионов мышей и кур подтвердила, что HOTTIP экспрессируется в задних и дистальных сайтах in vivo, указывая на законсервированный паттерн экспрессии от развития до взрослого состояния (Fig. 1c and Supplementary Fig. 1c). Даже в дистальных клетках, где экспрессируется HOTTIP, уровень его РНК очень низкий и вычисляется как ~0.3 копии на клетку (Supplementary Fig. 2).

Использовали small interfering RNAs (siRNAs) , чтобы вызывать нокдаун РНК HOTTIP в фибробластах с дистального анатомического места (крайняя плоть) и исследовали экспрессию 5' HOXA генов с помощью количественной обратной транскрипции PCR. Отметим, что нокдаун РНК, HOTTIP устраняет экспрессию дистальных HOXA генов на расстояние в 40 kilobases с тенденцией зависимости от расстояния до HOTTIP. Наиболее сильная блокада наблюдалась для HOXA 13 и HOXA11, со всё менее тяжелыми эффектами на HOXA1O, HOXA9 и HOXA7 (Fig. 2a). Эффект на транскрипцию генов, по-видимому, однонаправленный, поскольку не обнаруживается соотв. изменений в уровниях EVX1, локализованного на расстоянии ~40 kilobases 5' от кластера HOXA (data not shown). Нокдаун HOTTIP не затрагивает экспрессию высоко гомологичных HOXD генов, др. контролирующих генов, не индуцирует антисмысловую транскрипцию в своем собственном локусе (Fig. 2b, Supplementary Fig. 3a). Несколько независимых siRNAs, нацеленных на HOTTIP, давали сходные результаты (Supplementary Fig. 3b). Эти результаты указывают, что РНК HOTTIP RNA необходима для координации активации 5' HOXA генов.

Затем мы обратились к функции РНК HOTTIP in vivo в развивающемся зачатке конечности эмбрионов кур (Fig. 2c). До генетических исследований некодирующих РНК (ncRNAs), участвующих в делеции или инсерции в генный локус, мы не могли различать функцию РНК HOTTIP от соотв. элемента ДНК. Ген HOTTIP может запускать транскрипцию независимо от метилирования H3K4 и H3K27 (Fig. 1a), а точное геномное расстояние между вышестоящими энхансерными элементами и Hox генами является критическим для их собственно колинеарной активации¹⁷. Поэтому мы использовали RNA interference (RNAi) у эмбрионов кур, у которых компетентные к репликации ретровирусы могут высвобождать РНК с короткими шпильками (shRNAs) с высокой пенетрантностью и точным пространственно-временным контролем¹⁸ (Supplementary Fig. 4). В зачатке конечности 5' HoxA гены транскрибируются в виде гнездового паттерна вдоль проксимо-дистальной оси¹⁹. В этой ткани функция HoxA сильно перекрывается с таковой локусаHoxD, это позволило нам оценить паттерны измененной экспрессии HoxA без существенных изменений анатомических меток²⁰. Мы инъецировали ретровирусы, несущие shRNAs против куриного HOTTIP, в зачатки верхних конечностей на стадии 13 у кур; RT-PCR и гибридизация in situ проводились как в контрольных, так и подвергнутых нокдауну выборках спустя 2-4 дня. Нокдаун РНК HOTTIP с помощью двух независимых shRNAs в зачатках конечностей сни жал экспрессию HoxA13, HoxA11 и HoxA10-опять же с градированным эффектом, зависимым от геномной близости к гену HOTTIP. Вектор контрольный или с shRNA, который неспособен истощать HOTTIP РНК, оказывают незначительное влияние на экспрессию Hox генов вдоль линейного генома (Fig. 2d). In situ гибридизация целого эмбриона (Fig. 2e) и срезов (Supplementary Fig. 5) показала, что РНК HOTTIP наиболее сильно влияет на экспрессию генов HoxA gene на дистальном крае развивающегося зачатка конечностей, где 5' HoxA гены экспрессируются наиболее сильно. На стадии 36 конечности, истощенные по РНК HOTTIP. обнаруживают заметное укорочение и искривление дистальных костных элементов, включая radius, ulna и третий палец (~20% уменьшение длины для каждого сравнения с контралатеральной и stage-matched конечности, обработанной контрольным вирусом, P < 0.05, Student's t-test, Fig. 2f). Этот фенотип напоминает некоторые дефекты мышей, лишенных HoxA11 и HoxA13 (refs 21-23). Итак. эти данные указывают на то, что HOTTIP РНК контролирует активацию дистальных Hox генов in vivo.

Широкое влияние HOTTIP РНК на активацию генов вдоль HOXA локуса напоминает широкие домены модификаций хроматина, демаркирующие активные и молчащие домены хромосом¹². 5C анализ контрольных и HOTTIP-итощенных клеток выявил незначительные изменения в структуре хромосом высшего порядка, указывая, что образование петель хромосомами является предварительно сконфигурированным и стоящим выше генной экспрессии HOTTIP РНК. Напротив, нокдаун HOTTIP РНК приводит к широкой потере H3K4me3 и H3K4me2 вдоль HOXA локуса, особенно выраженной в 5' HOXA и самом гене HOTTIP (Fig. 3a, Supplementary Figs 6b and 7). Нокдаун HOTTIP РНК также увеличивает H3K27me3 фокально над геном HOTTIP, но оказывает незначительное влияние на H3K27me3 вдоль HOXA. Эти результаты указывают на то, что HOTTIP РНК необходима для поддержания H3K4me3 вдоль HOXA. Эти находки также указывают на то, что потеря транскрипции 5' HOXA генов в ответ на нокдаун HOTTIP РНК скорее всего обусловлена потерей H3K4me3 (или др. изменениями) скорее. чем эктопическим распространением H3K27me3.

Метилирование H3K4 локусов HOX осуществляется с помощью семейства комплексов MLL²⁴. У млекопитающих, по крайней мере, 6 членов семейства MLL из SET-домен-содержащих лизин метилтрансфераз взаимодействуют с основным комплексом из WDR5, ASH2L, RBBP5, а также др. белков, для распознавания субстрата и геномного таргетинга²⁴. Генетический анализ показал, что MLL1 и 2 наиболее важны для экспрессии HOX генов в фибробластах²⁵, а MLL1, в частности, доставляется на промоторы генов HOX для поддержания их в активном состоянии²⁶. В происходящих из крайней плоти фибробластах MLL1 и WDR5 плотно оккупируют расширенный регион 5' HOXA кластера, совпадающий с доменом H3K4me3, с 'пиками' оккупации вблизи transcriptional start sites (TSS) множественных 5' HOXA генов (Fig. 3b). Поразительно, нокдаун HOTTIP РНК устраняет пики MLL1 и WDR5, располагающиеся вблизи TSS, приводя к диффузному и менее интенсивному связыванию MLL1 и WDR5 вдоль кластера HOXA, наиболее выраженному поверх 5' HOXA домена. Нокдаун HOTTIP РНК также ведет к усиленному накоплению MLL1 и WDR5 на самом гене HOTTIP (Supplementary Fig. 8). Т.о., HOTTIP РНК, по-видимому, является критической для поддержания специфического паттерна оккупации MLL комплексом вдоль локуса HOXA, чтобы облегчить H3K4me3 и активную транскрипцию.

Чтобы устанавливать молекулярную связь между HOTTIP РНК и комплексом MLL, мы полагаем, что HOTTIP РНК может физически взаимодействовать с одной или несколькими субъединицами комплекса MLL. Очищенная, in-vitro-транскрибированная, полной длины HOTTIP РНК связывается специфически с рекомбинантным glutathione-S-transferase-conjugated WDR5 (GST-WDR5), но не с GST, RBBP5, ASH2L или теломерным белком TRF1 (также известным как TERF1; Fig. 4a, b). С конец MLL1, содержащий домен SET, связывается неспецифически со всеми РНК, что согласуется с предыдущим исследованием²⁷. После иммунопреципитации эндогенного WDR5 из двух разных клеточных линий, каждый специфически восстанавливал эндогенную HOTTIP РНК (Fig. 4c), указывая тем самым, что WDR5 и HOTTIP РНК взаимодействуют в живых клетках.

Иммунопреципитация эпитопом-нагруженного WDR5 из стабильной клеточной линии, которая перед этим позволяет стоихометрическую очистку белков, взаимодействующих с WDR5²⁸ , также специфически восстанавливала HOTTIP РНК (Supplementary Fig. 9). Нокдаун WDR5 широко ингибирует экспрессию 5' HOXA генов и также устраняет транскрипцию HOTTIP, демонстрируя взаимную зависимость между HOTTIP РНК и WDR5 (Fig. 4d).

HOTTIP РНК, по-видимому, регулирует гены в цис-положении в соответствии их низкому количеству копий, в зависимости от расстояния HOXA генов мишеней, активируемых на эндогенном HOTTIP, и физической близости HOTTIP и её генов мишеней, как показывает 5C анализ. В самом деле, эктопическая экспрессия HOTTIP РНК с помощью ретровирусной трансдукции легочных фибробластов, которые не экспрессируют HOTTIP, неспособна активировать экспрессию дистальных HOXA генов, и не изменяет паттернов H3K4me3 и H3K27me3 вдоль HOXA (Supplementary Fig 10). Более того, в фибробластах крайней плоти, которые экспрессируют эндогенную HOTTIP, эктопическая экспрессия HOTTIP не индуцирует 5' HOXA гены, не устраняет эффекты истощения эндогенной образующейся HOTTIP РНК (Supplementary Fig. 11). Отсутствие реакции в фибробластах крайней плоти примечательно, поскольку эндогенная HOTTIP РНК активна в этих клетках, указывает, что присутствуют все белковые партнеры HOTTIP , а гены мишени восприимчивы. Эктопически экспрессируемая HOTTIP РНК, будучи транскрибированной с сайтов инсерции ретровирусов, случайно разбросана по геному, и может оказаться неспособной находить 5' HOXA гены. Напротив, эндогенная HOTTIP РНК, непосредственно расположенная вблизи 5' HOXA генов с помощью образования петель хромосомами, делает возможным взаимодействие и контроль.

Чтобы тестировать потребность в экзогенном механизме поставки, мы создали аллель HOTTIP РНК, которые может быть рекрутирован искусственно на репортерный ген. Добавление пяти копий BoxB РНК элемента²⁹ к HOTTIP РНК позволяет слитому транскрипту быть рекрутированным на ^N РНК связывающий домен, слитый с GAL4 ДНК-связывающим доменом (Fig. 4e). Рекрутирование HOTTIP РНК на молчащий GAL4 промотор недостаточно для инициации транскрипции, но может существенно усиливать транскрипцию, если промотор также связывает WDR5 и транскрипционно активен (Fig. 4e). Из-за отсутствия связи между местом транскрипции HOTTIP и функции HOTTIP РНК, этот эксперимент показал, что близость HOTTIP РНК-скорее, чем действие транскрипции - поддерживает экспрессию генов мишеней. Для дальнейшего подтверждения функциональности HOTTIP РНК, делеционный анализ идентифицировал домен в ~1 kb в 5' HOTTIP РНК (HOTTIPEmns 1 ~2) , который сохраняет активность связывания WDR5 (Supplementary Fig. 12a). Форсированная избыточная экспрессия HOTT ^{Irons 12} в фибробластах крайней плоти ингибирует экспрессию 5' HOXA гена, по-видимому, доминантным негативным способом (Supplemental*)' Fig. 12b).

Итак, HOTTIP РНК является ключевым контрольным элементом HOXA генов и качественных особенностей этих дистально расположенных генов. Образование хромосомами петель приводит HOTTIP РНК в тесную близость с 5' HOXA генами. Транскрипция HOTTIP действует как переключатель для продукции HOTTIP lincRNA, которая соединяется с и доставляет WDR5-MLL комплексы на 5' HOXA локус, давая широкий домен H3K4me3 и активируя транскрипцию (Supplementary Fig. 13). Взаимная взаимосвязь между HOTTIP РНК и WDR5 создает позитивную петлю обратной связи, которая поддерживает состояние локуса ВКЛ. Эти находки лежат в основе обобщенного мнения, связывающего трехмерную организацию генома с динамично программируемыми состояниями хроматина и в конечном итоге с формированием онтогенетических паттернов.

Метилирование H3K4 является свойством почти всех транскрибируемых генов, а белки семейства MLL участвуют во многих решениях клеточных судеб в развитии и при болезнях²¹. Наши находки подтверждают, что дополнительные lincRNAs, особенно те, которые ассоциированы с энхансерами или энхансер-подобными активностями^8-10, могут также участвовать в активации генов путем программирования состояний активного хроматина и подчеркивают, что WDR5 и др. белки с WD40 повторами являются кандидатами на роль адапторов, которые связывают комплексы ремоделирования хроматина с lincRNAs. Цис-органиченные lincRNAs могут быть идеально приспособлены для связи структуры хромосом и генной экспрессии. Поскольку такая lincRNA может действовать только на своих соседей по положению, то информация о образовании хромосомами петель высшего порядка может четко переводиться в модификации хроматина посредством рекрутирования с помощью РНК ферментативных активностей и тем самым в экспрессию генов.