Посещений: 
АУТОФАГИЯ
Механизмы и Сигнальные пути
|
|
Regulation Mechanisms and Signaling Pathways of AutophagyCongcong He and Daniel J. Klionsky  Annu Rev Genet. 2009; 43: 67–93.
doi: 10.1146/annurev-genet-102808-114910. |
Autophagy is a process of self-degradation of cellular components in which double-membrane autophagosomes sequester organelles or portions of cytosol and fuse with lysosomes or vacuoles for breakdown by resident hydrolases. Autophagy is upregulated in response to extra- or intracellular stress and signals such as starvation, growth factor deprivation, ER stress, and pathogen infection. Defective autophagy plays a significant role in human pathologies, including cancer, neurodegeneration, and infectious diseases. We present our current knowledge on the key genes composing the autophagy machinery in eukaryotes from yeast to mammalian cells and the signaling pathways that sense the status of different types of stress and induce autophagy for cell survival and homeostasis. We also review the recent advances on the molecular mechanisms that regulate the autophagy machinery at various levels, from transcriptional activation to post-translational protein modification.
Glossary
Lysosome A degradative organelle in higher eukaryotes that compartmentalizes a range of hydrolytic enzymes and maintains a highly acidic pH
Vacuole The yeast and plant equivalent of the lysosome; this organelle also carries out storage and osmoregulatory functions
Autophagosome A cytosolic double-membrane vesicle that sequesters intracellular components for degradation in lysosomes/vacuoles
Atg autophagy-related
Phagophore assembly site (PAS) A perivacuolar compartment or location where autophagosomes and similar types of sequestering vesicles are formed in yeast
Cytoplasm-to-vacuole targeting (Cvt) A biosynthetic pathway in yeast that transports resident hydrolases to the vacuole through a selective autophagy-like process
Pexophagy A selective type of autophagy involving the sequestration and degradation of peroxisomes; can occur by a micro- or macroautophagic process
TOR Target of rapamycin
Phagophore The initial sequestering compartment that expands into an autophagosome
LC3 microtubule-associated protein 1 light chain 3
Phosphatidylinositol 3-kinase (PtdIns3K) Enzyme phosphorylating the 3? hydroxyl on the phosphoinositide inositol ring. Class III PtdIns3K stimulates autophagy whereas class I is inhibitory
PE phosphatidylethanolamine
Amphisome An intermediate vesicle derived from the fusion of an autophagosome with an endosome or multivesicular body
PKA cAMP-dependent protein kinase A
UPR unfolded protein response
JNK c-Jun N-terminal kinase
eIF2α eukaryotic initiation factor 2?
DAPk calmodulin-regulated serine/threonine kinase death-associated protein kinase
ROS reactive oxygen species
TLR Toll-like receptor
|
D. J. Roberts, V. P. Tan-Sah, E. Y. Ding, J. M. Smith, S. Miyamoto, Hexokinase-II positively regulates glucose starvation-induced autophagy through TORC1 inhibition. Mol. Cell 53, 521–533 (2014).
M. Kundu, Too sweet for autophagy: Hexokinase inhibition of mTORC1 activates autophagy. Mol. Cell 53, 517–518 (2014). | |
Устранение глюкозы ингибирует активность киназного комплекса mTORC1 в клетках, редуцируя тем самым анаболический метаболизм и стимулируя аутофагию, чтобы повысить катаболический метаболизм. Энзим Hexokinase катализирует фосфорилирование глюкозы в glucose 6-phosphate (G6P) и является ключевым энзимом в гликолитическом метаболизме. В то время как hexokinase-I (HK-I) является повсеместной, hexokinase-II (HK-II) обильна в сердце, жировой ткани и скелетных мышцах и увеличена во многих опухолях. Roberts et al. наблюдали, что neonatal rat ventricular myocytes (NRVMs), подвергнутые действию HK ингибитора 2-deoxyglucose (2-DG) или нокдауну HK-II, но не HK-I, не обнаруживают увеличения аутофагии, если культивируются на лишенной глюкозы среде. Более того, нокдаун HK-II, но не HK-I, увеличивает пропорцию клеток, которые подвергаются апоптозу в ответ на устранение глюкозы. Избыточная экспрессия HK-II, но не HK-I, повышает базовую и вызываемую депривацией глюкозы аутофагию и способствует выживанию клеток в ответ на нехватку глюкозы. Анализ энзимов, которые обладают измененной активностью в ответ на депривацию глюкозы, показал, что mechanistic target of rapamycin (mTOR), а не Akt или ATФ-воспринимающий энзим AMPK были вовлечены в эффекты HK-II на аутофагию. NRVMs, в которых HK-II подверглась нокдауну или действию 2-DG, поддерживали фосфорилирование mTOR complex 1 (mTORC1) субстратов в ответ на депривацию глюкозы, подтверждая, что HK-II ингибирует активность mTORC1. Хотя избыточная экспрессия kinase-dead HK-II в клетках с эндогенной HK-II усиливает аутофагию в ответ на условия ограничения доступа глюкозы, внесение kinase-dead формы в клетки, в которых HK-II была подвергнута нокдауну, не усиливает аутофагию, подтверждая, что гликолитическая активность важна, но что существует также независимая от киназы функция. В самом деле, обработка NRVMs с помощью 5-thio-glucose, ингибитора HK, который не может фосфорилироваться с помощью HK, ингибирует активность mTORC1 и способствует аутофагии, подтверждая, что HK субстрат G6P (или фосфорилированный 2-DG) удерживает HK-II от ингибирования активности mTORC1. HK-II совместно иммунопреципитируется с компонентами mTORC1 в NRVMs. Это взаимодействие повышалось за счет депривации глюкозы и снизалось за счет нокдауна Raptor, компонента mTORC1, или за счет обработки клеток с помощью 2-DG. HK-II и mTORC1 также взаимодействуют ex vivo в лишенных глюкозы сердцах взрослых мышей и эти сердца также обнаруживают повышение маркеров притока аутофагии и снижения фосфорилирования mTORC1 субстратов. Мышиная, крысиная и человеческая HK-II содержат общий TOS мотив, который соединяется с Raptor. Избыточная экспрессия HK-II с мутацией в TOS мотиве, которая предупреждает взаимодействие с mTORC1, неспособна усиливать аутофагию и ингибирует апоптоз в glucose-deprived NRVMs. Kundu подчеркивает, что G6P функционирует как ключевая точка входа для трех метаболических путей-гликолитического пути, pentose phosphate пути и пути синтеза гликогена-а Roberts et al. исследование соединяет эти пути для регуляции аутофагии и mTORC1 посредством G6P-обеспечиваемой регуляции HK-II. Идентификация HK-II в качестве интегратора метаболического состояния в сердце может иметь значение для разного типа кардиомиопатий, ассоциированных с метаболическими болезнями.
Клеточный гомеостаз достигается путем баланса биосинтеза и распада. В клетках эукариот лизосомы (или аналогичные дрожжевые и растительные вакуоли) являются первичными органеллами для деградации посредством широкого круга присутствующих в них кислых гидролаз. Т.к. адаптивная реакция на неблагоприятные условия среды, такие как лишение пищи, аутофагия обеспечивает высоко регулируемый процесс само-поедания посредством лизосом. Пузырьки с двойными мембранами, наз. аутофагосомами, поглощают долго живущие белки, поврежденные органеллы и даже инвазивные патогены и транспортируют этот груз в лизосомы. Затем наружная мембрана аутофагосом сливается с лизосомной мембраной и внутренность пузырька вместе с его грузом деградирует (Figure 1). В результате макромолекулы могут быть возвращены обратно в цитозоль для повторного использования во время голодания (165). Нарушение аутофагии вносит вклад в различные заболевания, включая рак, нейродегенерацию, сердечно-сосудистые заболевания и микробные инфекции, поскольку эффективная секвестрация и очистка ненужных или поврежденных клеточных или чужеродных компонентов является критической для жизнеспособности и функции клетки.
 Figure 1
Schematic model of autophagy. The class III PtdIns3K complex mediates nucleation of the phagophore membrane, enwrapping cytosolic proteins, protein aggregates, and organelles (such as mitochondria). Bcl-2 blocks this step by binding and inhibiting Beclin (more ...)
Аутофагосомы наблюдали в ЭМ в клетках млекопитающих с 1950s (68), тогда как молекулярная эра исследований аутофагии началась не более 10 лет назад, начиная с генетического скрининга у почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae и methylotrophic дрожжей Pichia pastoris и Hansenula polymorpha, это привело к идентификации 31 autophagy-related (ATG) генов. Atg белки действуют на нескольких физиологически связанных ступенях аутофагии (напр., индукции, распознавании и упаковки груза и образования и разрыва пузырьков) и руководят большинством из этих процессов. Многие ATG гомологи были идентифицированы и охарактеризованы у высших эукариот, показав, что аутофагия эволюционно сильно законсервированный путь. В клетках грибов место образования аутофагосом наз. phagophore assembly site (PAS, также известна как preautophagosomal структура). Это место, где фагофоры, инициальные секвестрирующие структуры, расширяются и рекрутируют Atg белки. Тогда как в клетках млекопитающих аутофагосомы возникают во многих местах, грибы, по-видимому, имеют один PAS сайт по соседству в вакуолью, это делает возможным изучение механизмов и динамики биогенеза аутофагосом.
Хотя основная масса цитозоля может случайно замещаться с помощью аутофагии, в большинстве случаев аутофагия обнаруживает специфичность к субстрату. Напр., две дрожжевые вакуольные протеазы, ?-mannosidase и форма предшественника aminopeptidase I [Ape1 (prApe1)], синтезируются в цитоплазме и транспортируются к вакуоли посредством селективного пути аутофагии, известного как путь cytoplasm-to-vacuole targeting (Cvt) . Путь Cvt механически и генетически сходен с основной массой аутофагии за исключением того, что он происходит постоянно в нормальных условиях роста и в противовес аутофагии является биосинтетическим (70). Кроме того, подвергшиеся убиквитинированию белковые агрегаты и поврежденные или излишние органеллы избирательно доставляются на деградацию с помощью аутофагии. Используются различные термины для описания избирательности каждого процесса согласно грузу, так аутофагическая деградация митохондрий (mitophagy) (63), рибосом (ribophagy) (73), пероксисом (pexophagy) (25) и эндоплазматического ретикулума (ER; reticulophagy) (5, 69).
Molecular Machinery of Autophagy
Autophagy-Related (Atg) Proteins: The Core Machinery
Процесс аутофагии подразделяется на разные ступени, включая индукцию, распознавание и отбор груза, формирование пузырьков, слияние аутофагосомы с вакуолью и высвобождение груза, сопровождаемое высвобождением продуктов деградации обратно в цитозоль. Разные наборы белков Atg участвуют в этих ступенях и составляют стержень аппарата аутофагии.
Induction
Базовый уровень аутофагии очень низок при нормальных условиях; следовательно, поэтому эффективный механизм индукции аутофагии является критическим для организма, чтобы адаптироваться к стрессовым и внеклеточным сигналам. Центральным ингибитором аутофагии является serine/threonine protein kinase TOR (target of rapamycin). У дрожжей и Drosophila, Tor/dTOR интегрирует входящую информацию от множественных вышестоящих путей сигнальной трансдукции (discussed below) и негативно регулирует др. serine/threonine kinase, Atg1, в условиях нормального питания (15, 59, 133) (Figure 2b). У дрожжей после ингибирования Tor с помощью голодания или воздействия
rapamycin, киназная активность Atg1 активируется и сродство связывания Atg1 с Atg13 и Atg17 может также увеличиваться (59), это способствует образованию Atg1-Atg13-Atg17 каркаса и рекрутированию множественных Atg белков в PAS, чтобы инициировать образование аутофагосом (20, 21, 57, 60, 144). Т.о., роль Atg1 киназного комплекса в рекрутировании белков обязательна для индукции аутофагии. Более того, у Drosophila, Atg1 способен ингибировать фосфорилирование и активацию нижестоящего TOR эффектора, S6K, во время пищевого голодания (77), пока неясно, как передача сигналов S6K модулирует др. белки аутофагии и/или акивность аутофагии.
 Figure 2
Autophagy is induced by deprivation of nutrients, hormones, and energy. (a) Regulatory pathways of autophagy by amino acids, hormones, and energy in mammals. (b) Signaling of autophagy in yeast.
Существуют два гомолога у млекопитающих для Atg1, которые, по-видимому, участвуют в аутофагии, Unc-51-like kinase 1 (ULK1) и -2 (ULK2), и один гомолог дрожжевого Atg17, FIP200 (the focal adhesion kinase family-interacting protein of 200 kD), которые образуют комплекс с ULKs и Atg13 млекопитающих и располагаются на фагофорах (phagophore) при голодании (38, 56). Относительно субстратов для Atg1 kinase во время аутофагии, было предположено, что Atg13 и FIP200 млекопитающих фосфорилируются с помощью ULKs (56), и ULKs , кроме того, подвергаются аутофосфорилированию, которое ведет к конформационным изменениям и индукции аутофагии (13). Отличным о того, чтобыло описано у дрожжей, ULKs-Atg13-FIP200, по-видимому, формируют стабильный комплекс незавимо от условий питания в клетках млекопитающих. mTOR взаимодействует с, фосфорилирует и инактивирует ULKs и Atg13 в условиях достатка пищи. После ингибирования mTOR с помощью голодания или rapamycin, ULK1 и ULK2 активируются и фосфорилируют Atg13 и FIP200, что существенно для активности аутофагии (41, 56). Эти исследования выдвинули интересную гипотезу, что Atg13 фосфорилируется с помощью TOR или Atg1/ULKs по разным остаткам, это может приводить к противоположным эффектам на индукцию аутофагии в зависимости от статуса питания. В самом деле дрожжевой Atg13 быстро дефосфорилируется во время голодания (59), тогда как фосфорилирование Atg13 усиливается во время условий, способствующих аутофагии у Drosophila (15); очевидно, что фосфорилирование Atg13 зависит больше от Tor у дрожжей, и в ещё большей степени от Atg1 у Drosophila. Atg101, вновь идентифицированный белковый компонент комплекса ULKs-Atg13-FIP200, соединяется и стабилизирует Atg13, и необходим для аутофагии у млекопитающих (91).
Cargo recognition and selectivity
При селективной аутофагии грузы распознаются посредством взаимодействий со специфическими рецепторными белками. Дрожжевой Cvt путь доставляет prApe1 в вакуоли и генерирует зрелый энзим Ape1. Груз prApe1 содержит нацеленный на вакуоль сигнал, которые может быть распознан и связан рецепторным белком Atg19. Адапторный белок, Atg11, связывает Atg19 и рекрутирует Atg19-prApe1 комплекс в PAS, где Atg19 взаимодействует с одним из ключевых компонентов аппарата образования пузырьков, Atg8, для упаковки комплекса рецептор-груз в Cvt пузырьки (аналоги аутофагосом) (134, 137).
У многоклеточных организмов важной функцией аутофагии является очистка от убиквитинированных субстратов или склонных к агрегации белков. Недавние исследования показали, что этот дегенеративный процесс также избирателен и обеспечивается посредством белка млекопитающих p62/sequestosome 1 (SQSTM1) (6, 114), илиRef(2)P, Drosophila гомолога p62 (99). p62 непосредственно связывается с poly- или mono-ubiquitin посредством своего ubiquitin-associated (UBA) домена и с tg8 гомологом млекопитающих, LC3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3) (64, 110), и связывает убиквитинированный груз с аппаратом аутофагии для аутофагической деградации. Структурное и функциональное сходство между C-терминальным мотивом в p62 млекопитающих и в дрожжевом Atg19 (103) позволяет выдвинут интересную гипотезу, что p62 является аналогом Atg19 у высших эукариот и действует как рецептор для убиквитинированных белков или органелл в избирательной аутофагии. Недавняя работа показала, что P гранулярные белки, детерминанты зародышевой плазмы у Caenorhabditis elegans также избирательно деградируют с помощью аутофагии в соматических клетках (173). Рецептор груза, SEPA-1 (suppressor of ectopic P granule in autophagy mutants 1), непосредственно взаимодействует с компонентами P гранул и LGG-1, гомологом Atg8 у C. elegans, и т.о., функционирует подобно Atg19 и p62.
Др. избирательный маршрут аутофогии - это pexophagy и этот механизм был хорошо изучен у methylotrophic дрожжей Pichia pastoris. Образование пероксисом в основном индуцируется за счет роста метанола как единственного источника углерода; если среда пополняется глюкозой или этанолом, то пероксисомы более не нужны и избирательно деградируют в вакуолях посредством pexophagy. У P. pastoris, PpAtg30 действует как рецептор пероксисом путем взаимодействия с белками пероксисомной мембраны PpPex14 и PpPex3 и белками аутофагии PpAtg11 и PpAtg17, и , следовательно, связывает пероксисомы, предназначенные для деградации, с PAS (28). Примечательным свойством упомянутых выше рецепторных белков является высокий уровень специфичности пути. Напр., Atg19 не нужен для большей части аутофагии или pexophagy, а PpAtg30 не участвует в путях Cvt или основной аутофагии.
Autophagosome formation
В отличие от процесса образования пузырьков в большинстве систем доставки эндомембран, двойные мембраны аутофагосом, по-видимому, собираются на PAS путем добавления новых мембран скорее, чем генерацией за счёт отпочкования от поверхности предсуществующих органелл или уплотнения одиночного кусочка непрерывной мембраны. Т.о., образование секвестрирующих пузырьков, скорее всего наиболее сложная ступень аутофагии. Множественные Atg белки рекрутируются на фагофоры, чтобы участвовать в образовании аутофагосом, и эта ступень нуждается в высоко скоординированной координации всех этих белков (Figure 1).
Закладка и сборка инициальной мембраны фагофор нуждается в классе III phosphatidylinositol 3-kinase (PtdIns3K) комплексе, который состоит из PtdIns3K, Vps34 (vacuolar protein sorting 34), myristoylated serine/threonine kinase Vps15 (p150 в клетках млекопитающих), Atg14 (Barkor или mAtg14 в клетках млекопитающих) и Atg6/Vps30 (Beclin 1 в клетках млекопитающих) (48, 61, 81, 142). Функция Beclin 1 в аутофагии регулируется с помощью Bcl-2 (B-cell lymphoma/leukemia-2), антиапоптическим белком, который ингибирует аутофагию путем связывания и секвестрирования Beclin 1 в условиях достатка пищи; отделение Beclin 1 от Bcl-2 необходимо для индукции аутофагии. Комплекс PtdIns3K продуцирует PtdIns3P (phosphatidylinositol 3-phosphate) и участвует в доставке к PAS ряда дрожжевых Atg белков, которые связывают PtdIns3P, таких как Atg18, Atg20, Atg21 и Atg24 (100, 105, 141). У дрожжей Atg20 и Atg24 взаимодействуют с Atg1-Atg13-Atg17 комплексом и позднее обеспечивают индукцию аутофагии (discussed above); однако гомологи Atg20 and Atg24 млекопитающих или неидентифицированы (Atg20) или недостаточно охарактеризованы в отношении млекопитающих (Atg24). Комплекс PtdIns3K частично вместе с упомянутыми выше Atg белками далее рекрутируют две взаимосвязанные ubiquitin-like (Ubl) системы конъюгации, Atg12-Atg5-Atg16 и Atg8-PE (phosphatidylethanolamine), на фагофоры (143, 144), это играет важную роль в регуляции элонгации мембран и расширения формируемых аутофагосом.
Два Ubl белка, Atg12 и Atg8, подвергаются сопряжению способом, сходным с ubiquitin. Atg12 активируется с помощью Atg7 (E1 активирующий энзим), переносится на Atg10 (E2 conjugating энзим) и закрепляется ковалентно на внутреннем лизине субстратного белка Atg5. В противоположность убиквитинированию, Atg12-Atg5 сопряжение является постоянным и необратимым и, по-видимому, нет нужды в субстрат-специфичной копии E3 лигазы для этого процесса (34). Atg12-Atg5 conjugate далее взаимодействует с двуспиральным (coiled-coil) белком Atg16, который связывает комплексы Atg12-Atg5-Atg16 в тетрамер с помощью само-олигомеризации и прикрепляет его к фагофоре (92, 93). В Atg8 conjugation системе, Atg8 первым преобразуется с помощью цистеин протеазы, Atg4, экспозируя после этого C-терминальный остаток glycine. Тот же самый E1 энзим Atg7 активирует Atg8 и переносит его на Atg3 (E2). Atg8 в конечном итоге конъюгирует с мишенью липидом PE посредством amide мостика, что облегчается E3-подобным Atg12-Atg5 конъюгатом (32, 37), хотя Atg12-Atg5 лишен законсервированных доменов HECT или RING, характерных для типичных E3 лигаз, и он не важен для осуществления конъюгации. В условиях достатка пищи большинство Atg8 является цитозольным; после индукции аутофагии, Atg8 в основном существует как сконъюгированная с липидом форма и локализуется на обеих сторонах фагофор (58, 65). Atg8 контролирует размер аутофагосом (158), это может быть результатом его способности детерминировать изгиб мембран. Липидизация Atg8 и его гомолога у млекопитающих LC3 широко используются для мониторинга индукции аутофагии.
Различные источники, включая митохондрии, комплекс Golgi и ER, как полагают являются источниками аутофагосомных мембран (54, 119). Однако не совсем ясно, с помощью какого механизма дополнительные мембраны доставляются и сливаются с растущим фагофором. SNAREs (N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors) или малые GTPases, по-видимому, не обнаруживают непосредственного участия в образовании аутофагосом. Хотя Golgi-резистентная GTPase Rab33B связывает Atg16L (гомолог Atg16 у млекопитающих), функция этого взаимодействия в аутофагии неясна (49). Недавние исследования продемонстрировали, что само-мультимеризация Atg9 может облегчать закрепление на и/или слияние с мембраной (39). Atg9 единственный идентифицированный интегральный мембранный белок, необходимый для образования аутофагосом. У дрожжей Atg9 локализуется в PAS и периферических структурах и это указывает на цикличность между двумя сайтами. Atg11, Atg23 и Atg27 важны для антероградного транспорта Atg9 в PAS (14, 40, 78, 163), а Atg1-Atg13 комплекс, Atg2, Atg18 и PtdIns3K комплекс участвуют в его ретроградном транспорте (120). Т.о., Atg9 может действовать как переносчик для доставки мембран и может также играть роль во время экспансии фагофор благодаря его динамическим само-взаимодействиям. Сходным образом, Atg9 млекопитающих (mAtg9) транспортируется из trans-Golgi network (TGN) в поздние эндосомы, которые метятся одновременно с LC3, если индуцируется аутофагия. В клетках млекопитающих обнаруживается перераспределение mAtg9 из TGN в поздние эндосомы, которое зависит от ULK1 и Atg13 человека (13, 168).
Vesicle fusion and autophagosome breakdown
Когда формирование аутофагосом завершается, то Atg8 прикреплённый к наружной мембране отделяется от PE с помощью Atg4 и высвобождается обратно в цитозоль (66). Однако механизмы возвращения и отсоединения от оболочки др. Atg белков ещё предстоит исследовать. Слияние аутофагосома-лизосома обеспечивается с помощью того же самого аппарата, который участвует в слиянии гомотипических мембран вакуолоей. В клетках млекопитающих событие слияния нуждается лизосомном мембранном белке LAMP-2 и малой GTPase Rab7 (51, 147), хотя механизм его менее охарактеризован. У дрожжей аппарат состоит из Rab семейства GTPase Ypt7 (гомолог Rab7), NSF гомолог Sec18, SNARE белки Vam3, Vam7, Vti1 и Ykt6, белки класса C Vps/HOPS комплекса и два др. белка, Ccz1 и Mon1 (67).
После слияния, деградация внутренности пузырька зависит от серии lysosomal/vacuolar кислых гидролаз, включая proteinases A и B (кодируемые PEP4 и PRB1, соотв.) и липазу Atg15 у дрожжей (26, 149) и cathepsin B, D (гомолог proteinase A) и L в клетках млекопитающих (148). Возникающие в результате деградации малые молекулы, особенно аминокислоты, транспортируются обратно в цитозоль для белкового синтеза и поддержания клеточных функций в условиях голодания. Идентификация Atg22, вместе с др. вакуольными permeases (такими как Avt3 и Avt4) в качестве вакуольных устранителей (effluxers) аминокислот во время аутофагии у дрожжей (160), помогло в понимании механизмов рециклинга питательных веществ; эти пермеазы представляют собой последнюю ступень процесса деградации и рециклинга.
Non-Atg Components Required for Autophagy
Помимо упомянутых выше Atg белков, определенные субклеточные системы, включая секреторный путь, путь эндоцитоза и цитоскелетную сеть, могут также выполнять важные функции во время аутофагии, такие как обеспечение мембранами, облегчение транспорта аутофагосом и предоставление возможности очистки аутофагических субстратов.
The secretory and endocytic pathways
Аутофагия использует драматическое ремоделирование субклеточных мембран. Роль секреторного пути в аутофагии в основном проясняется в исследованиях на дрожжах, где функциональные ER и Golgi комплексы необходимы для аутофагии и Cvt пути (47, 121). Субнабор GTP exchange факторов, включая Sec12 и Sec16, и две coatomer субъединицы COPII оболочки, Sec23 и Sec24, необходим для биогенеза аутофагосом, но не Cvt пузырьков (47); хотя возможно, что дефект пути Cvt едва различим по сравнению с неизбирательной аутофагией из-за относительно сниженной потребности для мембран. Тем не менее существуют некоторые аспекты образования пузырьков, которые уникальны или для аутофагии или Cvt пути. Напр., SNARE-Sec комплекс, содержащий tSNARE Tlg2, vSNARE Tlg1 и Sec1 гомолог Vps45, Vps-fifty-three (VFT) комплекс и сортирующие nexins Atg20 и Atg24 необходимы исключительно для образования Cvt пузырьков (1, 100, 122). Кроме того, Trs85, компонент TRAPP (transport protein particle) комплексов, которые обеспечивают ER-to-Golgi и intra-Golgi перенос, важен как для неселективной аутофагии, так и процессов избирательной аутофагии, таких как Cvt путь и pexophagy (90, 98). Хотя лежащий в основе механизм охарактеризован недостаточно, возможно, что ранние секреторные мутанты затрагивают мембранный ток или правильную сортировку некоторых Atg белков, таких как транспорт Atg9 в PAS.
Хотя завершенные аутофагосомы могут непосредственно сливаться с лизосомами, если клетки перегружены белками, склонными к агрегации, слияние аутофагосом с эндоцитическими компартментами важно для облегчения эффективного удаления этих белков с помощью аутофагии. В клетках Drosophila и млекопитающих аппарат ESCRT (endosomal sorting complexes required for transport) и локализованный в multivesicular body (MVB) Rab11 играют важную роль в слиянии MVBs с завершенными аутофагосомами, а эндосомная PtdIns3P 5-киназа Fab1 дрозофилы участвует в слиянии возникших amphisomes с лизосомами (27, 30, 125). Обе ступени необходимы для обеспечения деградации склонных к аггрегации субстратных белков, секвестрируемых аутофагосомами.
Cytoskeleton
Эффективная доставка белков во время образования аутофагосом преимущественно обеспечивается цитоскелетными путями. Напр., функциональный актиновый цитоскелет и Arp (actin-related protein) 2/3 комплекс, который закладывает (nucleates) веточки актиновых филамент, необходимы для антероградного транспорта Atg9 в PAS и селективной аутофагии у дрожжей (94, 118). Микротрубочки участвуют в аутофагии у высших эукариот. В первичных гепатоцитах крыс деполимеризующее микротрубочки соединение nocodazole ингибирует образование аутофагосом (71). Кроме того, микротубулярная tubulin deacetylase HDAC6 и микротубулярный моторный белок dynein необходимы для аутофагической очистки от различных белков, склонных к аггрегации, в клетках мух и млекопитающих (50, 109, 117). В клетках млекопитающих очевидно, что аутофагосомы формируются в случайных местах в клетке, но транспортируются направлено к ядру после завершения (52). Несколько линий доказательств указывают на то, что аутофагосомы ассоциируют с треками микротрубочек, перемещаясь к центру организации микрорубочек и сливаются с эндосомами или лизосомами, и этот динамический процесс приводится в движение динеиновым мотором (29, 52, 71).
Signaling Pathways Regulating Autophagy
Nutrient Signaling
Во время лишения пищи драматически индуцируется формирование аутофагосом. ак в дрожжевых, так и в клетках млекопитающих два хорошо охарактеризованных сигнальных каскада, которые ощущают состояние питания, активируют клеточные деления и рост и негативно регулируют аутофагию, это TOR и Ras-cAMP-PKA пути.
TOR complex 1
TOR complex 1 (TORC1) чувствителен к ингибированию с помощью rapamycin. Инактивация TORC1 с помощью rapamycin стимулирует аутофагию при наличии питательных веществ, указывая тем самым, что TOR подавляет аутофагию (104). Внеклеточные аминокислоты вступают в клетки млекопитающих через транспортеры, такие как SLC1A5 (solute carrier family 1 member 5) и SLC7A5 (101), и предполагается, что mTORC1 непосредственно ощущает и фосфорилируется в ответ на пищевые сигналы (84); однако недавние наблюдения на Drosophila и млекопитающих показали, что Rag белки, Ras-related малые GTPases, активируют TORC1 в ответ на аминокислоты (62) путем обеспечения транслокации TORC1 в специфический субклеточный компартмент, который содержит TORC1 активатор Rheb (Ras homolog enriched in brain) (127). Др. исследования показали, что аминокислоты также активируют mTOR посредством класса III PtdIns3K (hVps34) (10, 102) (Figure 2a). Присутствие аминокислот стимулирует hVps34, это ведет к активации mTOR и ингибированию аутофагии. Однако это создает расхождение с ролью класса III Pt-dIns3K в поддержке nucleation и сборки Atg белков на ранних ступенях формирования аутофагосом (53). Возможное объяснение заключается в том, что PtdIns3K существует в разных субпопуляциях или белковых комплексах в клетке, которые выполняют разные функции или функционируют в разное время.
Помимо регуляции Atg1/ULK комплекса у дрожжей TORC1 также супрессирует аутофагию путем фосфорилирования Tap42, который активирует каталитические субъединицы PP2A (the serine/threonine protein phosphatase 2A), негативного регулятора аутофагии (164) (Figure 2b). Хотя нижестоящие мишени для PP2A не идентифицированы, возможно, что Atg белки могут непосредственно вовлекаться так, как Atg1 киназный комплекс (как описано выше) и др. фосфорилированные Atg белки.
The Ras/PKA pathway
enm передачи сигналов Ras/cAMP-dependent protein kinase A (PKA) играет важную роль в восприятии глюкозы от дрожжей до млекопитающих. Дрожжевая PKA содержит гетеротетрамер, состоящий из регуляторной субъединицы Bcy1 и трех, по-видимому, перекрывающихся каталитических субъединиц Tpk1, Tpk2 и Tpk3. В условиях достатка пищи малые GTPases Ras1 и Ras2 активны и усиливают регенерацию цАМФ с помощью adenylyl cyclase. Повышенные уровни цАМФ связывают Bcy1 и высвобождают её ингибирующее влияние на PKA. Постоянная активность Ras/PKA пути супрессирует аутофагию, индуцированную с помощью ингибирования TOR у дрожжей (9, 131), указывая тем самым, что путь Ras-PKA подавляет аутофагию параллельно с путем TOR-Tap42. Ингибирование аутофагии с помощью Ras/PKA может обеспечиваться посредством регуляции Atg1, который идентифицирован как субстра для фосфорилирования с помощью PKA (8) (Figure 2b). В присутствии пищи, PKA фосфорилирование принуждает Atg1 быть в основном цитозольным и диссоциировать от PAS, тогда как во время голодания Atg1 дефосфорилируется и локализуется в PAS. Необходимо отметить, что Atg1 может быть не единственной мишенью для PKA поскольку гиперактивный Ras мутант, Ras2G19V, у которого постоянно активирована передача сигналов PKA, всё ещё способен ингибировать аутофагию в клетках, экспрессирующих вариант Atg1 лишенный сайта фосфорилирования с помощью PKA.
Помимо PKA, протеин киназа Sch9, ближайший дрожжевой гомолог protein kinase B (PKB)/Akt млекопитающих, также как и TOR мишень S6 kinase (S6K), участвует в оценке состояния питания (170). Одновременная инактивация PKA и Sch9 индуцирует аутофагию, которая в дальнейшем может быть усилена за счет инактивации TORC1 (167), подтверждая тем самым, что аутофагия негативно регулируется с помощью, по крайней мере, трех параллельных путей у дрожжей, TORC1, Ras/PKA и Sch9 (Figure 2b). Ras/PKA и Sch9 могут регулировать аутофагию на транскрипционном уровне, т.к. транскрипционные факторы Msn2/4 и Rim15 kinase необходимы для аутофагического тока, индуцированного инактивацией как PKA, так и Sch9, но не для аутофагии, индуцированной инактивацией TOR (167).
Insulin/Growth Factor Pathways
Когда факторы роста изымаются из внеклеточной среды, то несмотря на достаточность пищи индуцируется аутофагия и это необходимо для поддержания клеточных функций и продукции энергии (85). У высших эукариот, таких как клетки Drosophila и млекопитающих, пути, посредством которых гормоны регулируют аутофагию, отличаются от тех, что при достатке пищи, но оба сходятся на TOR (Figure 2a). Insulin и insulin-like факторы роста регулируют mTOR посредством класса I PtdIns3K. После связывания инсулина, аутофосфорилирование инсулиновых рецепторов по остаткам тирозина приводит к рекрутированию и фосфорилированию IRS1 и IRS2 (insulin receptor substrate 1 and 2), которые создают каркасы для стыковки, которые делают возможным связывание адапторных белков, включая субъединицы класса I PtdIns3K такие как p85. Генерация PIP3 (phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate; Figure 2a, red circles in the membrane)
с помощью класса I PtdIns3K повышает рекрутирование мембраной как protein kinase B (PKB)/Akt, так и её активатора PDK1 (phosphoinositide-dependent protein kinase 1), приводя к фосфорилированию и активированию PKB/Akt с помощью PDK1 (2, 140). 3'-phosphoinositide phosphatase PTEN меняет направление продукции PIP3, снижая передачу сигналов нижестоящей PKB/Akt и тем самым позитивно регулирует аутофагию (3). Активированная PKB/Akt способствует фосфорилированию белка, кодируемого с помощью TSC2 tumor suppressor гена. который мутантен при tuberous sclerosis complex (TSC) опухолевом синдроме. Фосфорилирование блокирует TSC2 взаимодействие с TSC1 и предупреждает образование TSC1/2 комплекса (88), это заставляет Rheb существовать в активной GTP-связанной форме (45, 172) и позволяет ей непосредственно соединяться с и активировать mTORC1 (83). Когда гормоны отсутствуют, то mTOR инактивируется, тем самым осуществляется ингибирующее влияние на аутофагию.
Помимо TOR, передача сигналов Ras также играет роль в регуляции аутофагии с помощью ростовых факторов (Figure 2a). Ras трансдуцирует сигналы от фактора роста receptor tyrosine kinases на внутриклеточные эффекторы, такие как Raf-1/MAP (mitogen-activated protein) киназы и класса I PtdIns3K. В NIH3T3 mouse embryonic fibroblasts (MEFs), активированный Ras супрессирует аутофагию посредством класса I PtdIns3K, но не посредством Raf-1 (33). В противоположность PtdIns3K, Ras эффектор Raf-1 является аминокислотным сенсором и позитивно регулирует аутофагию в HT-29 клетках рака толстого кишечника человека (113). В этой ситуации, аминокислоты находят и ингибируют активность Raf-1 киназы, которая подавляет нижестоящие MEK1/2 [MAPK(mitogen-activated protein kinase)/ERK kinase 1/2] и ERK1/2 (extracellular signal-regulated kinase 1/2) киназы и аутофагичную активность. Устранение аминокислот меняет направление этого ингибирования и индуцирует ERK1/2 и аутофагию. Как следствие два нижестоящих каскада эффекторов Ras, пути Ras-PtdIns3K и Ras-Raf-1-ERK1/2, скорее всего, противодействуют др. др. в регуляции аутофагии посредством передачи сигналов в ответ на ростовые факторы в противовес отсутствию аминокислот. Возможно также, что генетические отличия между линиями нормальных и раковых клеток предопределяют как передача сигналов Ras контролирует аутофагию .
Energy Sensing
Во время периодов внутриклеточных метаболических стрессов активация аутофагии важна для выжывания клеток, а лежащие в основе пути известны в деталях. В клетках млекопитающих снижение уровня клеточной энергии (АТФ) ощущается с помощью AMPK (5'-AMP-activated protein kinase) (Figure 2a). AMPK активируется снижением соотношения ATФ/AMФ посредством вышестоящей LKB1 киназы (кодируемой геном Peutz-Jeghers syndrome). Активная AMPK ведет к фосфорилированию и активации TSC1/2 комплекса, который ингибирует активность mTOR посредством Rheb (46). Аутофагия, стимулируемая с помощью подавления mTOR, вызывает усиление продукции АТФ посредством рециклинга питательных веществ. Кроме того, LKB1-AMPK путь фосфорилирует и активирует p27kip1, циклин-зависимый киназный ингибитор, ведущий к аресту клеточного цикла, это важно для предотвращения у клеток апоптической гибели и индукции аутофагии, для выживания в ответ на биоэнергетический стресс во время устранения фактора роста и истощения пищи (80). Сходным образом, Snf1, дрожжевой гомолог AMPK млекопитающих, также позитивно модулирует аутофагию, возможно посредством независимых механизмов с участием регуляции Atg1 (154).
Stress Response
Различные вне- и внутриклеточные стрессы способны индуцировать аутофагию, это важно для организмов, чтобы адаптироваться к и преодолевать неблагоприятные условия. Недавние исследования пролили свет на молекулярные механизмы, которые регулируют аутофагию в ответ на разные стрессы.
ER stress
ER является ключевым компартментом в клетках для обеспечения укладки вновь синтезированных белков и инициации пути перемещения пузырьков из мембран и белков к различным органеллам и к клеточной поверхности. В клетках млекопитающих ER также служит в качестве основного внутриклеточного резервуара Ca2+. Ряд ER стрессовых стимулов, напр., экспрессия белков, склонных к аггрегации, исчезновение глюкозы (вследствие снижения гликозилирования и снижения энергии для активности шаперонов), гипоксия и оксидативные стрессы (вызывающие снижение образования дисульфидных мостиков) и утечка Ca2+ из ER, ведут к накоплению неупакованных белкво в ER, это превышает его способность к упаковке. Растет количество исследований, показывающих, что аутофагия индуцируется ER стрессами от дрожжей до млекопитающих. Однако механизмы передачи сигналов, связанные с ER стрессом на аутофагию варьируют в зависимости от специфических условий стресса и изученных организмов (Figure 2a).
У дрожжей, ER химические стрессоры блокируют образование дисульфидных мостиков или гликозилирование белков, таких как DTT и tunicamycin, эффективно запуская аутофагию, которая нуждается в Atg1 киназной активности (166). ER стрессами индуцированная аутофагия необходима для жизнеспособности клеток в присутствии tunicamycin, скорее всего, благодаря компенсаторному устранению расширенных и дезорганизованных ER (которые возникают в результате unfolded protein response; UPR), вместе с неправильно уложенными белками внутри них (5). UPR сигнальный путь у дрожжей обеспечивается с помощью Ire1 (inositol-requiring kinase 1), ER трансмембранного белка с просветным воспринимающим стрессы доменом и цитозольным endoribonuclease доменом. В ответ на накопление неупакованных белков ER-специфический член семейства хитшоковых белков 70 , Grp78/BiP, отсоединяется от ER-sensing домена и активирует цитозольный endonuclease домен Ire1, это запускает сплайсинг Ire1 субстрата Hac1. Последний кодирует транскрипционный фактор (дрожжевой гомолог XBP1 млекопитающих), который активирует транскрипцию генов мишеней, участвующих в модификации/укладке белков, везикулярном транспорте, биосинтезе phospholipid и в ERAD (ER-associated degradation) (86). Хотя путь Ire1-Hac1 необходим для индукции аутофагии с помощью ER стрессов, по-видимому, он необязателен для транскрипционной активации ATG генов (5). Как Ire1 и Hac1 осуществляют свою функцию по стимулированию аутофагии у дрожжей, неясно.
В клетках млекопитающих нокдаун вышестоящего UPR регулятора Grp78/BiP с помощью siRNA ингибирует образование аутофагосом, индуцируемое с помощью ER стресса и нехваткой пищи, но не влияет на превращение LC3-I в LC3-II, указывая тем самым, что Grp78/BiP является облигаторным фактором для аутофагии и может участвовать в экспансии фагофор скорее, чем на ступени индукции (79). Необходимо отметить, что это заключение в основном базируется на нокдауне Grp78/BiP, искусственных условиях, которые спонтанно активируют UPR пути и индуцируют превращение LC3, что делает затруднительным дифференцировать роли передачи сигналов Grp78/BiP и UPR в индукции аутофагии.
Дополнительные исследования были сфокусированы на нижестоящих UPR мишенях, они предоставили важную информацию о механизмах ER стрессами индуцированной аутофагии у млекопитающих. Передача сигналов UPR у млекопитающих более сложная, чем у дрожжей и задействует три разных нижестоящих пути, IRE1 (сходный с дрожжевым Ire1), ATF6 (activating transcription factor 6) и PERK (RNA-dependent protein kinase-like ER kinase). Эти факторы сигнализируют об уровнях неупакованных белков в ER и активируют транскрипцию различных генов мишеней. Одна нижестоящая мишень IRE1 это c-Jun N-terminal kinase (JNK), которая существенна для конъюгации липида из LC3, индуцируемой с помощью tunicamycin или накоплением цитозольных неправильно упакованных белков , вызываемом ингибированием протеосом в MEFs и раковых клетках (24, 106). Последние данные с использованием мышиных клеток показали, что реакция на ER стресс, индуцируемая с помощью неправильно упакованных белков polyQ72 или мутантного dysferlin, фосфорилирования eIF2α (eukaryotic initiation factor 2α) с помощью eIF2α киназы PERK необходима для обеспечения LC3 конверсии и аутофагической деградации мутантных белков в ER (31, 72). Т.о., как IRE1-JNK, так и PERK-eIF2α пути, по-видимому, играют жизненно важную роль в UPR-индуцированной аутофагии.
В дополнение к передаче сигналов UPR, ER стресс также вызывает высвобождение просветного Ca2+ в цитозоль. Calcium-activated calmodulin-dependent kinase kinase-β (CaMKKβ) стимулируется с помощью увеличения внутриклеточного уровня Ca2+ и далее активирует AMPK, последний мощно индуцирует аутофагию (42). Повышенные уровни Ca2+ также запускают фосфорилирование protein kinase Cδ (PKCδ), это индуцирует конверсию LC3 и аутофагию в иммортализованных гепатоцитах в ответ на ER стрессоры thapsigargin и tunicamycin (126).
Хотя приведенные выше исследования показали, что ER стрессом индуцированная аутофагия способствует выживанию клеток млекопитающих, др. указывают на то, что ER стрессоры могут вызывать аутофагическую клеточную гибель. Инъекции tunicamycin в почечные канальцы мышей индуцируют гибель клеток канальцев почек посредством апоптоза и аутофагии, которые обеспечиваются за счет каталитической активности опухолевого супрессора DAPk (calmodulin-regulated serine/threonine kinase death-associated protein kinase). DAPk активируется с помощью PP2A-like phosphatase-зависимого дефосфорилирования ингибирующего serine, который возникает в результате аутофосфорилирования (35), а активированная DAPk индуцирует аутофагию, скорее всего, благодаря её способности фосфорилировать Beclin 1 и способствовать диссоциации Beclin 1 от Bcl-2 (169). Возможно, что аутофагия играет двойную роль в детерминации судеб клеток в зависимости от специфического типа клеток и стимулов (23).
Hypoxia
Низкие уровни кислорода на уровне или ниже 1% (hypoxic stress) в противовес 2-9% (normoxia для большинства типов клеток млекопитающих), обнаруживаются у физиологически развивающихся эмбрионов, а также при большинстве патологических условий, таких как плотные опухоли, сердечно-сосудистая ишемия и повреждения головного мозга. Накапливаются данные, показывающие, что гипоксия вызывает аутофагию в клетках млекопитающих, эта область исследований находится лишь на начальной стадии, и сигнальные пути, ответственные за индукцию аутофагии и её клеточные последствия, по-видимому, отличаются, обнаруживая зависимость от типов клеток и путей аутофагии (Figure 3b).
Напр., усиленная митохондриальная аутофагия (mitophagy) во время гипоксии указывает на адаптивную реакцию, снижающую уровни reactive oxygen species (ROS) и защищающую целостность клеток, хотя при некоторых глиомах и в линиях клеток рака груди длительная гипоксия ведет к аутофагической гибели клеток (4).
 Figure 3
Autophagy regulation in response to stress. (a) ER stress stimulates autophagy through the PERK-eIF2α pathway, the IRE1-JNK1 pathway and Ca2+ release. Activation of eIF2? by PERK may upregulate transcription of certain autophagy genes, (more ...)
Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) является главним транскрипционным фактором, остро индуцируемым гипоксическими условиями и он управляет транскрипцией сотен генов, это способствует эритропоэзу и ангиогенезу и снижает биогенез и дыхание митохондрий, противодействуя вредным эффектам, вызываемым дефицитом O2. В MEFs, митохондрии, устраняются с помощью mitophagy в ответ на гипоксию, это зависит от HIF-1 и индукции его нижестоящей мишени BNIP3 (Bcl-2 adenovirus E1a nineteen kDa interacting protein 3; член семейства prodeath Bcl-2) (171). Кроме того, во время созревания ретикулоцитов у мышей, BNIP3L (BNIP3-like protein, также известен как NIX), др. HIF-1-индуцируемая мишень, также необходим для запрограммированной митохондриальной очистки с помощью аутофагии (128, 132). BNIP3 конкурирует с Beclin 1 за связывание Bcl-2 и тем самым освобождает Beclin 1 от участия в mitophagy. Необходимо отметить, что помимо контроля со стороны HIF-1, BNIP3 является также геном мишенью E2F транскрипционных факторов, которые ингибируются с помощью RB опухолевого супрессора во время RB-индуцированного ареста клеточного цикла (150). Следовательно, гипоксия индуцирует транскрипцию BNIP3 благодаря соединению HIF-1 и/или E2F с промотором BNIP3 , и передача сигналов RB-E2F-BNIP3 также участвует в индуцированной гипоксией аутофагии.
В самом деле, усиление массы аутофагии с помощью гипоксии в опухолевых клетках, по-видимому, не зависит от HIF-1 пути; вместо этого, AMPK-mTOR (111, 152) и PKCδ (protein kinase Cδ)-JNK1 (16) каскады отвечают за сигнальную индукции аутофагии. Кроме того, гипоксия ингибирует TOR и блокирует образование комплекса eIF4F (eukaryotic initiation factor 4F) и трансляцию мРНК (7, 123). Т.о., аутофагия, индуцированная гипоксией может , по крайней мере, частично быть TOR-зависимой, а гипоксией стимулированные ER стресс также могут играть роль в индукции аутофагии.
Oxidative stress
Общераспространенным внутриклеточным стрессом, который эффективно приводит к индукции аутофагии, это образование ROS. Митохондрии являются главным источником генерации ROS, которые, в свою очередь, повреждают эти органеллы. ROS-генерируемые агенты (такие как hydrogen peroxide и 2-methoxyestradiol), или химические соединения, ингибирующие митохондриальную цепочку транспорта электронов, индуцируют продукцию ROS и аутофагическую клеточную гибель в трансформированных и опухолевых клеточных линиях (17, 18). Интересно, что эти соединения индуцируют значительно более низкие уровни ROS в нетрансформированных ервичных мышиных астроцитах по сравнению с раковыми клетками и неспособны стимулировать аутофагию, указывая тем самым, что нормальные клетки эффективно поддерживают ROS на допустимом уровне и способны защищать сами себя от митохондриальных повреждений, скорее всего, благодаря антиоксидантным механизмам, таким как superoxide dismutase (SOD), catalase и redox системе, поскольку добавление химических уборщиков ROS или избыточная экспрессия SOD2 снижает аутофагию (17, 18). Кроме того, поврежденные митохондрии могут избирательно деградировать посредством mitophagy в дрожжевых клетках и клетках млекопитающих (96, 115, 124, 151), это может составлять др. механизм снижения уровней ROS и поддержания клеточной жизнеспособности. Следовательно, ROS избирательно поставляются злокачественными, но не нормальными клетками для индукции аутофагии, что важно для использования в противораковой терапии.
Связь между ROS и аутофагией может базироваться на cysteine protease Atg4 (Figure 3b), которая расщепляет Atg8/LC3 из наружной мембраны аутофагосом перед или вскоре после слияния аутофагосом с лизосомами. ROS нацелены на консервативный Cys81 в Atg4, который находится вблизи каталитического Cys77 остатка; окисление цистеинов ингибирует активность Atg4 protease и способствует lipidation Atg8/LC3, важной ступени к аутофагии (130). Неизвестно однако, как уровни ROS могут контролироваться во времени и пространстве внутри клетки, так чтобы Atg4 мог быть активироваться локально и сделать возможной delipidation и рециклинг Atg8/LC3, или в этом участвует др. механизм.
Кроме того, Atg4, по-видимому, не единственная молекула, которая лежит в основе оксидативной регуляции аутофагии. Недавнее исследование показало, что hydrogen peroxide активирует poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1), которая стимулирует LKB1-AMPK путь и ведет к индукции аутофагии (44). Возможно, что повреждения ДНК, индуцированные оксидативными стрессами участвуют в активации PARP-1 и аутофагии (95).
Pathogen Infection
Аутофагия выполняет важную роль в устранении проникших патогенов, а индуцированная патогенами аутофагия, по-видимому, не зависит от TOR (153). Хотя многие исследования сообщали об индукции аутофагии в клетках хозяина в ответ на разные бактерии и вирусы и последующую аутофагическую секвестрацию и деградацию патогенов, информация о сигнальных путях, активирующих аутофагию, при врожденном и приобретенном иммунитете выявлены лишь недавно (Figure 4).
 Figure 4
Different mechanisms that regulate autophagy by pathogen invasion. Toll-like receptor adaptor proteins, MyD88 and TRIF, dissociate Beclin 1 from its inhibitor Bcl-2 and induce autophagy, whereas the HSV-1 protein ICP34.5 blocks autophagy by binding and (more ...)
Врожденная иммунная система эволюционно родоначальная и консервирует механизм защиты и обнаруживается практически у всех типов многоклеточных организмов, включая насекомых, растения и млекопитающие. У Drosophila, которая зависит почти полностью от врожденного иммунитета, чтобы противоборствовать инфекции, члены семейства peptidoglycan-recognition protein (PGRP) играют критические роли в надзоре и узнавании микробов. PGRP рецепторы присутствуют в иммунных клетках, распознают продуцируемые бактериями peptidoglycans и активируют продукцию антимикробных пептидов. Член семейства PGRP, PGRP-LE, явился первым идентифицированным цитоплазматическим сенсором у насекомых, который распознает присутствие внутри клетки бактерий и запускает аутофагию в клетке хозяине, которая необходима для супрессии роста Listeria monocytogenes в гемоцитах и для повышения жизнеспособности хозяина (161). Путь, который трансдуцирует сигналы от PGRP-LE рецепторов к аппарату аутофагии, и оказывает ли он взаимное влияние (crosstalks) на классический сигнальный путь, стоящий ниже PGRP рецепторов, которые активируют гены, кодирующие антимикробные пептиды, ещё предстоит выяснить.
Передача сигналов Toll-like receptors (TLRs) запускает аутофагию во время врожденного и приобретенного иммунитета у млекопитающих. TLRs являются мембранными рецепторами, расположенными на клеточной поверхности и эндосомах и передача сигналов TLR активирует транскрипцию генов, ответственных ща стимуляцию Т клеток, воспаление и антивирусную иммунную реакцию. Разные TLRs участвуют в индукции аутофагии после их соединения со специфическими продуцируемыми патогенами лигандами. Напр., вирусная ssRNA (single-stranded RNA) индуцирует аутофагии с помощью TLR7 (22), zymosan стимулирует транслокацию LC3 в фагосомы путем активации TLR2 (129), а lipopolysaccharide (LPS), который происходит из стенки Гамм-отрицательных бактерий, запускает аутофагию посредством TLR4 (136, 159). TLRs рекрутируют адапторные белки, чтобы трансдуцировать сигналы нижестоящим эффекторам. MyD88 (myeloid differentiation factor 88) является основным адапторным белком, используемым почти всеми активированными TLRs и обусловливает индукцию аутофагии ниже TLR7 (22). В человеческих и мышиных макрофагах TLR4 адапторный белок TRIF (Toll-interleukin-1 receptor domain-containing adaptor-inducing interferon-γ , как полагают, обеспечивает LPS-индуцированную аутофагию и тот же самый нижестоящий сигнальный путь является общим для врожденного иммунитета и активации аутофагии (159). Кроме того, предположен уникальный механизм индукции аутофагии макрофагами; в мышиных макрофагах MyD88 вместе с TRIF взаимодействуют с Beclin 1 значительно сильнее в присутствии LPS или poly(I·C) (лиганды для TLR4 и TLR3, соотв.), это снижает связывание Beclin 1 и Bcl-2 и таким образом запускает активацию аутофагии (136). Более того, interferon (IFN)-γ и его эффектор Irgm1 (IFN-inducible immunity-related GTPase family M member 1; также известный как LRG-47) также необходимы для стимуляции аутофагии в макрофагах и ингибируют жизнеспособность внутриклеточных микобактерий (36, 138).
В ответ на вирусную инфекцию, антивирусный eIF2α kinase сигнальный путь, включая eIF2α и IFN-индуцибельную зависимую от двойной нити РНК protein kinase R (PKR), активируется и активирует аутофагию (145, 146). Некоторые вирусные белки могут продиводействовать индукции аутофагии за счёт непосредственного модулирования Atg белков. Напр., HSV-1 (herpes simplex virus type 1)-кодируемый нейровирулентный белок ICP34.5, который ингибирует аутофагию путем взаимодействия с и секвестрации Beclin 1 (108). Сообщалось также, что вирусная инфекция, такая как инфекция вирусом гепатита С, индуцирующая ER стресс и аутофагию, запускается посредством реакции на неупакованные белки, включая нижестоящие IRE1, ATF6 и PERK сигнальные пути (139).
Transcriptional and Epigenetic Regulation of Autophagy
Transcription
Гены аутофагии регулируются на транскрипционном уровне в ответ на стесс. Напр., в условиях голодания транскрипция маркера аутофагосом Atg8/LC3 is быстро активируется у дрожжей и в некоторых клетках млекопитающих. Однако мало известно о лежащем в основе аппарате. FoxO (Forkhead box transcription factor class O) явился первым транскрипционным фактором, который необходим и достаточен для индукции аутофагии в жировом теле личинок Drosophila (55). Для клеток млекопитающих открытие зависимого от транскрипции механизма посредством FoxO3 сделано в исследованиях по деградации белков во время мышечной атрофии (87, 174). FoxO3 индуцирует транскрипцию множественных генов аутофагии, включая LC3B, Gabarapl1, atg12, atg4B, vps34, ulk2, beclin 1, Bnip3 и Bnip3l. FoxO3 непосредственно соединяется с промоторами LC3B, Gabarapl1, atg12, Bnip3l и Bnip3, чтобы активировать транскрипцию генов. Постоянно активный FoxO3 достаточен, чтобы индуцировать образование аутофагосом в скелетных мышцах взрослых мышей, это способствует лизосомному протеолизу и ведет к слабости мышц. Важно. что FoxO3 функционирует параллельно с путем mTOR, в то время как оба пути находятся ниже передачи сигналов IGF-1/insulin-PtdIns3K-PKB/Akt. Т.о., аутофагия регулируется двумя разными механизмами: не связанного с транскрипцией подавления с помощью mTOR и зависимой от транскрипции активации с помощью FoxO3. Несмотря на это транскрипционные механизмы, которые физиологически регулируют экспрессию генов аутофагии в тканях иных, чем мышечные трубки, не были охарактеризованы.
Индукция аутофагии обратным образом скоррелирована с активным белковым синтезом. В присутствии достатка пищи белки синтезируются, а аутофагия супрессирована, тогда как в ответ на стрессовые стимулы клетки запускают арест трансляции и индукцию аутофагии. Недавние исследования подтвердили, что факторы инициации трансляции, напр., eIF4GI, которые специфически активируют трансляцию генов, контролируют и клеточный рост и пролиферацию, блокируют индукцию аутофагии ниже TOR (116), тогда как сигнальные пути, которые индуцируют арест трансляции, такие как eEF-2 (eukaryotic elongation factor-2) kinase и eIF2α kinase сигнальный путь, позитивно регулируют аутофагию (145, 157). Фосфорилирование eIF2α по Ser51 с помощью консервативного семейства eIF2α protein kinase существенно для глобального ареста трансляции и селективной активации трансляции транскрипционных активаторов (таких как GCN4), которые стимулируют транскрипцию индуцированных голоданием генов. Дрожжи имеют одну eIF2α kinase, Gcn2 (general control nonderepressible-2), которая негативно регулируется с помощью Tor (74), тогда как у млекопитающих известны 4 eIF2α киназы, GCN2, PKR, PERK и HRI (heme-regulated inhibitor), активируемые аминокислотным голоданием, вирусной инфекцией, ER стрессами и устранением гема, соотв. (Figure 3a). Как у дрожжей, так и в MEFs, фосфорилирование eIF2α с помощью GCN2 необходимо для вызванной голоданием аутофагии , а в MEFs, PKR необходим для индукции м с помощью вирусной инфекции (145). Нижестоящий эффект фосфорилирования eIF2α на аутофагии скорее всего транскрипционный, т.к. транскрипция Atg12 активируется с помощью фосфорилированного eIF2α в клетках млекопитающих, нагруженных polyQ72 (72). У дрожжей селективная трансляция Gcn4 (скорее, чем глобальный арест трансляции) с помощью фосфорилирования eIF2α важен для аутофагии, это согласуется с сообщением, по идентификации нескольких генов аутофагии, включая ATG1, ATG13 и APE1, в качестве нижестоящих мишеней для активации транскрипции с помощью Gcn4 (97). Однако исследования, в основном базирующиеся на анализе микромассивов и независимых исследованиях необходимы для тестирования функций транскрипционных активаторов аутофагии у дрожжей.
Chromosome Modification
Накапливаются данные, указывающие на важную роль эпигенетических факторов в регуляции аутофагии при различных патологических условиях. Альтерации статуса ацетилирования гистонов с помощью histone deacetylases (HDACs) являются ключевым механизмом, который контролирует ремоделирование структуры хроматина и генную транскрипцию. Химическое и генетическое ингибирование HDACs ведет к индукции аутофагии (107). Различные хим. ингибиторы HDAC, включая SAHA (suberoylanilide hydroxamic acid) и butyrate, способствуют гиперацетилированию гистонов и преимущественно нацелены на раковые клетки для вызывания апоптической и и независимой от caspase аутофагической гибели клеток в клеточных линиях и у модельных животных (89,135). Хотя существуют споры относительно противораковой роли аутофагии, индуцируемой с помощью супрессии HDAC (12), предложен ряд механизмов для индукции аутофагии с помощью ингибиторов HDAC в исследованиях с разными болезнями. Напр., предполагается, что аутофагия, стимулируемая с помощью SAHA за счет снижения уровня экспрессии и активности mTOR в плотных опухолях клетках эндометриальной стромальной саркомы и посредством ингибирования PKB/Akt и индукции Beclin 1 в клетках HeLa (11, 43), в то время как в злокачественных rhabdoid опухолевых клетках HDAC ингибитор FK228 индуцирует аутофагию путем запуска транслокации AIF (apoptosis inducing factor) в ядро, это обеспечивает независимую от каспазы гибель опухолевых клеток (155).
Специфические транскрипционные эффекты на ATG гены, оказываемые супрессией HDAC, также были описаны. В легочной ткани, полученной от пациентов с хронической обструктивной болезнью легких, вызываемой курением сигарет, ингибирование активности HDAC с помощью экстрактов из выкуриваемых сигарет увеличивается соединение Egr-1 (early growth response-1) и E2F транскрипционных факторов с промоторной областью LC3B и активируется экспрессия LC3B. Кроме того, экспрессия ATG4B также зависит от Egr-1 (19). Хотя нельзя исключить возможность, что усиление аутофагии с помощью ингибирования HDAC может быть обусловлено глобальным арестом клеточного цикла (82) или неспецифическими эффектами на на общую структуру хромосом, это открывает возможности для регуляции аутофагии с помощью хромосомных модификаторов в качестве терапевтических мишеней для клинического вмешательства. Будущие исследования установят специфические функции разных гистоновых deacetylases на гены аутофагии.
Post-Translational Regulation of the Autophagy Machinery
Помимо упомянутой выше ubiquitin-подобной модификации Atg12 и Atg8/LC3, и Tor/PKA-зависимого фосфорилирования Atg1/ULK kinase комплекса, ряд др. пост-трасляционных модификаций разных Atg белков был недавно изучен и было предположено, что они критичны для регуляции аутофагии.
Phosphorylation
Одной мз главных функций фосфорилирования белков является образование каркаса для стыковки, который служит для рекрутирования др. белков. Напр., как наблюдается во время pexophagy у дрожжей Pichia pastoris, у которых рецепторный белок для пероксисом, PpAtg30, фосфорилируется. Посредством фосфорилированных остатков PpAtg30 взаимодействует с др. компонентами аппарата аутофагии, такими как PpAtg11, направляющими пероксисомы на аутофагическое разрушение (28).
C др. стороны, фосфорилирование может также служить для стерического предупреждения межбелковых взаимодействий. В клетках млекопитающих в ответ на ceramide или голодание с Beclin 1, связанный партнер и ингибитор Bcl-2, фосфорилируется по трем остаткам Thr69, Ser70 и Ser87, с помощью JNK1 (112, 156). Гиперфосфорилированный Bcl-2 отсоединяется от Beclin 1 и высвобождает его для индукции аутофагии, тогда как вирусный Bcl-2 (из Kaposi's sarcoma-associated herpes вируса), который лишен остатков для фосфорилирования не может отсоединиться от Beclin 1 и тем самым ингибирует аутофагию. Кроме того, фосфорилирование Beclin 1 по Thr119 в его BH3 домене с помощью DAPk также снижает взаимодействие Bcl-2-Beclin 1 и активирует аутофагию (169). Т.о., фосфорилирование белков. связанных с аутофагией представляет дополнительный аспект регуляции аутофагии.
Acetylation
Модификация деацтилированием белков аппарата аутофагии также необходима для аутофагии (75, 76). Ряд Atg белков, включая Atg5, Atg7, Atg8 и Atg12, ацетилируются в условиях достатка пищи и деацетилируются во время голодания как в клетках HeLa, так и in vivo. Ацетилирование Atg белков зависит специфически от p300 acetyltransferaseЮ, но не от двух др. acetyltransferases, CBP и PCAF, а процесс деацетилирования зависит от NAD-dependent deacetylase Sirt1 (a sirtuin family member). Компоненты аппарата аутофагии физически взаимодействуют с p300 или Sirt1, это регулируется доступностью пищевых источников и вносит вклад в зменения статуса ацетилирования.
Экспрессия Sirt1 индуцируется с помощью ограничения калорий, это коррелирует с повышением продолжительности жизни (162). Следовательно, непосредственное деацетилирование аппарат аутофагии с помощью Sirt1 создает важную механистическую связь между индукцией аутофагии и увеличением продолжительности жизни. Однако молекулярная функция деацетилирования Atg белков при аутофагии в основном неизвестна, хотя деацетилирование может помогать удалению пространственных блокад белкового взаимодействия или рекрутирования или модифицирования активности белков. Кроме того, механизмы, с помощью которых Sirt1 и p300 ощущают приходящие сверху сигналы еще не обнаружены. Возможно, что путь insulin/фактор роста участвуют в контроле процесса обратимого ацетилирования.
Concluding Remarks
Substantial progress has been made in the past few years in understanding the molecular mechanism and regulatory network of autophagy from yeast to mammals. As a major cellular catabolic system targeting a variety of substrates, the autophagic process needs to be tightly controlled. The coordination of Atg proteins with other subcellular components, including the cytoskeleton, the secretory pathway, oncogenes and tumor suppressors, and immunoproteins, is crucial for correct autophagy induction. Both canonical (such as the insulin and growth factor pathway) and novel signaling cascades have been implicated in regulating autophagy, in response to different intra- or extracellular stimuli. Current knowledge and further investigation on the genetic regulation of autophagy will provide a broad spectrum of potential pharmacological targets for modulating autophagy in various disease conditions.
Summary Points
Autophagy mediates the lysosomal degradation of cytosolic proteins, damaged or excess organelles, protein aggregates, and invasive microbes.
Autophagy can nonselectively degrade bulk cytosol or selectively target specific cargos through receptor and adaptor proteins.
Autophagy-related (ATG) gene products cooperatively function at multiple steps to facilitate the formation of a double-membrane autophagosome.
Various stress conditions stimulate induction of autophagy, and the signal transduction mechanisms of autophagy are being identified.
Not much is known about transcriptional regulation of autophagy genes, yet several transcription factors have been suggested to activate or suppress expression of certain ATG genes in yeast, Drosophila, and mammalian tissues.
Autophagy proteins undergo phosphorylation and acetylation modifications that modulate autophagy activity.
Future Issues
Crosstalk between signaling pathways that act in controlling autophagy needs to be further explored, and detailed studies on a potential convergent molecule of several upstream pathways, such as the link between TOR downregulation and autophagy induction, should be carried out.
Characterization of Atg1 kinase substrates and new components in the Atg1 complex in both yeast and higher eukaryotes will provide useful information on the exact functions this important kinase carries out during autophagy.
How substrate specificity is achieved by selective autophagic degradation in various circumstances, for example, cell cycle progression, cell division, development, differentiation, and diseases, deserves extensive investigation. It should be noted that homologs of many ATG genes required for selective autophagy in yeast, such as Atg11, have not been identified in higher eukaryotes. Thus, it is likely that they may share functional and structural similarities but not sequence homology.
Future studies on the mechanistic aspects of autophagosome formation can be performed either in vivo or in vitro. For instance, it will be important to determine how small GTPases and SNARE proteins may collaborate with the autophagy machinery during phagophore assembly, if any of them are involved, and what regulates dissociation of various Atg proteins from a completed autophagosome.
Transcriptional and translational regulation of autophagy genes, such as mRNA expression and stability, and whether there is tissue specificity, need to be better understood in both physiological and pathological stress conditions.
Discovery of new posttranslational modifications on Atg proteins and their regulating mechanisms will add to our current understanding of the genetic regulation of autophagy.
|