Большинство органов и сложных тканей содержит несколько типов клеток, каждый из котрых может вносить вклад в определение формы органа и ткани. Путь, c помощью которого разные типы клеток общаются во время морфогенеза изучен слабо. У C.elegans эпидермис и мышцы участвуют в удлинении эмбриона⁴. Роль эпидермальных клеток в элонгации хорошо известна. Однако наше понимание того, как мышцы влияют на элонгацию и взаимодеействуют с эпидермисом остается расплывчатым. Мутанты с дефектными мышцами арестовываются в средине пути элонгации на ст., известном как две складки, а этот фенотип наз. Pat (paralized at two-fold)⁵ . Взаимодействие между мышцами и эпидермисом может осуществлятся посредством соединений, которые прикрепляют эпидермис к внеклеточному матриксу, находящемуся между мышцами и эпидермисом. Эти соединения закрепляют мышцы на экзоскелете и важны для элонгации⁶ (Рис. 1а). Каждое соединение включает две единицы подобные полудесмосомам на плазматической оболочке апикального и базального эпидермиса с промежуточными филаментами между ними⁶. Мы будем обозначать соединения c помощью таких полудесмосом как CeHDs (C.elegans hemidesmosomes). Физиологи ческая роль CeHDs приводит нас к предположению возможно мышцы д.пердавать сигналы эпидермису посредством механических воздействий. Поэтому мы исследовали могут ли мышечные сокращения механически мдифицировать эпидермис и мы исследовали CeHD белки, которые отвечают на эти механические изменения.

Если мышцы дефрмируют эпидермис, то их сокращения д. модифицировать относительные позиции двух точек в эпидермисе. Мы проверяли эту возможость, используя пучки актина, прикрепленные к плазматической оболочке как пространственные метки, измеряя расстояния между пучками, когда мышцы становятся активными (Рис. 1b-d). Kymographs показали, что мышечные сокращения уменьшаютрасстояние примерно на 50%, при этом уменьшение расстояния не происходило у эмбрионов с дефектными мышцами (Рис. 1c,d). Т.о., мышечные сокращения растягивают и сжимают эпидермис, процесс сравнимый с растягиванием культивируемых клеток растущих на эластичных мембранах^8,9. Нарушение главного компонента CeHDs, VAB-10A¹⁰ (plectin и BPAG1e гомолог) также серьезно нарушают этот процесс, указывая тем самым на критическую роль CeHDs в передаче мышечного натяжения. Более того, в соответствии с более ранними находками, показавшими, что мышцы помогают формированию паттерна CeHDs^5,11 , мышцы способствуют созреванию CeHDs с начального точечного распределения (Рис. 1e,f) в короткие паралельные полоски по окружностсти (Рис. 1g,h), колокализующиеся с эпидермальными актиновыми пучками. Структура CeHD первоначально была нормальной у эмбрионов с дефектными мышеными филаментами, но реогранизация CeHDs была аномальной в отсутствие мышечного натяжения.

Чтобы идентифицировать эпидермальные белки, которые активируются натяжением, мы бызировались на недавнем генетическом скрининге, который идентифицировал 14 генов, чей нокаут в комбинации со слабой мутацией vab-10 влиял на биогенез CeHDs¹². Среди этих генов мы сфокусировались на сигнальной молекуле PAK-1 (Рис.2), поскольку её гомолог у млекопитающих контролирует цитосклет и может лежать в основе изменений артеиального давления, чтобы активировать нижестоящую передачу сигналов^13,14. Мы установили, что распределение РАК-1 совпадает с белками промежуточных филамент на всех стадиях развития, для реорганизуясь в короткие паралельные полоски, типичные для CeHDs (Рис. 2с-е). РАК-1 концентрируется в основании CeHDs , маркированном LET-805 (также известeн как meoyoactin), хотя он также присутствует в апикальных частях CeHDs(Рис. 2d-g). Отсутствие функции РАК-1 затрагивает удлинение эмбриона, редуцирует длину тела на 19% (рис. 2h,i,l).

В соответствии с присутствием РАК-1 в CeHDs мутация с делецией киназного домена pak-1(ok448) (Рис. 2b) в комбинации со слабой жизнеспособной мутацией vab-10A (e698) затрагивает целостность CeHDs. У этих двойных мутантов окрашивание по VAB-10A обнаруживает неспособность формировать полоски во многих областях (стрелка на Рис. 2n) или меньшее окрашивание, где мышцы отсоединены от стенки тела (головки стрелок). Как результат более 60% этих двойных мутантов обнаруживает отсоединение мышц, что ассоциирует с арестом элонгации (Рис. 2k), этого не наблюдается у одиночных мутантов (Рис. 2f,g,i,j). Распределение VAB-10A становится аномальным у двойных мутантов после 1.7-fold стадии (Рис. 2h), когда мышцы начинают сокращаться, указывая тем самым, что CeHDs не могут поддерживать свою целостность, если подвергаются натяжению, вызыванному мышцами. Следовательно, РАК-1 функционирует с VAB-10A, подкрепляя cnnf,bkmyjcnm CeHDs.

Далеемы исследовали, как РАК-1 помогает сборке CeHDs. Исследования in vitro установили,что РАК-1 позвоночных фосфорилирует белок промежуточных филамент vimetin¹⁵. Следовательно, РАК-1 C.elegans также может фосфорилировать эпидермальные промежуточные филаменты (Рис. 1а). Мы непосредственно тестировали гипотезу двумя способами. Во-первых, мы использовали двумерный гель анализ эмбриональнх экстрактов, сопровождаемый иммуноблотингом с МН4 моноклональными антителами, которые распознают белки CeHDs , IFA-2 (также известен как MUA-6) и IFA-3, а также не=эпидермальный белок IFA-1 (ref/16). Это выявляет присутствие двух основных изоэлектрических точек промежуточных филамент, которые отсутствуют после обработки фосфатазой экстрактов (Рис. 3а, стрелки), или в экстрактах pak-1(ok448) (Рис. 3b). Во-вторых, мечение IFA-3, основного белка промежуточных филамент в эмбриональном эпидермисе c помощью Myc показывает, что РАК-1 специфически затрагивает фосфорилирование IFA-3 (Рис. 3с). Поэтому мы пришли к заключению, что РАК-1 в самом деле затрагивает фосфорилирование белка эпидермальных промежуточных филамент.

Затем мы оценивали эффект фосфорилирования на организацию проможуточных филамент. Окрашивание vab-10a (e698;pak-1(ok448) двойных мутантов c помощью MH4 моноклональных антител показало, что аномальные, эктопические, пучки промежуточных филамент присутствуют вне CeHDs (Рис. 3g, стрелки). Мы также наблюдали этот фенотип с комбинации с аллелем pak-1(tm403) с делецией домена CRIB (т.е. у vab-10A9e698); pak-1(tm403) двойных мутантов) , но не у vab-10A(e698;pak-1(ok448) или одиночных pak-1(tm403) мутантов (Рис. 3d-f). Эктопические пучки промежуточных филамент, по-видимому, результат дефектного закрепления промежуточных филамент у мутантов VAB-10A в CeHDs, поскольку мечение IFA-2/3 гетеродимерного партнера IFB-1 зеленым флюоресцентным белком (GFP) вызывает те же самые эктопические полоски промежуочных филамент и фенотип отсоединения мышц, как это наблюдается у vab-10A(e6980;pak-1(ok448) мутантов. Более того, мы идентифицировали S470 остаток IFA-3 как важный регуляторныйй сайт. Изменение этого серинового остатка на аланин усраняет фосфорилиирование IFA-3 и нарушает локализацию IFA-3 в CeHDs на vab-10A(e698) фоне. Итак, эти данные указывают на то, что отсутствие фосфорилирования IFA-3 снижает рекрутирование этого белка в CeHDs и изменяет силу CeHDs у vab-10A(e698) мутантов.

Установив РАК-1 как функционально важную CeHD киназу, мы затем показали, что мышечные сокращения запускают активность РАК-1. Мы использовали фосфорилирование и организацию промежуточных филамент как индикаторы. Мы исследовали два класса эмбрионов с дефектными мышцами: у одних отсутствовал TGL-19, активируемый Са²⁺ канал, который необходим для мышечных сокращений¹⁷; у др. отсутствовал UNC-112, гомолог kindlin, который важен для сборки мышечных филамент¹⁸. Как в случае pak-1 мутантов двумерный иммуноблотинг показал, что оба класса дефектных по мышцам эмбрионов (Рис. 3с), также как и эмбрионы, лишенные LET-805 или VAB-10A, лишены двух фосфо-специфических IFA пятен. Более того, окрашивание антителами обнаруживает эктопические пучки промежуточных филамент у vab-10A(e698);egl-19(n2368cs) двойных мутантов и у vab-10A(e698); unc-112(RNAi) эмбрионов, где unc-112(RNAi) означает мутантов с отсутствием UNC-112 благодаря RNAi (Рис.3i). Устранение функции РАК-1 не вызывает дефектов организации промежуточных филамент у egl-19(n2368cs) эмбрионов и не вызывает сильных дефектов у vab-10A(e698);egl-19(n2368cs). Было предположено, что РАК-1 действует на пути, определяемым мышечным натяжением и что этот путь нуждается в VAB-10A. Итак, строго подтвержадется, что эпидермальный РАК-1 отвечает на механическую стимуляцию модификацией фосфорилирования промежуточных филамент.

Мы расширили наше исследование, чтобы идентифицировать связи между активностью РАК-1 и мышечным натяжением. В согласии с тем, что GTPase Rac и CDC42 являются наиболее распространенными активаторами РАК¹³, мы установили, что активация РАК-1 c помощью натяжения нуждается в GTPase Rac. Во-первых, мы измерили уровни GTP-связанного CED-10 (гомолог Rac у C.elegans) и CDC-42 в эпидермисе c помощью pull-down подхода. Мы наблюдали существеннное снижение (38%) в уровне CED-10-ПЕЗб когда мышечное натяжение было потеряно (Рис.3j,k). В сравнении уровень CDC-42 ПЕЗ снижался только на 12% с более низким доверительным интервалом. In vivo снижение функции CED-10 у vab-10A(e698) эмбрионов вызывает сходные фенотипы эктопических пучков промежуточных филамент. Напротив эпидермальная экспрессия CED-10(G12V)¹⁹ , мутация с заменой аминокислот, которая конституитивно активна, восстанавливает фосфорилирование промежуточных филамент и устраняет дефекты образорвания пучков вызываемые потерей натяжения (Рис.3l) РАК-1 зависимым способом. Но CED-10(G12V) неспособен восстанавливать арест элонгации у эмбрионов с дефектными мышцами (Рис. 3m).

Одна из возможностей заключается в том, что мышечное натяжение способствует эпидермальным процессам в дополнение к фосфорилированию промежуточных филамент. В частности, поскольку CeHDs колокализуются с актиновыми пучками, то мышечное натяжение д. активировать немышечный миозин II, ключевую молекулу, которая управляет изменениями клеточной формы при элонгации^20,21 . Мы тестировали эту возможность и установили, что комбинированная экспрессия постоянно активного CED-10(G12V) и постоянно активной версии регуляторной легкой цепи миозина MLC-4DD²⁰ в занчительной степени восстанавливает элонгацию unc-112-дефектных эмбрионов (Рис.3 m). Восстановление было частичным и мы предположили, что это потому, что CED-10(G12V) и MLC-4DD не могут полностью воспроизвести on-off (вкл.-выкл.) паттерн мышечного натяжения или из-за того, что натяжение стимулирует дополнительные пути. Мы не пытаплись раскрыть путь, ведщий к активации MLC-4 у нормальных эмбронов, но мы пришли к выводу, мышечное натяжение имеет более одного следствия в эпидермисе. Мы полагаем, что CED-10 отвечает на мышечное натяжение, индуцируя киназную активность РАК-1 и усиливая CeHDs c помощью VAB-10A.

Участие CED-10 в передаче мышесного наятяжения позволило нам увидеть Rac guanine-nucleotide exchange factor (RacGEF), который действует на этом пути. Мы проверили потенциал вовлечения 4-х GEF белков, которые действуют с РАК у позвоночных¹³ и мы установили РАК-взаимодействующий обменный фактор (PIX-1) как действующий у C.elegans (Рис.4с). Предыдущие исследования выявили высоко консервативный сигнальный компрекс, содержащий РАК, PIX и G-protein-coupled receptor kinase interactor (GIT), который взаимодействует с Rac/CDC42 GTPases^22,23. Удивительно, как PIX-1, так и GIT-1 C.elegans, становятся видимыми c помощью функциональных трансляционных GEF конструкий²⁴ , локализованных CeHDs (Рис.4фби)б указывая, что они д. действовать совместно с РАК-1. Отсутствие или PIX-1 или GIT-1 функции влияет на нормальную элонгацию и при комбинации с vab-10A(e698) ведет к дефектам CeHD (Рис. 4с-f) Более того, двумерный иммуноблотинг показал, что pix-1- и pak-1-нулевые мутанты имеют идентичные профили фосфорилирования промежуточных филамент. Мы полагаем, что PIX-1, GIT-1 и РАК-1 вместе регулируют фосфорилирование промоежуточных филамент и биогенез CeHDs.

Предыдущие сообщения выявили Rac- независимый PIX-1-GIT-1-PAK-1 сигнальный пут, управляющий миграцией в дистальные кончики клеток у C.elegans²⁴. Однако PIX-1, по-видимому, действует посредством Rac dj время созревания CeHDs, поскольку уровни CED-10-GTP были на 25% ниже у pix-1-нулевых эмбрионов по сравнению с диким типом. Мы интерпретировали различия в уровниях CED-10-GTP у pix-1-нулевых мтантов и у мутантов с дефектными мышцами (снижение на 25% против снижения в 38%) как указание на то, что мышцы активируют CED-10 вне CeHDs, тогда как PIX-1 в основном обнаруживается в CeHDs.

Идентификация PIX-1 и GIT-1 в качестве критических факторов в биогенезе CeHDs указывает, что они являются ранними эффекторами мышечого натяжения. Чтобы установить, как они становятся активными, мы исследовали их распределение у эмбрионов с дефектными мышцами. В то время как РАК-1 и PIX-1 всё ещё локализовались в CeHDs в отсутствие мышечного натяжения, GIT-1 постепенно исчезал из CeHDs эмбрионов с остановленной элонгацией (Рисю 4шбо)ю Эта находка подтверждает, что мышечное натяжение необходимо для поддержания белка GIT-1 в CeHDs. Если это так, то эта модель предсказывает, что внешнее механическое давление должно замещать мышечное натяжение. Мы тестировали это предположение, используя дефектных по UNC-112 эмбрионов для повторных механических давлений (Рис. 4g). По сравнению с контрольными эмбрионами, этот ражим существенно задерживал диффузию GIT-1 из CeHDs у UNC-112-истощенных эмбрионов (Рис. 4h-l)/ Мы пришли к выводу, что CeHDs в самом деле чувствительны к механическим воздействиям и находятся под прямым влиянием физических сил.

Исследования, базирующиеся на растяжении клеток in vitro, выявили роль рецепторов интегринов в передаче удлинения при растяжении ^1,25. Сходным образом у C.elegans было предположено что рецепторы внеклеточного матрикса LET-805 или взаимодействующие с ними партнеры передают мышечное натяжение. Это, в свою очередь, д. запускать конформационные изменения белков CeHDs (напр., VAB-10A), способных сохранять GIT-1 в CeHDs, как это наблюдается для talin в фокальных адгезиях²⁶. Идентификация белков, которые передают мышечное натяжение и закрепляют GIT-1 в CeHDs не осуществлена. Более того, мы полагаем, что GIT-1 поддерживает функциональную связь между натяжением и PIX-1-CED-10-PAK-1 возможно путем удержания PIX-1 в конформационном состоянии, в котором он способен активировать CED-10.

Итак, идентификация сигнального модуля GIT-1-PIX-1-PAK-1 показала, что CeHDs и возможно полудесмосомы позвоночных не только являются структурными единицами, но и также обладают сигнальным потенциалом. Несмотря на открытие Pat мутантного фенотипа⁵ причина, почему мышечные сокращеения необходимы для удлинения эмбрионов, остается неясной. Наши данные, что мышечное натяжение активирует PAK-1-PIX-1-GIT-1 передачу сигналов и немышечный миозин II четко подтверждает гипотезу, базирующуюся на механотрансдукционном процессе во время элонгации. Наши результаты открывают возможность, что сокращающиеся клетки могут локально влиять на поведение соседних эпителиальных клеток в др. онтогенетических процессах, особенно в органах, в которых эпителиальные клетки выстилаются гладкомышечными клетками или в паталогических ситуациях, таких как заживление ран и рак. Сократительные силы действуют подобно инь и янь в развитии: слишком значительные силы д. разрывать ткани, но легкие и устойчивые силы д. способствовать дифференцировке.