Особенности ниш хвостовой почки рыбок данио

Brachyury establishes the embryonic mesodermal progenitor niche Benjamin L. Martin and David Kimelman Genes & Dev. 2010. 24: 2778-2783 \| doi: 10.1101/gad.1962910 Оригинал статьи
Formation of the early vertebrate embryo depends on a Brachyury/Wnt autoregulatory loop within the posterior mesodermal progenitors. We show that exogenous retinoic acid (RA), which dramatically truncates the embryo, represses expression of the zebrafish brachyury ortholog no tail (ntl), causing a failure to sustain the loop. We found that Ntl functions normally to protect the autoregulatory loop from endogenous RA by directly activating cyp26a1 expression. Thus, the embryonic mesodermal progenitors uniquely establish their own niche—with Brachyury being essential for creating a domain of high Wnt and low RA signaling—rather than having a niche created by separate support cells. Рис.1. \| RA impinges on the Ntl—Wnt autoregulatory loop by repressing ntl expression. Рис.2. \| Ntl protects mesodermal progenitors from RA by regulating cyp26a1 expression. Рис.3. \| Ntl directly activates cyp26a1 transcription. Рис.4. \| Ntl establishes the mesodermal progenitor niche.	Стволовые и клетки предшественники играют важную роль во время образования тела позвоночных и в последующем гомеостазе взрослых форм. Всё увеличивающееся количество работ демонстрирует, что существуют стволовые и клетки предшественники по всему эмбриону и в нишах взрослых—уникальных физических и молекулярнных условивй, которые поддерживают долговременное хранение этих популяций (Morrison and Spradling 2008; Voog and Jones 2010). Во время развития позвоночных популяция клеток мезодермальных предшественников, располагающаяся в хвостовой почке, постоянно высвобождает дифференцирующиеся клетки во время всего сомитогенеза (Dubrulle and Pourquie 2004). Ранее мы показали, что поддержание этой популяции зависит от авторегуляторной петли между T-box транскрипционным фактором Brachyury и канонической передачей сигналов Wnt, при этом недостаточность петли ведет к укорочению оси тела (Martin and Kimelman 2008), объясняя, почему Brachyury играет такую существенную роль в развитии позвоночных (Martin and Kimelman 2009). Передача сигналов ретиноевой кислоты (RA) является др. фактором, который может влиять на формирование тела. Добавление RA к эмбрионам позвоночных вызывает тяжелые задние укорочения, на первый взгляд, сходные с потерей Brachyury или передачи сигналов Wnt (Sive et al. 1990). Здесь мы показали, что RA блокирует функцию ауторегуляторной петли путем ингибирования экспрессии no tail (ntl), приводя к неспособности поддерживать передачу сигналов Wnt. Мы установили, что Ntl защищает мезодермальные предшественники от RA, продуцируемой в соседних сомитах путем непосредственной активации экспрессии RA-метаболизирующего энзима Cyp26a1. Наконец, мы показали, что индивидуальные клетки мезодермальных предшественников не нуждаются в экспрессии ntl, wnts или cyp26a1 до тех пор, пока их соседи экспрессируют эти гены, демонстрируя, важную роль Brachyury и его нижестоящих мишеней в создании ниш, в которых мезодермальные предшественники поддерживаются в состоянии прородителей в течение всего сомитогенеза. Ранее идентифицированные ниши для стволовых и клеток предшественников формировались за счет отдельной популяции клеток, поддерживающих ниши, которые существовали рядом со стволовыми/прародительскими клетками. Популяция эмбриональных мезодермальных предшественников, которую мы описали является уникальной по своей способности служить в качестве клеток, поддерживающих ниши, и клеток предшественников без subfunctionalization на два отдельных типа клеток. Эти результаты имеют важное значение для понимания патогенеза Brachyury-экспрессирующих раковых опухолях человека. Results and Discussion RA disrupts posterior growth by inhibiting ntl expression RA , как давно известно, вызывает тяжелые задние укорочения эмбрионов позвоночных, при воздействии во время гаструляции (Murakami and Kameyama 1965; Sive et al. 1990; Kessel and Gruss 1991; Shum et al. 1999). Мы установили, что эта чувствительность сохраняется в течение большей части сомитогенеза, когда формируется задняя половина эмбриона (Fig. 1B; data not shown), демонстрируя, что заднее укорочение, вызываемое воздействием RA не является результатом дефектов раннего формирования паттерна. Поэтому мы исследовали ауторегуляторную петлю Brachyury–Wnt, которая необходима для поддержания мезодермальных предшественников хвостовой почки (Martin and Kimelman 2008, 2009). Чтобы установить, влияет ли непосредственно RA на поддержание этой сигнальной петли, мы исследовали экспрессию ntl и wnt3a. Спустя 1 ч после воздействия RA экспрессия ntl полностью исчезала в мезодермальных предшественниках хвостовой почки (100% RA-обработанных эмбрионов обнаруживали снижение экспрессии ntl, N = 15) (Fig. 1C,D), тогда как экспрессия wnt3a оставалась нормальной (100% RA-обработанных эмбрионов обнаруживали нормальную экспрессию wnt3a, N = 7) (Fig. 1E,F). Спустя 2 ч после воздействия RA подавлялась и экспрессия wnt3a в мезодермальных предшественниках (100% RA-обработанных эмбрионов обнаруживали пониженную экспрессию wnt3a, N = 7) (Fig. 1G,H). Следовательно, передача сигналов RA нарушает поддержание ауторегуляторной петли Brachyury–Wnt, репрессируя экспрессию ntl, это ведет к потере экспрессии wnt и нарушению роста задних частей. Хотя добавление RA эффективно репрессирует экспрессию ntl в мезодермальных предшественниках, оно оказывает незначительный эффект на экспрессию ntl осевой мезодерме во время гаструлы и на стадии хвостовой почки (Fig. 1D; Supplemental Fig. S1). Отсутствие репрессии ntl в осевой мезодерме установлено благодаря отсутствию экспрессии RA рецептора (RAR) в этой области. Поскольку 4 RARs экспрессируются на стадии хвостовой почки, то становится ясным отсутствие экспрессии RAR в осевой мезодерме рыбок данио (Thisse and Thisse 2008), указывающее на то, что экзогенная RA не может репрессировать ntl в осевой мезодерме из-за отсутствия экспрессии рецептора. В самом деле, эктопическая экспрессия RAR в осевой мезодерме ведет к RA-индуцированной репрессии ntl в этой ткани (Supplemental Fig. S1). Далее мы исследовали механизм RA-индуцируемой репрессии ntl и установили, что RA/RAR , скорее всего, действуют косвенно посредством активации неизвестного репрессора ntl (Supplemental Fig. S2). Ntl protects mesodermal progenitors from RA by regulating cyp26a1 expression Во время нормального развития RA продуцируется в задних сомитах, где она играет важную роль по гарании, что фомиты будут сформированы симметрично (Kawakami et al. 2005; Vermot and Pourquie 2005; Sirbu and Duester 2006). Продукция RA контролируется локальной экспрессией aldehyde dehydrogenase (aldh1a2) (Niederreither et al. 1997; Dobbs-McAuliffe et al. 2004), в то время как задний конец эмбриона экспрессирует RA-метаболизирующий энзим cyp26a1 (Abu-Abed et al. 2001; Sakai et al. 2001; Emoto et al. 2005). Экспрессия cyp26a1 непосредственно активируется с помощью передачи сигналов RA, но домен экспрессии в задней части хвостовой почки не зависит от этой регуляции, указывая тем самым, что др. фактор регулирует заднюю активацию (Hu et al. 2008). Поскольку ntl и cyp26a1 экспрессируются в мезодермальных предшественниках и поскольку экзогенная RA способна репрессировать ntl, мы проверяли гипотезу, что Ntl защищает свою собственную экспрессию, регулируя cyp26a1. У ntl мутантных эмбрионов на стадии до дефектов в образовании сомитов наблюдали, что экспрессия cyp26a1 полностью теряется в мезодермальных предшественниках (100% из ntl мутантов, N = 6) (Fig. 2A,B). Напротив, эмбрионы, мутантные по специфичному для хвостовой почки T-box транскрипционному фактору spt, не обнаруживают редукции cyp26a1 (100% со строгой экспрессией cyp26a1, N = 20) (Fig. 2C,D). Расширенный домен cyp26a1 обусловлен неспособностью spt мутантных клеток заканчивать дифференцировку (Griffin and Kimelman 2002). Следовательно, Ntl специфически необходим для экспрессии cyp26a1 в мезодермальных предшественниках. Чтобы определить, достаточен ли Ntl для экспрессии cyp26a1 во время фазы роста задних частей, мы получили трансгенную линию с кодирующей областью ntl под контролем синтетического хитшокового промотора. Активация с помощью теплового шока ntl вызывала повсеместную экспрессию cyp26a1 по всему эмбриону, демонстрируя, что Ntl достаточен для экспрессии cyp26a1 (100% трансгенных эмбрионов имеют повсеместную экспрессию cyp26a1 [N = 30], тогда как экспрессия cyp26a1 оставалась нормальной у всех нетрансгенных потомков от тех же родителей [N = 17]) (Fig. 2E,F). Итак, эти результаты указывают на то, что Ntl защищает свою собственную экспрессию и популяцию мезодермальных предшественников от эффектов эндогенной, продуцируемой сомитами RA путем активации экспрессии cyp26a1. У мышей зпадняя экспрессия cyp26a1 теряется, когда Fgfr1 в ответ на определенные условия мутантен во всех мезодермальных клетках, экспрессрующих brachyury (Wahl et al. 2007). Это и эксперименты на курах показали, что RA ингибирует передачу сигналов Fgf (Diez del Corral et al. 2003), возникает возможность, что Ntlрегулирует экспрессию cyp26a1 косвенно посредством активации передачи сигналов Fgf. Напротив, наша предыдущая работа продемонстрировала, что передача сигналов Fgf поддерживается в мезодермальных предшественниках, лишенных функции Ntl function (Martin and Kimelman 2008), указывая тем самым, что с помощью Ntl регуляция cyp26a1 осуществляется не посредством активации Fgf. Мы установили, что передача сигналов Fgf не используется в задней регуляции cyp26a1, используя индуцируемую тепловым шоком трансгенную линию, экспрессирующую доминантно-негативный Fgfr1 с hsp70 промотора (HS:dnfgfr1) (Lee et al. 2005). Мы использовали эту линию, чтобы ингибировать передачу сигналов Fgf после окончания гаструляции (bud stage), так что мы смогли обойти потребность на ранней гаструле в Fgf для формирования всей задней мезодермы у рыбок данио (Griffin et al. 1995). Несмотря на полную потерю экспрессии непосредственных для Fgf мишеней pea3 и erm после активации с помощью теплового шока dnfgfr1 (100% трансгенных эмбрионов обнаруживали потерю pea3 и erm, N = 20 и N = 19, соотв.) (Fig. 2G–J), экспрессия cyp26a1 в задней части хвостовой почки была нормальной (100% трансгенных эмбронов имели нормальню экспрессию cyp26a1, N = 19) (Fig. 2K,L). Соотв., мы также нашли, что экспрессия ntl нормальная в хвостовой почке после потери функции Fgf (100% трансгенных эмбрионов имели нормальюную экспрессию ntl , N = 20) (Fig. 2M,N). Эти данные подтверждают, что cyp26a1 рыбок данио не регулируется с помощью передачи сигналов Fgf и возникает возможность, что Ntl непосредственно активирует экспрессию cyp26a1 в мезодермальных предшественниках. Ntl directly activates cyp26a1 Вызывали избыточную экспрессию Ntl-glucocorticoid receptor (Ntl-GR) слитого белка у эмбионов. Этот слитый белок проникает в ядро только, когда добавляется индуктор dexamethasone (Kolm and Sive 1995). Чтобы проверить непосредственную регуляцию, добавляли cycloheximide (Chx) за 30 мин. до ддобавления дексаметазона. В отсутствие белкового синтеза белок Ntl-GR расширял экспрессию cyp26a1 только, когда добавлялся дексаметазон (81% из Chx/Dex-обработанных эмбрионов расширяли экспрессию cyp26a1 [N = 27], тогда как 9% эмбрионов, обработанных только Chx расширяли экспрессию cyp26a1 [N = 23]) (Fig. 3A,B). Мы идентифицировали потенциальные Ntl-связывающие сайты в области в 2.5-kb выше точки старта транскрипции cyp26a1, которые, как было установлено, ранее полностью воспроизводят эндогенную экспрессию cyp26a1 (Hu et al. 2008). Используя Ntl position-weighted матрикс (Garnett et al. 2009), мы идентифицировали 7 Ntl-связывающих сайтов с P-значением <0.001 (Fig. 3C,E). Подход с активностью luciferase в 293T клетках продемонстрировал, что Ntl способен сильно активировать дикого типа промотор cyp26a1 (Fig. 3D). Комбинация делеций и мутационный анализ индивидуальных Ntl-связывающих сайтов показал, что два сайта проксимальнее точки старта транскрипции cyp26a1 важны для большей части Ntl активации промотора cyp26a1 (Fig. 3D). В комбинации с результатом Ntl-GR эти данные показывают, что Ntl действует непосредственно через Ntl-связывающие сайты, чтобы активировать экспрессию cyp26a1. Присутствие, по крайней мере, 5 предполагаемых Ntl-связывающих сайтов с P-значением <0.001 в 2.5 kb от точки старта транскрипции cyp26a1 у 5 разных видов рыб демонстрирует, что Ntl регуляция cyp26a1, скорее всего, эволюционно законсервирована (Fig. 3E). Ntl establishes the embryonic mesodermal progenitor niche В контексте целого эмбриона потеря Ntl ведет к потере экспрессии wnt3a, wnt8 и cyp26a1 (Fig. 2; Martin and Kimelman 2008), вызывая неспособность поддерживать мезодермальные предшественники и вызывая последующее укорочение задних частей. Неожиданно мы установили, что потеря функции Ntl в одиночных клетках мезодермальных предшественников, трансплантированных в окружение, не имеет последствий для их развития и они могут вносить вклад в сомиты всех уровней оси (Martin and Kimelman 2008). Единственная возможность заключается в том, что одиночные клетки, лишенные Ntl, восстанавливаются за счет окружающих клеток предшественников дикого типа, которые предоставляют Wnt лиганды и редуцируют уровни RA в окружении предшественников, так что любая одиночная клетки не нуждается в продукции цитозольного энзима Cyp26a1, чтобы деградировать саму RA. Альтернативно, окружающие клетки дикого типа д. продуцировать сигнал, который д. индуцировать транскрипцию wnts и cyp26a1 в ntl мутантных клетках. Чтобы сделать выбор между двумя этими возможностями, ntl морфантные клетки, содержащие флюоресцин dextran, трансплантировали в хозяев дикого типа, которые позднее фиксировали и проверяли на экспрессию wnt3a, wnt8 и cyp26a1. В то время как контрольные дикого типа трансплантаты экспрессировали эти гены нормально, ntl морфантные клетки неспособны экспрессировать все три гена (80%, N = 10; 90%, N = 10; and 70%, N = 17, соотв.) (Fig. 4, cf. D–F and A–C). Следовательно, Ntl функционирует клеточно автономно, чтобы активировать wnt гены и cyp26a1 в домен предшественников. Хотя экспрессия cyp26a1 сильно снижена в ntl морфантных клетках (Fig. 4D), остается возможность, что низкий уровень экспрессии cyp26a1 всё ещё может оказывать защитную функцию. А если клетки лишены всех Cyp26a1 будут ли они способны функционировать нормально. Клетки от cyp26a1 мутантов (giraffe) (Emoto et al. 2005) трансплантировали хозяину дикого типа, подобно ntl мутантным трансплантатам, и было установлено, что они развиваются нормально и заполняют сомиты на всех уровнях оси тела (50% эмбрионов хозяев с мутантными cyp26a1 клетками в сомитаъ каудальнее 24th сомита, N = 18; 52% эмбрионов хозяев с контрольными дикого типа клетками в сомитах кзади от сомита, N = 21) (Fig. 4G,H). Поскольку cyp26a1 мутанты имеют укороченное тело (Emoto et al. 2005), мы пришли к выводу, что популяция мезодермальных предшественников функционирует как сообщество, чтобы джеградировать, происходящую из сомитов RA на заднем конце эмбриона, тогда как любая индивидуальная клетка не обладает способностью деградировать RA. Итак, мутанты cyp26a1 имеют пониженную экспрессию ntl на постгаструляционных стадиях (data not shown), , следовательно, важная роль Ntl заключается в активации экспрессии cyp26a1 внутри сообщества клеток предшественников, чтобы предупредить эндогенную RA от репрессии ntl, которая д. затем супрессировать Ntl/Wnt ауторегуляторную петлю и тем самым вызывать укорочение эмбриона. Conclusion Широко распространенные примеры ниш стволовых и клеток предшественников в эмбрионах и взрослых организмах состоят, по крайней мере, из двух генеральных типов клеток: клеток стволовых/предшественников и поддерживающих клеток, которые предоставляют физическое и молекулярное окружение, необходимое для поддержания стволовых и клеток предшественников (Morrison and Spradling 2008; Voog and Jones 2010). Наши данные предоставляют доказательства уникального типа ниш клеток предшественников, состоящих только из одного типа клеток, в которых клетки мезодермальных предшественников хвостовой почки рыбок данио действуют как свои собственные поддерживающие клетки. Мезодермальные предшественники экспрессируют ntl, wnt3a, wnt8 и cyp26a1, каждый из которых необходим в популяции предшественников как целом, но ни один из них не нужен индивидуальным клеткам предшественникам в окружении дикого типа. Это демонстрирует, что клетки мезодермальных предшественников дикого типа действуют как поддерживающие клетки для генетически дефицитных предшественников и могут поддерживать их, создавая условия высокого уровня передачи сигналов Wnt и низкого уровня передачи сигналов RA. Первичная функция Ntl, следовательно, заключается в создании ниши мезодермальных предшественников путем прямой регуляции канонических wnt лигандов и cyp26a1 (Fig. 4I). Поскольку наш анализ сфокусирован специфически на рыбках данио, общие фенотипы потери функции brachyury и от воздействия RA у разных позвоночных (Dobrovolskaia-Zavadskaia 1927; Murakami and Kameyama 1965; Sive et al. 1990; Halpern et al. 1993; Schulte-Merker et al. 1994; Conlon et al. 1996; Martin and Kimelman 2008), также как консервация паттернов экспрессии brachyury, wnts и cyp26a1, указывает на то, что один и тот же механизм является общим для всех позвоночных. Поэтому мы полагаем, что экспрессия brachyury в домене предшественников, явилась адаптацией позвоночных, которая позволяет клеткам предшественникам сохраняться во время длительного процесса сомитогенеза, который у некоторых видов может длиться несколько дней (Gomez et al. 2008). Эта уникальная функция Brachyury особенно полезна, учитывая, что недавний молекулярный анализ различных раковых опухолей человека продемонстрировал, что brachyury обычно усиливает свою активность в опухолях (напр., Vujovic et al. 2006; Palena et al. 2007; Yang et al. 2009; Yoshida et al. 2010). Активация brachyury может в конечном эффекте создавать ниши раковых клеток, которые поддерживают высокий уровень передачи сигналов Wnt и низкий уровень передачи сигналов RA, оба они являются ключевыми компонентами ракового роста (Freemantle et al. 2003; Reya and Clevers 2005; Fodde and Brabletz 2007; Osanai et al. 2010).

Стволовые и клетки предшественники играют важную роль во время образования тела позвоночных и в последующем гомеостазе взрослых форм. Всё увеличивающееся количество работ демонстрирует, что существуют стволовые и клетки предшественники по всему эмбриону и в нишах взрослых—уникальных физических и молекулярнных условивй, которые поддерживают долговременное хранение этих популяций (Morrison and Spradling 2008; Voog and Jones 2010). Во время развития позвоночных популяция клеток мезодермальных предшественников, располагающаяся в хвостовой почке, постоянно высвобождает дифференцирующиеся клетки во время всего сомитогенеза (Dubrulle and Pourquie 2004). Ранее мы показали, что поддержание этой популяции зависит от авторегуляторной петли между T-box транскрипционным фактором Brachyury и канонической передачей сигналов Wnt, при этом недостаточность петли ведет к укорочению оси тела (Martin and Kimelman 2008), объясняя, почему Brachyury играет такую существенную роль в развитии позвоночных (Martin and Kimelman 2009).

Передача сигналов ретиноевой кислоты (RA) является др. фактором, который может влиять на формирование тела. Добавление RA к эмбрионам позвоночных вызывает тяжелые задние укорочения, на первый взгляд, сходные с потерей Brachyury или передачи сигналов Wnt (Sive et al. 1990). Здесь мы показали, что RA блокирует функцию ауторегуляторной петли путем ингибирования экспрессии no tail (ntl), приводя к неспособности поддерживать передачу сигналов Wnt. Мы установили, что Ntl защищает мезодермальные предшественники от RA, продуцируемой в соседних сомитах путем непосредственной активации экспрессии RA-метаболизирующего энзима Cyp26a1. Наконец, мы показали, что индивидуальные клетки мезодермальных предшественников не нуждаются в экспрессии ntl, wnts или cyp26a1 до тех пор, пока их соседи экспрессируют эти гены, демонстрируя, важную роль Brachyury и его нижестоящих мишеней в создании ниш, в которых мезодермальные предшественники поддерживаются в состоянии прородителей в течение всего сомитогенеза.

Ранее идентифицированные ниши для стволовых и клеток предшественников формировались за счет отдельной популяции клеток, поддерживающих ниши, которые существовали рядом со стволовыми/прародительскими клетками. Популяция эмбриональных мезодермальных предшественников, которую мы описали является уникальной по своей способности служить в качестве клеток, поддерживающих ниши, и клеток предшественников без subfunctionalization на два отдельных типа клеток. Эти результаты имеют важное значение для понимания патогенеза Brachyury-экспрессирующих раковых опухолях человека.

Results and Discussion

RA disrupts posterior growth by inhibiting ntl expression

RA , как давно известно, вызывает тяжелые задние укорочения эмбрионов позвоночных, при воздействии во время гаструляции (Murakami and Kameyama 1965; Sive et al. 1990; Kessel and Gruss 1991; Shum et al. 1999). Мы установили, что эта чувствительность сохраняется в течение большей части сомитогенеза, когда формируется задняя половина эмбриона (Fig. 1B; data not shown), демонстрируя, что заднее укорочение, вызываемое воздействием RA не является результатом дефектов раннего формирования паттерна. Поэтому мы исследовали ауторегуляторную петлю Brachyury–Wnt, которая необходима для поддержания мезодермальных предшественников хвостовой почки (Martin and Kimelman 2008, 2009). Чтобы установить, влияет ли непосредственно RA на поддержание этой сигнальной петли, мы исследовали экспрессию ntl и wnt3a. Спустя 1 ч после воздействия RA экспрессия ntl полностью исчезала в мезодермальных предшественниках хвостовой почки (100% RA-обработанных эмбрионов обнаруживали снижение экспрессии ntl, N = 15) (Fig. 1C,D), тогда как экспрессия wnt3a оставалась нормальной (100% RA-обработанных эмбрионов обнаруживали нормальную экспрессию wnt3a, N = 7) (Fig. 1E,F). Спустя 2 ч после воздействия RA подавлялась и экспрессия wnt3a в мезодермальных предшественниках (100% RA-обработанных эмбрионов обнаруживали пониженную экспрессию wnt3a, N = 7) (Fig. 1G,H). Следовательно, передача сигналов RA нарушает поддержание ауторегуляторной петли Brachyury–Wnt, репрессируя экспрессию ntl, это ведет к потере экспрессии wnt и нарушению роста задних частей.

Хотя добавление RA эффективно репрессирует экспрессию ntl в мезодермальных предшественниках, оно оказывает незначительный эффект на экспрессию ntl осевой мезодерме во время гаструлы и на стадии хвостовой почки (Fig. 1D; Supplemental Fig. S1). Отсутствие репрессии ntl в осевой мезодерме установлено благодаря отсутствию экспрессии RA рецептора (RAR) в этой области. Поскольку 4 RARs экспрессируются на стадии хвостовой почки, то становится ясным отсутствие экспрессии RAR в осевой мезодерме рыбок данио (Thisse and Thisse 2008), указывающее на то, что экзогенная RA не может репрессировать ntl в осевой мезодерме из-за отсутствия экспрессии рецептора. В самом деле, эктопическая экспрессия RAR в осевой мезодерме ведет к RA-индуцированной репрессии ntl в этой ткани (Supplemental Fig. S1). Далее мы исследовали механизм RA-индуцируемой репрессии ntl и установили, что RA/RAR , скорее всего, действуют косвенно посредством активации неизвестного репрессора ntl (Supplemental Fig. S2).

Ntl protects mesodermal progenitors from RA by regulating cyp26a1 expression

Во время нормального развития RA продуцируется в задних сомитах, где она играет важную роль по гарании, что фомиты будут сформированы симметрично (Kawakami et al. 2005; Vermot and Pourquie 2005; Sirbu and Duester 2006). Продукция RA контролируется локальной экспрессией aldehyde dehydrogenase (aldh1a2) (Niederreither et al. 1997; Dobbs-McAuliffe et al. 2004), в то время как задний конец эмбриона экспрессирует RA-метаболизирующий энзим cyp26a1 (Abu-Abed et al. 2001; Sakai et al. 2001; Emoto et al. 2005). Экспрессия cyp26a1 непосредственно активируется с помощью передачи сигналов RA, но домен экспрессии в задней части хвостовой почки не зависит от этой регуляции, указывая тем самым, что др. фактор регулирует заднюю активацию (Hu et al. 2008). Поскольку ntl и cyp26a1 экспрессируются в мезодермальных предшественниках и поскольку экзогенная RA способна репрессировать ntl, мы проверяли гипотезу, что Ntl защищает свою собственную экспрессию, регулируя cyp26a1. У ntl мутантных эмбрионов на стадии до дефектов в образовании сомитов наблюдали, что экспрессия cyp26a1 полностью теряется в мезодермальных предшественниках (100% из ntl мутантов, N = 6) (Fig. 2A,B). Напротив, эмбрионы, мутантные по специфичному для хвостовой почки T-box транскрипционному фактору spt, не обнаруживают редукции cyp26a1 (100% со строгой экспрессией cyp26a1, N = 20) (Fig. 2C,D). Расширенный домен cyp26a1 обусловлен неспособностью spt мутантных клеток заканчивать дифференцировку (Griffin and Kimelman 2002). Следовательно, Ntl специфически необходим для экспрессии cyp26a1 в мезодермальных предшественниках.

Чтобы определить, достаточен ли Ntl для экспрессии cyp26a1 во время фазы роста задних частей, мы получили трансгенную линию с кодирующей областью ntl под контролем синтетического хитшокового промотора. Активация с помощью теплового шока ntl вызывала повсеместную экспрессию cyp26a1 по всему эмбриону, демонстрируя, что Ntl достаточен для экспрессии cyp26a1 (100% трансгенных эмбрионов имеют повсеместную экспрессию cyp26a1 [N = 30], тогда как экспрессия cyp26a1 оставалась нормальной у всех нетрансгенных потомков от тех же родителей [N = 17]) (Fig. 2E,F). Итак, эти результаты указывают на то, что Ntl защищает свою собственную экспрессию и популяцию мезодермальных предшественников от эффектов эндогенной, продуцируемой сомитами RA путем активации экспрессии cyp26a1.

У мышей зпадняя экспрессия cyp26a1 теряется, когда Fgfr1 в ответ на определенные условия мутантен во всех мезодермальных клетках, экспрессрующих brachyury (Wahl et al. 2007). Это и эксперименты на курах показали, что RA ингибирует передачу сигналов Fgf (Diez del Corral et al. 2003), возникает возможность, что Ntlрегулирует экспрессию cyp26a1 косвенно посредством активации передачи сигналов Fgf. Напротив, наша предыдущая работа продемонстрировала, что передача сигналов Fgf поддерживается в мезодермальных предшественниках, лишенных функции Ntl function (Martin and Kimelman 2008), указывая тем самым, что с помощью Ntl регуляция cyp26a1 осуществляется не посредством активации Fgf. Мы установили, что передача сигналов Fgf не используется в задней регуляции cyp26a1, используя индуцируемую тепловым шоком трансгенную линию, экспрессирующую доминантно-негативный Fgfr1 с hsp70 промотора (HS:dnfgfr1) (Lee et al. 2005). Мы использовали эту линию, чтобы ингибировать передачу сигналов Fgf после окончания гаструляции (bud stage), так что мы смогли обойти потребность на ранней гаструле в Fgf для формирования всей задней мезодермы у рыбок данио (Griffin et al. 1995). Несмотря на полную потерю экспрессии непосредственных для Fgf мишеней pea3 и erm после активации с помощью теплового шока dnfgfr1 (100% трансгенных эмбрионов обнаруживали потерю pea3 и erm, N = 20 и N = 19, соотв.) (Fig. 2G–J), экспрессия cyp26a1 в задней части хвостовой почки была нормальной (100% трансгенных эмбронов имели нормальню экспрессию cyp26a1, N = 19) (Fig. 2K,L). Соотв., мы также нашли, что экспрессия ntl нормальная в хвостовой почке после потери функции Fgf (100% трансгенных эмбрионов имели нормальюную экспрессию ntl , N = 20) (Fig. 2M,N). Эти данные подтверждают, что cyp26a1 рыбок данио не регулируется с помощью передачи сигналов Fgf и возникает возможность, что Ntl непосредственно активирует экспрессию cyp26a1 в мезодермальных предшественниках.

Ntl directly activates cyp26a1

Вызывали избыточную экспрессию Ntl-glucocorticoid receptor (Ntl-GR) слитого белка у эмбионов. Этот слитый белок проникает в ядро только, когда добавляется индуктор dexamethasone (Kolm and Sive 1995). Чтобы проверить непосредственную регуляцию, добавляли cycloheximide (Chx) за 30 мин. до ддобавления дексаметазона. В отсутствие белкового синтеза белок Ntl-GR расширял экспрессию cyp26a1 только, когда добавлялся дексаметазон (81% из Chx/Dex-обработанных эмбрионов расширяли экспрессию cyp26a1 [N = 27], тогда как 9% эмбрионов, обработанных только Chx расширяли экспрессию cyp26a1 [N = 23]) (Fig. 3A,B). Мы идентифицировали потенциальные Ntl-связывающие сайты в области в 2.5-kb выше точки старта транскрипции cyp26a1, которые, как было установлено, ранее полностью воспроизводят эндогенную экспрессию cyp26a1 (Hu et al. 2008). Используя Ntl position-weighted матрикс (Garnett et al. 2009), мы идентифицировали 7 Ntl-связывающих сайтов с P-значением <0.001 (Fig. 3C,E). Подход с активностью luciferase в 293T клетках продемонстрировал, что Ntl способен сильно активировать дикого типа промотор cyp26a1 (Fig. 3D). Комбинация делеций и мутационный анализ индивидуальных Ntl-связывающих сайтов показал, что два сайта проксимальнее точки старта транскрипции cyp26a1 важны для большей части Ntl активации промотора cyp26a1 (Fig. 3D). В комбинации с результатом Ntl-GR эти данные показывают, что Ntl действует непосредственно через Ntl-связывающие сайты, чтобы активировать экспрессию cyp26a1. Присутствие, по крайней мере, 5 предполагаемых Ntl-связывающих сайтов с P-значением <0.001 в 2.5 kb от точки старта транскрипции cyp26a1 у 5 разных видов рыб демонстрирует, что Ntl регуляция cyp26a1, скорее всего, эволюционно законсервирована (Fig. 3E).

Ntl establishes the embryonic mesodermal progenitor niche

В контексте целого эмбриона потеря Ntl ведет к потере экспрессии wnt3a, wnt8 и cyp26a1 (Fig. 2; Martin and Kimelman 2008), вызывая неспособность поддерживать мезодермальные предшественники и вызывая последующее укорочение задних частей. Неожиданно мы установили, что потеря функции Ntl в одиночных клетках мезодермальных предшественников, трансплантированных в окружение, не имеет последствий для их развития и они могут вносить вклад в сомиты всех уровней оси (Martin and Kimelman 2008). Единственная возможность заключается в том, что одиночные клетки, лишенные Ntl, восстанавливаются за счет окружающих клеток предшественников дикого типа, которые предоставляют Wnt лиганды и редуцируют уровни RA в окружении предшественников, так что любая одиночная клетки не нуждается в продукции цитозольного энзима Cyp26a1, чтобы деградировать саму RA. Альтернативно, окружающие клетки дикого типа д. продуцировать сигнал, который д. индуцировать транскрипцию wnts и cyp26a1 в ntl мутантных клетках. Чтобы сделать выбор между двумя этими возможностями, ntl морфантные клетки, содержащие флюоресцин dextran, трансплантировали в хозяев дикого типа, которые позднее фиксировали и проверяли на экспрессию wnt3a, wnt8 и cyp26a1. В то время как контрольные дикого типа трансплантаты экспрессировали эти гены нормально, ntl морфантные клетки неспособны экспрессировать все три гена (80%, N = 10; 90%, N = 10; and 70%, N = 17, соотв.) (Fig. 4, cf. D–F and A–C). Следовательно, Ntl функционирует клеточно автономно, чтобы активировать wnt гены и cyp26a1 в домен предшественников.

Хотя экспрессия cyp26a1 сильно снижена в ntl морфантных клетках (Fig. 4D), остается возможность, что низкий уровень экспрессии cyp26a1 всё ещё может оказывать защитную функцию. А если клетки лишены всех Cyp26a1 будут ли они способны функционировать нормально. Клетки от cyp26a1 мутантов (giraffe) (Emoto et al. 2005) трансплантировали хозяину дикого типа, подобно ntl мутантным трансплантатам, и было установлено, что они развиваются нормально и заполняют сомиты на всех уровнях оси тела (50% эмбрионов хозяев с мутантными cyp26a1 клетками в сомитаъ каудальнее 24th сомита, N = 18; 52% эмбрионов хозяев с контрольными дикого типа клетками в сомитах кзади от сомита, N = 21) (Fig. 4G,H). Поскольку cyp26a1 мутанты имеют укороченное тело (Emoto et al. 2005), мы пришли к выводу, что популяция мезодермальных предшественников функционирует как сообщество, чтобы джеградировать, происходящую из сомитов RA на заднем конце эмбриона, тогда как любая индивидуальная клетка не обладает способностью деградировать RA. Итак, мутанты cyp26a1 имеют пониженную экспрессию ntl на постгаструляционных стадиях (data not shown), , следовательно, важная роль Ntl заключается в активации экспрессии cyp26a1 внутри сообщества клеток предшественников, чтобы предупредить эндогенную RA от репрессии ntl, которая д. затем супрессировать Ntl/Wnt ауторегуляторную петлю и тем самым вызывать укорочение эмбриона.

Conclusion

Широко распространенные примеры ниш стволовых и клеток предшественников в эмбрионах и взрослых организмах состоят, по крайней мере, из двух генеральных типов клеток: клеток стволовых/предшественников и поддерживающих клеток, которые предоставляют физическое и молекулярное окружение, необходимое для поддержания стволовых и клеток предшественников (Morrison and Spradling 2008; Voog and Jones 2010). Наши данные предоставляют доказательства уникального типа ниш клеток предшественников, состоящих только из одного типа клеток, в которых клетки мезодермальных предшественников хвостовой почки рыбок данио действуют как свои собственные поддерживающие клетки. Мезодермальные предшественники экспрессируют ntl, wnt3a, wnt8 и cyp26a1, каждый из которых необходим в популяции предшественников как целом, но ни один из них не нужен индивидуальным клеткам предшественникам в окружении дикого типа. Это демонстрирует, что клетки мезодермальных предшественников дикого типа действуют как поддерживающие клетки для генетически дефицитных предшественников и могут поддерживать их, создавая условия высокого уровня передачи сигналов Wnt и низкого уровня передачи сигналов RA. Первичная функция Ntl, следовательно, заключается в создании ниши мезодермальных предшественников путем прямой регуляции канонических wnt лигандов и cyp26a1 (Fig. 4I). Поскольку наш анализ сфокусирован специфически на рыбках данио, общие фенотипы потери функции brachyury и от воздействия RA у разных позвоночных (Dobrovolskaia-Zavadskaia 1927; Murakami and Kameyama 1965; Sive et al. 1990; Halpern et al. 1993; Schulte-Merker et al. 1994; Conlon et al. 1996; Martin and Kimelman 2008), также как консервация паттернов экспрессии brachyury, wnts и cyp26a1, указывает на то, что один и тот же механизм является общим для всех позвоночных. Поэтому мы полагаем, что экспрессия brachyury в домене предшественников, явилась адаптацией позвоночных, которая позволяет клеткам предшественникам сохраняться во время длительного процесса сомитогенеза, который у некоторых видов может длиться несколько дней (Gomez et al. 2008). Эта уникальная функция Brachyury особенно полезна, учитывая, что недавний молекулярный анализ различных раковых опухолей человека продемонстрировал, что brachyury обычно усиливает свою активность в опухолях (напр., Vujovic et al. 2006; Palena et al. 2007; Yang et al. 2009; Yoshida et al. 2010). Активация brachyury может в конечном эффекте создавать ниши раковых клеток, которые поддерживают высокий уровень передачи сигналов Wnt и низкий уровень передачи сигналов RA, оба они являются ключевыми компонентами ракового роста (Freemantle et al. 2003; Reya and Clevers 2005; Fodde and Brabletz 2007; Osanai et al. 2010).

Brachyury establishes the embryonic mesodermal progenitor nicheBenjamin L. Martin and David Kimelman Genes & Dev. 2010. 24: 2778-2783 | doi: 10.1101/gad.1962910 Оригинал статьи

Brachyury establishes the embryonic mesodermal progenitor niche
Benjamin L. Martin and David Kimelman
Genes & Dev. 2010. 24: 2778-2783 | doi: 10.1101/gad.1962910 Оригинал статьи