Intermediate filaments (IFs) являются одной из трех состоящих из филамент сетей, которые поддерживают структурную целостность клеток эукариот. Они состоят из фиброзных белков, кодируемых мультигенным семейством и экспрессирующихся клеточно-специфично и онтогенетически регулируемым способом (Herrmann et at., 2003; Eriksson et al., 2009). Разнообразие составных элементов IF и их дифференциальная экспрессия во время эмбрионального развития ставит вопрос о том, играют ли индивидуальные IF белки сходные роли в разных типах клеток или они расходятся функционально. Некоторые исследования, базирующиеся на экспериментах по устранению генов у мышей или анализу генетических дефектов у человека выявляют структурную роль у многих IF белков в обеспечении резистентности против механических стрессов, особенно в эпителии и мышечной ткани (Fuchs and Cleveland, 1998; Carlsson and Thornell, 2001; Herrmann et al., 2003). Недавние доказательства, однако, подчеркивают, связанные с болезнями функции lF белков, которые ассоциируют с их не-механическими функциями в передаче сигналов и контроле генетических регуляторных сетей (Szeverenyi et al., 2008; Eriksson et al., 2009).
Transitin является IF белком, экспрессирующемся на ранних стадиях эмбрионального развития кур. Способом, сходным с тем, что и у nestin у эмбрионов млекопитающих, экспрессия transitin по времени и онтогенетически регулируется в миогенных и нейрогенных клетках птиц (Chabot and Vincent, 1990; Cossette and Vincent, 1991; McCabe et al., 1992; Kelly et al., 1995). Характеристика куриного гена transitin выявляет строгое взаимоотношение с nestin классом IF (Napier et al., 1999), но C-terminal домен transitin отличается от nestin и содержит уникальный сходный с лейциновой застежкой heptad repeat мотив (HR домен) неродственный повторяющемуся мотиву в хвостовом домене nestin (Yuan et al., 1997; Napier et al., 1999). Тем не менее птичий transitin и его сплайс-вариант paranemin (Hemken et al., 1997) являются ортологами семейства nestin генов млекопитающих (Guerette et al., 2007). Эти белки ко-экспрессируются с vimentin в большинстве клеток предшественников нервной и мышечной ткани до приобретения терминальным IF белком типичного из полностью дифференцированного состояния.
Функция transitin в эмбриогенезе недостаточно понятна, но предыдущие наблюдения намекают на возможную роль в событиях, происходящих на клеточной периферии миобластов и нейробластов. Его экспрессия в радиальной глие в соответствующих сайтах адгезии с клеточным субстратом (McCabe et al., 1992) и локализация его мРНК на синаптических окончаниях (endfeet) радиальной глии (Lee and Cole, 2000) подтверждают локальную регуляцию концентрации transitin в специфических дистальных компартментах. Кроме того, в нашей лаборатории продемонстрировано, что субнабор молекул transitin концентрируется в субмембранозном домене мигрирующих клеток нервного гребня
in vitro (Darenfed et al., 2001). Иммунореактивность этого субмембранозного домена быстро исчезает из точек межклеточных контактов, когда птичьи QM7 миобласты понуждаются к слиянию и дифференцировке в мышечные трубки. Недавно было показано, что transitin играет важную роль в детерминации внутриклеточной локализации детерминанта судьбы Numb в птичьих митотических нейроэпителиальных клетках (Wakamatsu et al., 2007), подтверждая, что он может косвенно регулировать нейрогенез. Эти наблюдения привели нас к исследованию потенциальной роли transitin в
in vitro птичьей модели миогенеза, на линии клеток QM7.
Transitin Is Required for Desmin Expression and for Myotube Formation
Ранние ступени мышечной дифференцировки могут быть воспроизведены in vitro с линией миогенных клеток птиц QM7 (Antin and Ordahl, 1991). Моноядерные QM7 реплицируются в ростовой среде (GM), они выходят из клеточного цикла и сливаются, образуя удлиненные мышечные трубочки (Antin and Ordahl, 1991). Transitin экспрессируется в миобластах на ранних стадиях образования мышечных трубочек, как в первичных (Cossette and Vincent, 1991) , так и в культурах QM7 мышечных клеток. Экспрессия transitin совпадает с прогрессивным замещением vimentin на desmin в дифференцирующихся мышечных трубочках (Cossette and Vincent, 1991). Transitin и desmin ко-экспрессируются в ранних QM7 мышечных трубочках также(Fig. 1A and B) и этот процесс сопровождается активацией нескольких генов, кодирующих мышце-специфические белки (напр., MHC) и подавлением Pax7, маркера клеток миогенных предшественников .
Используя siRNA технику для замалчивания генов, мы исследовали роль transitin во время миогенеза
in vitro . QM7 клетки были стабильно трансфицированы векторами RNAi экспрессии pSilencer T1338-scramble (non-targeting RNAi или NT) и pSilencer T1338-transitin (Transitin-tar-geting RNAi или siTnl-4). Мы наблюдали эффективное замалчивание экспрессии белка transitin (60-70%) в 3 из 4 выбранных клеточных линий, siTnl, siTn2 и siTn4 (Figs. 2 and 3B). При культивировании в GM, siRNA-трансфицированные клетки QM7 выглядели менее удлинёнными, чем контрольные клетки и экспрессировали эквивалентные количества Pax7 и vimentin (Fig. ЗА). Уровни мРНК
transitin, согласно RT-PCR, были заметно снижены в siRNA-трансфицированных линиях клеток (Fig. 3B), Чтобы определить эффект нокдауна transitin на миогенез
in vitro, вызывали дифференцировку путем инкубации клеток в DM. По сравнению с QM7 и контрольными siRNA-трансфицированными культурами, трансфицированные линии клеток siTnl и siTn2 неспособны индуцировать экспрессию desmin и MHC после 4 дней инкубации в DM (Fig. 4). Более того, иммунофлюоресцентный анализ четко демонстрирует отсутствие слияния миобластов и образования мышечных трубочек в этих клетках (Fig. 4A). В противоположность контрольным клеткам трансфицированные клетки по-прежнему оставались моноядерными без признаков выстраивания миобластов или образования мышечных трубочек. И после 8 дней культивирования в DM не обнаружено признаков слияния.
Transitin Knockdown Maintains QM7 cells in a Muscle Progenitor Cell State
Экспрессия миогенных регуляторных факторов является обязательным условием спецификации и образования скелетных мышц. Чтобы выяснить, где transitin необходим, мы изучали эффект замалчивания transitin на экспрессию MyoD и myogenin с помощью RT-PCR. мРНК MyoD обнаруживалась во всех типах клеток, поддерживаемых или на GM (Day 0) или DM в течение 4-х дней. Экспрессия myogenin и desmin также индуцировалась в QM7- или контрольных-трансфицированных клетках, поддерживаемых на DM. Однако мРНК myogenin и desmin были лишь едва обнаружимы в трансфицированных клеточных линиях siTnl и siTn2 . Кроме того, transitin siRNA клетки на среде DM обнаруживали более высокие уровни мРНК и белка Pax7. Следовательно, QM7 миобласты с низкой экспрессией transitin обнаруживали фенотип клеток мышечных предшественников (Pax7+/MyoD+/ myogenin-/desmin-, указывая тем самым, что транзитин действует ниже MyoD и выше myogenin во время миогенной прогрессии, т.е. перед тем как миобласты выйдут из клеточного цикла и сольются в мышечные трубочки. В данном случае, хотя инкорпорация BrdU всеми клеточными линиями была сравнимой спустя 4 дня после инкубации в GM (между 55 и 75%), она была достоверно снижена у родительских и контрольных клеток после 4-х дней инкубации в среде DM по сравнению с transitin siRNA клетками (Fig. 6). Следовательно, transitin обычно участвует в выходе из клеточного цикла миобластов.
Сайт создан в системе
uCoz