Посещений:
ФОРМИРОВАНИЕ НЕРВНЫХ СЕТЕЙ

Регуляция Ведения Аксонов и Синаптогенеза

Understanding neuronal connectivity through the post-transcriptional toolkit
Carlos M. Loya, David Van Vactor and Tudor A. Fulga
doi: 10.1101/gad.1907710 Genes & Dev. 2010. 24: 625-635

Post-transcriptional regulatory mechanisms have emerged as a critical component underlying the diversification and spatiotemporal control of the proteome during the establishment of precise neuronal connectivity. These mechanisms have been shown to be important for virtually all stages of assembling a neural network, from neurite guidance, branching, and growth to synapse morphogenesis and function. From the moment a gene is transcribed, it undergoes a series of post-transcriptional regulatory modifications in the nucleus and cytoplasm until its final deployment as a functional protein. Initially, a message is subjected to extensive structural regulation through alternative splicing, which is capable of greatly expanding the protein repertoire by generating, in some cases, thousands of functionally distinct isoforms from a single gene locus. Then, RNA packaging into neuronal transport granules and recognition by RNA-binding proteins and/or microRNAs is capable of restricting protein synthesis to selective locations and under specific input conditions. This ability of the post-transcriptional apparatus to expand the informational content of a cell and control the deployment of proteins in both spatial and temporal dimensions is a feature well adapted for the extreme morphological properties of neural cells. In this review, we describe recent advances in understanding how post-transcriptional regulatory mechanisms refine the proteomic complexity required for the assembly of intricate and specific neural networks.


Рис.1.  | Complexity of neuronal morphology and post-transcriptional regulation.


Рис.2.  | Roles of AS in neuronal connectivity.


Рис.3.  | RNA transport and local translation.


Рис.4.  | miRNA regulation of neuronal connectivity.

Формирование правильных нейрональных коммуникаций во время развития нервной сети является существенным для высшего порядка познавательного и моторного поведения. Нейроны характеризуются монументальной целью наведения аксонов и дендритов на соотв. места мишени и затем собственно запускается и осуществляется образование специфических синапсов. Лучшей иллюстрацией подобной задачи является головной мозг человека, состоящий из 1012 нейронов, который образует ~1015 соединений (Williams and Herrup 1988). Такой устрашающий уровень сложности подвиг Roger Sperry предположить в средине 20th столетия (Sperry 1963), что проекции нейронов д. обладать химическими "метками" для специфического наведения нейритов (т.e., аксонов или дендритов) на их финальные места предназначения и способствовать дифференцировке, морфогенезу и функции синапсов. Это предполагает потребность возможно в биллионах химически различных нейрональных веточках и синаптических сайтах. Однако, принимая во внимание, что наш геном состоит только из 3 ? 104 генов, то это предполагает умножение геномной информации, ответственной за эту ошеломляющую сложность. Интересно, что исследования наведения аксонов и синаптогенеза показали, что существуют общие и относительно небольшие количества сигнальных факторов и путей, таких как Netrins, Ephrins, Wnts и BMPs, участвующих в этом онтогенетическом континууме становления нейрональной коммуникабельности (Karlstrom et al. 1997; Garbe and Bashaw 2004; Keshishian and Kim 2004; Speese and Budnik 2007; Manitt et al. 2009). Т.о., можно предположить, что с точки зрения молекулярных перспектив, коммуникабельность управляется с помощью центрального набора инструментальных средств, который ограничен в размере. Этот инструментарий используется посредством специфичных для типа клеток транскрипционных кодов и комбинаций сигнальных факторов. Поскольку градированная и комбинаторная экспрессия множественных сигналов и рецепторов может увеличивать способность этого ограниченного репертуара (Flanagan and Vanderhaeghen 1998; Flanagan 2006), проведенные исследования выявили, что природа обладает также расширенным информационным содержимым как в пространственном, так и временном измерениях благодаря внесению слоёв регуляции между первичным транскриптом и его экспрессией в качестве функционального белка.

Proteome diversification through post-transcriptional regulation


Недавние исследования показали, что альтернативный сплайсинг (AS) предшественников мРНК (pre-mRNA), транспорт мРНК и microRNA (miRNA)-обеспечиваемая репрессия трансляции формируют фундаментальный регуляторный аппарат, используемый для очистки и диверсификации протеома во время развития нервной системы (Lipscombe 2005; Bramham et al. 2007; Bushati and Cohen 2007).
AS является механизмом, способным к генерации буквально тысяч функционально отличающихся белков с единственного генного локуса. Эта диверсификация репертуара функционального белка, как известно, играет критическую роль почти на каждой стадии формирования нейрональной коммуникабельности от наведения аксонов до дифференцировки и функции синапсов (Craig and Kang 2007; Li et al.2007; Hattori et al. 2008).
Выработка сложных нейрональных морфологий нуждается в точной регулировке использования белков в разных клеточных компартментах на разных стадиях развития. Принимая во внимание, что в некоторых нейронах расстояние между телом и терминальными нейритными структурами могут быть порядка метра, ростовые конусы и синапсы д. использовать механизмы, которые быстро реагируют на локальные стимулы благодаря избирательному помещению мРНК в места действия (Fig. 1). Это делает возможным, чтобы трансляция происходила независимо от тела клетки в соответствующем месте и в соотв. время. Лежащие в основе механизмы, управляющие этим процессом, участвуют в упаковке мРНК в рибонуклеопротеиновые (RNP) транспортные гранулы в ядре, которые позднее экспортируются в цитозоль и избирательно доставляются в дистальный сайты нейронов зависимым от микротрубочек и кинезина способом (Fig. 1; Kiebler and Bassell 2006). Во время транспорта трансляция мРНК обратимо ингибируется с помощью RNA-binding proteins (RBPs) и/или miRNAs благодаря специфическим распознающим последовательностям в untranslated regions (UTRs) мРНК. Как RBP- так и miRNA-обеспечиваемая репрессия трансляции возникают как важные пост-транскрипционные механизмы, способные моделировать уровни белка в зависимости от пространственной и временной специфичности во время формирования паттерна и роста нейрональных соединений (Ule and Darnell 2006; Schratt 2009).

AS


Большинство эукариотических генов состоит из множественных кодирующих последовательностей (экзонов), разделенных некодирующими регионами (интронами). После транскрипции экзоны в pre-mRNAs подвергаются сплайсингу, чтобы сформировать зрелые мРНК транскрипты (Fig. 2A). Во время развития нервной системы альтернативный сплайсинг pre-mRNA драматически увеличивает разнообразие протеома за счет избирательной селекции включения или исключения экзонов данной мРНК (Fig. 2A; Lipscombe 2005; Li et al. 2007); обзор о сплайсинге см. Nilsen and Graveley (2010). Недавние исследования с использованием exon-exon соединений (Johnson et al. 2003) и геномных массивов экзонов (Clark et al. 2007) или высоко производительного секвенирования (Wang et al. 2008) показали, что ~74%-94% мультиэкзонных генов человека подвергаются альтернативному сплайсингу, подчеркивая роль AS в расширении молекулярной базы данных клетки. Более того, транскрипты, экспрессирующиеся во время развития нервной системы, в 28% демонстрируют тканеспецифический AS (Johnson et al. 2009).

AS regulates neural patterning and specificity


Важный пример потенциала AS , вызывающего разнообразие молекулярных характеристик клеток и обеспечение нейральных связей, получен в исследованиях на Drosophila локусе Dscam1 (Down Syndrom cell adhesion molecule) (Zipursky et al. 2006; Hattori et al. 2008; Schmucker and Chen 2009). Dscam1 AS обладает потенциалом генерировать 19,008 изоформ с разными эктодоменовыми структурами, которые обладают изысканной гомофильной связывающей специфичностью (Fig. 2B). Это разнообразие, как было установлено, обеспечивает гомофильное отталкивание между веточками и является критическим для организации нервной системы (Schmucker et al. 2000; Zhan et al. 2004; Hattori et al. 2007). В недавнем исследовании генерация мутантных мух посредством гомологичной рекомбинации, которая давала приют только 12, 24, 576, 1572 и 4752 потенциальным изоформам Dscam1 показали, что экспрессия тысяч вариантов Dscam1 необходима для само-отталкивания сестринских веточек и для соотв. формирования нейронального паттерна в трех разных классах нейронов (Fig. 2C-E; Hattori et al. 2009).
Хотя роль AS в функционировании Dscam не законсервирована у позвоночных, AS двух др. адгезивных молекул - neurexins (NRX) и neuroligins (NLs)-важен для пре- и пост-синаптической дифференцировки возбуждающих или ингибирующих синапсов у млекопитающих (Craig and Kang 2007). NRXs экспрессируют пресинаптически адгезивные белки с потенциалом генерировать около 1000 изоформ с двух альтернативных промоторов и пяти сайтов альтернативного сплайсинга (наз. S1-4). Их пост-синаптический партнер NL (NL1 и NL2) также может подвергаться обширному AS. NRXs и NLs обладают избирательной гетерофильной адгезией и разными способностями индуцировать дифференцировку возбуждающих и ингибирующих синапсов (Craig and Kang 2007). Исследования по избыточной экспрессии в культивируемых нейронах гиппокампа показали, что изоформы NL1B и NL1AB специфически связывают NRXβ4(-) вариант, чтобы избирательно индуцировать образование glutamatergic синапсов. С др. стороны, изоформы NL1A и NL2A связывают NRX1α4(-) и NRX1β4(+), чтобы запустить дифференцировку GABAergic синапсов (Boucard et al. 2005; Chih et al. 2006). Всестороннее исследование всех NL и NRX изоформ-специфических взаимодействий может позволить в дальнейшем выяснить AS-зависимую избирательность дифференцировки др. типов синапсов. Более того, механизм, с помощью которого специфические варианты рекрутируются на разные синапсы во время дифференцировки остается неизвестным.
В качестве примера роли, которую играет AS в наведении проекций нейронов может рассмотреть срединную линию позвоночных, где пересечение аксонов осуществляемое для достижения координации двух сторон тела, тонко регулируется с помощью законсервированных факторов ведения, таких как репреллент Slit (Dickson 2002). Анализ Robo3, гомолога Roundabout (Robo) семейства хеморецепторов, как известно, связывающего Slits, выявил его значение для инициального пересечения аксонами и последующей защиты от обратного пересечения вентральной срединной линии во время развития нервной системы эмбрионов кур (Chen et al. 2008). В этом исследовании, альтернативное сохранение интрона в Robo3 pre-mRNA порождает две изоформы: Robo3.1 и Robo 3.2. Первый, Robo3.1 экспрессируется дифференциально на проксимальной (ipsilateral) стороне комиссуральных аксонов, где он предупреждает преждевременное отталкивание от срединной линии путем противодействия чувствительности Robo1 и Robo2 к передаче сигналов Slit до её пересечения. Затем, Robo3.2 способствует отталкиванию от срединной линии как только ростовой конус окажется на дистальной (contralateral) стороне (Fig. 2F). Механизм, участвующий в дифференциальной экспрессии изоформ Robo3 пока неизвестен. Однако, мало вероятно, что используются транскрипционные часы для разной временной и пространственной экспрессии вариантов Robo3, поскольку RT-PCR анализ показал, что оба экспрессируются постоянно в течение всего промежутка времени развития. Следовательно, регуляция д. обеспечивать транспорт и локальную трансляцию мРНК или пост-трансляционный контроль, используя избирательный перенос (или деградацию) изоформ Robo3 из проксимального и дистального сегментов аксона (Black and Zipursky 2008; Chen et al. 2008).
Поскольку примеры, приведенные выше подчеркивают важность альтернативного сплайсинга мРНК в коммуникабельности нейронов, роль регуляции AS, выполняемой в этом процессе, остается до некоторой степени неизвестной. В нервной системе паттерны онтогенетического сплайсинга регулируются с помощью разнообразных наборов RBPs, таких как Tra2β, neuronal polypyrimidine tract-binding protein (nPTB), embryonic lethal-abnormal vision (ELAV), Feminizing gene on X (FOX) и neuron-oncological ventral proteins (Nova), среди прочих (Li et al. 2007). Эти нейрональные регуляторы AS, как было установлено, модулируют AS паттерны рецепторов нейротрансмиттеров, ионных каналов, компонентов пост-синаптических уплотнений и нейрональных сигнальных молекул (Li et aL. 2007). Напр., недавно было показано, что Nova, нейрон-специфический регулятор AS, является критическим для образования и физиологии нейромышечных соединений (NMJ) с помощью опосредования AS agrin (Ruggiu et al. 2009), производного нервов фактора дифференцировки в NMJs млекопитающих с привлечением образования кластеров acetylcholine receptor (AChR) (Sanes et al. 1998). Nova1 и Nova2 нокаутные (NovaKO) мыши оказывались парализованными и обнаруживали аномальное образование кластеров AChR и аномальную синаптическую трансмиссию. Интересно, что даже в этом исследовании продемонстрировано, что генерация нейрон-специфической изоформы agrin Z(+), с помощью Nova1/2, существенна для сборки AChR и синаптической возбудимости, NovaKO мыши, экспрессирующие agrin Z(+) остаются парализованными. Это указывает на то, что существует agrin (Z+)-независимая регуляция функции моторных нейронов с помощью Nova (Ruggiu et al. 2009). Учитывая современное состояние понимания регуляторов AS, было бы интересно исследовать факторы сплайсинга и механизмы, участвующие в AS Dscam1 и Robo3, а также NRXs и NLs.

mRNA transport and local translation


С точки зрения классической центральной догмы мРНК экспортируется в цитозоль, затем транслируется с помощью полирибосом в теле клетки, а de novo белки транспортируются в соотв. места действия. Во время развития нервной системы ростовые конусы и синапсы нуждаются в быстрых изменениях своих молекулярных профилей, чтобы реагировать локально на динамическую внеклеточную среду и, в свою очередь, принимают решения относительно своей навигации, морфологии и функции - часто в течение минут (Campbell and Holt 2001; Piper et al. 2006; Sutton and Schuman 2006). Некоторые молекулярные модели могут объяснить подобные клеточные реакции: (1) Проникновение в дистальные сайты нейритов (т.e., ростовые конусы или синапсы) может приводить к индукции механизма обратной связи в теле и приводить к транскрипции и трансляции, затем к избирательной доставке белков в инициальный сайт ввода (input) так, как в случае синаптического "tagging" в гиппокампе крыс и Aplysia сенсорных нейронах (Martin and Kosik 2002). (2) Факторы, необходимые для сборки circuit, могут экспрессироваться постоянно и присутствовать в обратимо неактивном состоянии во всей клетке и могут быть активированы с помощью пост-трансляционных модификаций, таких как фосфорилирование (Lisman and Zhabotinsky 2001). (3) мРНК может доставляться избирательно в субклеточные сайты действия в нейритах, в обратимо ингибированном состоянии и запускать локальный синтез белка в ответ на индукцию. В принципе, индукция транскрипционных изменений (модель 1) ответственна за долговременные стабилизирующие эффекты, тогда как обратимая локальная активация белков (модель 2) как и транспорт мРНК и локальная трансляция (модель 3) скорее всего участвуют в наиболее непосредственных реакциях на соседние внешние стимулы. В дополнение к преимуществам субклеточной локализации и трансляции мРНК является то, что один транскрипт может обеспечить несколько раундов трансляции, снижая энергетические затраты по независимой доставке белка (Jansen 2001; Martin and Ephrussi 2009). Более того, локальная трансляция обладает преимуществом присутствия исходно устраненных пост-трансляционных модификаций, которые могут нарушать функцию и/или стабильность белка. Напр., полимеризация актина на ростовом конусе и синапсах является критической для его реакции на внеклеточные стимулы (Okamoto et al. 2004; Leung et al. 2006). Следовательно, модификации β-actin, такие как argynilation и glutathionylation могут возможно влиять на его динамику полимеризации, поэтому необходим пул исходного (naive) актина, чтобы способствовать локальному образованию филамент (Wang et al. 2001; Karakozova et al. 2006; Lin and Holt 2007). Интересно, что в недавнем исследовании с использованием техники гибридизации высокого разрешения, было установлено, что 71% мРНК, экспрессирующихся во время эмбриогенеза Drosophila имеют разные субклеточные локализации (Lecuyer et al. 2007). Сходным образом анализ микромассивов РНК, выделенных из отростков гиппокампа, идентифицировал большое количество мРНК, кодирующих компоненты трансляционного аппарата, цитоскелета, клеточной адгезии и пост-синаптического аппарата (Poon et al. 2006; Zhong et al. 2006). Эти исследования показали, что поскольку разные молекулярные модели могут быть задействованы на разных временных стадиях образования нейрональных коммуникаций, то доставка мРНК и локальная трансляция скорее всего играют выдающуюся роль в сборке сети.
Кстати, наше понимание механизмов, лежащих в основе локализации и функции мРНК получено в исследованиях трех типов гранул РНК: нейрональных транспортных RNPs, processing bodies (P-bodies) и стрессовых гранул (Kiebler and Bassell 2006; Bramham et al. 2007). Нейрональные транспортные RNPs являются основным устройством, участвующим в транслокации мРНК во время нейрального развития, тогда как P-тела и стрессовые гранулы обеспечивают репрессию трансляции, деградацию и/или хранение мРНК в разных физиологических условиях. лучше всего изученные молекулы присутствуют в нейрональных транспортных RNPs они представлены zipcode-binding protein 1 (ZBP1), fragile X mental retardation protein (FMRP), cytoplasmic polyadenylation element-binding protein (CPEB), staufen, survival of motor neuron (SMN), hnRNPA2 и purine-rich element-binding protein-? (Pur?) (Kiebler and Bassell 2006).

ZBPs


ZBP1 является RBP, идентифицированному благоаря его способности распознавать "zipcode," цис-действующий элемент в β-actin 3'UTR необходимый для доставки β-actin мРНК на ведущий край фибробластов (Ross et al. 1997). Исследования нейронов эмбрионов кур показали, что ZBP1 также способствует локализации β-actin в развивающихся ростовых конусах и что его активность важна для роста нейритов, индуцированного neurotrophin (HL Zhang et al. 2001). Работна на нейронах Xenopus позднее показала, что ZBP1 обеспечивает асимметричную локализацию и трансляцию β-actin в ростовых конусах после обработки градиентами Netrin-1 и BDNF (Fig. 3A; Leung et al. 2006; Yao et al. 2006). Интересно, что brain-derived neurotrophic factor (BDNF) также способен асимметрически активировать Src (Yao et al. 2006), киназу, способную фосфорилировать ZBP1 и способствовать локальной трансляции β-actin и росту нейритов (Huttelmaier et al. 2005). Это указывает на то, что ZBP1-содержащие нейрональные транспортные RNPs не только участвуют в транспорте, но и также в обратимой трансляционной репрессии их грузов мРНК. Помимо их роли в наведении аксонов, ZBP1 локализуется в дендритных шипах (spines) нейронов гиппокампа и регулирует плотность и структуру синапсов посредством локализации и возможно локальной трансляции β-actin (Eom et al. 2003; Tiruchinapalli et al. 2003). ZBP1 также, как было установлено, связывает мРНК cofilin, актин-деполимеризующего фактора, и обеспечивает Slit2-индуцированную локальную трансляцию во время коллапса ростового конуса (Fig. 3A; Piper et al. 2006). Очевидно, что ZBP1 функционально транспортирует транскрипты иные, чем β-actin и cofilin. Поэтому было бы интересно идентифицировать др. потенциальные мишени для ZBP1 во время развития нервной системы.

FMRP


Мутации в гене FMR1 вызывают Fragile X syndrome (FXS), ведущий к наследственной умственной отсталости. FMR1 кодирует FMRP, RBP, содержащий два hnRNP-K гомологичных домена и arginine-glycine-glycine box (RGG) (Bassell and Warren 2008). В нейронах FMRP локализуется в аксонах и дендритах (Antar et al. 2006), и как было установлено, избирательно транспортирует мРНК цитоскелетных, синаптических и трансляционных регуляторных компонентов в дистальные части аксонов и синаптические сайты (Bassell and Warren 2008). У Drosophila и мышиных моделей для FXS, было показано, что FMRP является критическим для собственно морфогенеза синапсов (Nimchinsky et al. 2001; Pan et al. 2004). FMR1 нокаутные мыши обнаруживают поразительные дефекты в морфогенезе дендритных шипов (spine), характеризуются более плотными, более тонкими и более длинными пост-синаптическими шипами (Bassell and Warren 2008). Недавно было показано, что транспорт мРНК с помощью FMRP важен для развития морфологической пластичности (Dictenberg et al. 2008). В этом контексте, регуляция формирования синапсов использует FMRP-обеспечиваемую доставку мРНК в дендриты и репрессию трансляции цитоскелетных и сигнальных компонентов, таких как map1b, profilin и camkII (Fig. 3B; YQ Zhang et al. 2001; Reeve et al. 2005; Dictenberg et al. 2008). В дополнение к его роли в развитии синаптических контактов недавнее исследование также выявило роль FMRP в подвижности и наведении аксонов (Antar et al. 2006; Li et al. 2009). Было установлено, что нокаутные FMR1 в нейроны не обнаруживает чувствительности к индукции, зависимого от синтеза белка, коллапса ростового конуса с помощью сигнала наведения Semaphorin-3A (Sema3A). Также, Sema3A-индуцированная трансляция MAP1B в дистальных частях аксонов была тяжело редуцирована к FMR1 мутантных животных (Li et al. 2009), указывая тем самым, что FMRP регулирует или доставку мРНК или её локальную трансляцию.

Staufen


Staufen кодирует высоко консервативный dsRNA-связывающий белок. У Drosphila, Staufen хорошо известен как избирательно локализующий bicoid и oskar мРНК в ооцитах и prospero мРНК в эмбриональных нейробластах. Позвоночные экспрессируют две изоформы: Staufen1 и Staufen2 (Stau1 и Stau2) (St Johnston 2005). Обе изоформы Stau располагаются в дендритных сайтах нейронов гиппокампа (Kiebler et al. 1999; Tang et al. 2001) и участвуют в трансляционном контроле в дистальных синаптических сайтах. В двух исследованиях было обнаружено, что Stau1 и Stau2-истощенные нейроны гиппокампа обнаруживают тяжелый дефицит в морфологии, размере и плотности дендритных шипов (Goetze et al. 2006; Vessey et al. 2008). Истощение по Stau1 и Stau2, как было установлено, существенно редуцирует как β-actin мРНК-содержащие RNPs, так и β-actin мРНК в дендритных сайтах, указывая тем самым, что Staufen регулирует цитоскелет дендритов. Учитывая, что локальное увеличение филаментозного актина (F-actin) необходимо для индуцируемого активностью увеличения и потенциации дендритных шипов (Okamoto et al. 2004; Honkura et al. 2008), было бы интересно установить, участвует ли Staufen-обеспечиваемая доставка β-actin мРНК в этом процессе. В дополнение к этой его поздней функции в синапсах, Staufen может также играть роль на более ранних стадиях во время наведения нейритов. Принимая во внимание, что это было найдено в аксональных отростках и колокализуется с RhoA мРНК в ростовых конусах (Wu et al. 2005), может существовать интригующая возможность, что Staufen регулирует доставку и/или локальную трансляцию RhoA мРНК во время Sema3A-индуцированного коллапса ростового конуса.

CPEB


CPEB является RBP, участвующим в доставке и зависимой от активности трансляции мРНК в аксональных и дендритных сайтах. Drosphila имеет два паралога CPEB (orb и orb2), тогда как позвоночные обычно экспрессируют 4 (CPEB1-4) (Richter and Klann 2009). Модуляция белкового синтеза с помощью CPEB1 (также наз. CPEB) осуществляется посредством ингибирования трансляции мРНК, содержащей CPE последовательность. Эта репрессия трансляции облегчается как только CPEB фосфорилируется с помощью киназы Aurora или CaMKII (Ule and Darnell 2006). Это первое доказательство, что CPEB участвует в формировании паттерна нервной системы, оно получено в исследовании комиссуральных аксонов в спинном мозге курю В этом исследовании CPEB, как было установлено, присутствует в ростовом конусе и участвует в обеспечении локальной трансляции рецептора наведения EphA2 после пересечения аксонами срединной линии (Brittis et al. 2002).
Сравнительно недавно CPEB, как было установлено, оказывается также критическим для регуляции морфогенеза синапсов. Используя мутантов, у которых нарушен CPEB-обеспечиваемый транспорт мРНК и синтез белка, или фосфорилирование с помощью киназы Aurora и CamKII, исследователи установили, что CPEB является критическим для роста дендритов Xenopus tectal нейронов (Bestman and Cline 2008), а также размеров и плотности дендритных шипов в клетках Пуркинье (Mcevoy et al. 2007). Насколько многое известно о важности CPEB в регуляции нейрональных схем (circuitry), настолько мало идентифицировано функциональных мишеней. Интересно, что нейрон специфический актин в Aplysia, как известно, содержит CPEs в своем 3'UTR и не только колокализуется с CPEB, но и также становится полиаденилированным зависимым от активности способом (Liu and Schwartz 2003).
Известно, что недавние исследования показали, что nonsense-mediated decay (NMD) также участвует в регуляции экспрессии и локализации белков в синапсах (rev. NMD, см. Stalder and Muhlemann 2008; Rebbapragada and Lykke-Anderson 2009). Напр., exon junction complex (EJC) фактор eIF4AIII регулирует локализованный на дендритах белок Arc (activity-regulated cytoskeleton associated), чтобы модулировать доступность glutamate рецепторов во время синаптической пластичности (Giorgi et al. 2007). Принимая во внимание, что многие транскрипты биоинформационно предсказуемы как натуральные мишени для NMD (Giorgi et al. 2007), было бы интересно исследовать роль этого механизма во время формирования паттерна аксонов и образования синапсов.

miRNA


miRNA machinery and neuronal development


miRNAs короткие ~20- 24-nucleotide (nt) некодирующие РНК, играющие важную жизненную роль в развитии, физиологии и болезнях нервной системы (Bushati and Cohen 2007). miRNAs регулируют экспрессию генов путем комплементарного связывания с мРНК мишенью, наиболее заметно с их 3'UTR, и способствуя нестабильности РНК и/или ингибированию эффективного белкового синтеза (Eulalio et al. 2008). Короче, биогенез miRNA стартует в ядре, где RNase III endonuclease Drosha и её партнер по связыванию pasha/DGRC8 катализируют первое расщепление первичного транскрипта miRNA. Затем цитоплазматическая RNase III Dicer генерирует дуплексы ~20- 24-nt, которые затем загружаются на RNA-induced silencing complex (RISC) для распознавания и супрессии мРНК (Fig. 4A; Du and Zamore 2005). Исследования с использованием материнских-зиготических или условных мутаций Dicer выявили крупные морфологические дефекты в развитии нервной системы (Giraldez et al. 2005; Cuellar et al. 2008; Davis et al. 2008). Затем тканеспецифическое ингибирование пути miRNA, а также истощение индивидуальных miRNAs продемонстрировали с чрезвычайной чёткостью важность miRNA в формировании паттерна нейрональных сетей. В частности, недавние технологии с использованием высокопроизводительного секвенирования РНК, выделенной с помощью иммунопреципитации (HITS-CLIP), в комбинации с биоинформатикой, позволили создать детальную карту функциональных мРНК-miRNA взаимодействий, которые без сомнения расширили наше понимание регуляции с помощью miRNA развития нервной системы (Chi et al. 2009).

Недавнее исследование с использованием MARCM-based передового генетического скрининга на Drosophila идентифицировало белки процессинга miRNA pasha/DGRC8 и Dicer1 в качестве критических компонентов в становлении специфичности нервных связей (Berdnik et al. 2008). Обонятельная система мух характеризуется высоко стереотипированными нейрональными соединениями. Каждый проекционный нейрон (PN) находит дендриты специфических гломерул в антенной доле и стереотипически посылает аксоны в высшие центры головного мозга, такие как латеральные рога (LH) посредством mushroom body calyx (MBC). Анализ постмитотических одно- и многоклеточных MARCM клонов с помощью гомозиготных мутаций pasha и dicer1 выявил резкое сокращение плотности дендритов в большинстве гломерул, а также существенное неправильное нахождение мишеней проекционными нейронами дендритов из соответствующим им гломерул (Fig. 4B-D; Berdnik et al. 2008). Кроме того, pasha и dicer1 мутанты обладали пониженным ростом и морфологическими аномалиями окончаний аксонов PN как в MBCs, так и LHs. Это исследование предоставляет первое убедительное доказательство, что путь miRNA необходим для организации аккуратных нервных сетей. Те не менее специфические miRNA, ответственные за этот процесс ещё предстоит идентифицировать.

Understanding miRNA regulation of synaptic connectivity


Взаимодействия между miRNA и их мишенями часто классифицируются как "switch," "tuning" или "neutral" (Bartel and Chen 2004; Flynt and Lai 2008). "Переключающее" взаимодействие характеризуется тем, что miRNA редуцирует активность белка мишени до едва заметного уровня. Оно отличается от "настраивающих" взаимодействий, которые ведут к тонкой модуляции уровней белков мишеней до оптимального уровня для данного физиологического и/или онтогенетического состояния. "Нейтральные" мишени являются обычно видо-специфичными взаимодействиями, которые не оказывают ни позитивного, ни негативного эффекта на клетку. Анализ формирования дендритов и синапсов выявил, что механизмы как miRNA "tuning" , так и "switching" участвуют в регуляции собственно синаптических соединений.
Во время развития нейронов увеличивается сложность дендритного древа, важного детерминанта количества. размеров и функции синапсов. Временная деполяризация или воздействие neurotrophins, способствует морфогенезу этого дендритного древа (Wong and Ghosh 2002; Matsuzaki et al. 2004). Недавние исследования выявили, что нейроны, обогащенные miR-132 и miR-134, обнаруживают активностью регулируемые быстрые реакционные изменения в усовершенствовании дендритов (Vo et al. 2005; Wayman et al. 2008; Fiore et al. 2009). Напр., зависимое от активности снижение из Rho семейства GTPase-активирующего белка p250GAP с помощью miR-132 , как было установлено, ответственно за наблюдаемое увеличение сложности дендритного древа в нейронах гиппокампа (Wayman et al. 2008). Сходным образом, miR-134 регулирует pumilio2, RBP, участвующий в транспорте мРНК и ингибировании трансляции, чтобы обеспечить зависимую от активности пластичность дендритного древа (Fiore et al. 2009). Хотя аналогичные по фенотипическому исходу взаимодействия miRNA-мишень между miR-132-p250GAP и miR-134-pumilio2 сильно отличаются. Напр., с помощью miR-132 активации или ингибирования p250GAP было достаточно, чтобы воспроизвести вызываемое активностью увеличение роста дендритов (Wayman et al. 2008), указывая тем самым, что miR-132 действует как регуляторный "переключатель" и выключает p250GAP в ответ на индукцию нейрональной активности. Напротив, ни избыточная экспрессия miR-134, ни siRNA-обусловленное ингибирование pumilio2 в присутствии или отсутствии активностью индуцируемых стимулов не было способно увеличивать сложность дендритов (Fiore et al. 2009). Это указывает на то, что "настройка" pumilio2 с помощью miR-134 необходима для зависимого от активности роста веточек.
Кроме того, будучи вовлечены выработку веточек нейритов, miRNA, как было установлено, играет прирожденную роль в развитии дендритных шипов. В плодотворном исследовании, miR-134 была идентифицирована как spine-enriched негативный регулятор размеров дендритных шипов посредством компартментализованной "настройки" Limk1, регулятора динамики актиновых филамент (Schratt et al. 2006). Репрессия трансляции Limk1 уменьшалась воздействием нейротрофина BDNF, это подчеркивает функциональное разнообразие, которое miRNA вносит в нервную сеть путем регуляции синтеза de novo белка зависимого от активности и пространственно ограниченным способом. Дальнейший анализ синапсы обогащающих miRNA выявил др. критический регулятор структуры шипов (Siegel et al. 2009). Ингибирование miR-138 выявило достоверное увеличение объема дендритных шипов, тогда как избыточная экспрессия miR-138 вызывало резкое уменьшение. Было установлено, что miR-138 регулирует образование синапсов, модулируя уровни acyl protein thioesterase 1 (APT1), энзима, как известно, depalmitoylate белки, локализованные в синапсах, включая α13 субъединицы G proteins (Gα13). В частности избыточная экспрессия Gα13 оказалась способной восстанавливать, способствующие росту, эффекты ингибирования miR-138. Принимая во внимание, что рекрутирование Gα13 на мембрану активирует сигнальный путь RhoA, то это указывает, что spine-shrinking способность miR-138 обусловлена Rho-обеспечиваемой регуляцией актинового цитоскелета (Schratt 2009). Эти исследования выявили лежащую в основе склонность специфического использования дендритными шипами miRNA, чтобы локально регулировать морфологию и функцию с помощью точной модуляции динамики актинового цитоскелета.
Дальнейшие доказательства подтвердили, что miRNA контролирует морфогенез синапсов посредством регуляции актинового скелета в исследованиях Drosophila NMJ. Используя новую технологию ткане-специфического молчания, было показано, что miR-8 строго способствует росту NMJ, путем модулирования уровня белка Enabled (Ena), регулятора динамики актина исключительно в пост-синаптических пространствах, несмотря на заметную экспрессию miR-8 и Ena на обеих сторонах синапсов (Loya et al. 2009). Это иллюстрирует как miRNA может действовать ткане-специфически, чтобы регулировать развитие синапсов даже, когда экспрессируется поперек синаптических компартментов. Дополнительные исследования на Drosophila NMJ показали. что Let-7 участвует в регуляции созревания и роста синапсов (Caygill and Johnston 2008; Sokol et al. 2008) путем нахождения abrubt (ab), ядерного белка, известного своей функцией по NMJ таргетингу и ветвлению дендритов (Caygill and Johnston 2008). Помимо регуляции морфологии и созревания NMJ, miRNA, как было установлено, также контролирует физиологическую архитектуру синапсов путем модулирования обилия и доступности уровней glutamate рецептора (GluR) в пост-синаптических сайтах (Karr et al. 2009).
Передача сигналов пре- и постсинаптическими мембранами существенна для координации морфогенеза, роста и функции синапсов, чтобы сопоставить пресинаптический вклад с необходимыми постсинаптическим результатом (Keshishian and Kim 2004). В элегантном исследовании NMJs червей, специфическая для мышц miR-1, как было установлено, регулирует постсинаптическую чувствительность путем непосредственного нахождения субъединиц nicotinic AChR (nAChR) и пресинаптического высвобождения ACh, благодаря MEF2-зависимому ретроградному сигналу, обеспечиваемому с помощью белка синаптических пузырьков RAB-3 (Simon et al. 2008). Острая активация nAChRs была способна индуцировать эту MEF2-зависимую ретроградную реакцию, указывая тем самым, что miR-1 действует тонко настраивая синаптическую передачу путем купирования изменений в постсинаптической активности с помощью модуляции пресинаптической функции. Дальнейшие доказательства действия miRNA в качестве регуляторных узлов транс-синаптической регуляции получены в недавнем исследовании обмеров дендритов сенсорных нейронов Drosphila (Parrish et al. 2009). После соотв. нахождения и покрытия рецептивных полей аксональные и дендритные разветвления нуждаются в увеличении размеров пропорционально лежащему под ними субстрату, чтобы гарантировать соотв. образование и покрытие синаптическими связями по ходу роста животного; этот феномен известен как scaling (оценка) дендритов. Анализ scaling роста в Drosophila периферической нервной системе (PNS), показал, что miRNA bantam регулирует сигналы, ингибирующие рост, в периферических сенсорных нейронах от лежащего поверх эпителия (Parrish et al. 2009). Это исследование продемонстрировало четко, что bantam действует неавтономно в эпителиальных клетках путем репрессии сигнала роста Akt в сенсорных нейронах PNS и гарантирует соотв. экспансию нейритов во время роста животных (Parrish et al. 2009).
Хотя наши знания роли miRNAs в развитии синапсов быстро растут, наше понимание важности индивидуальных miRNAs в ведении аксонов всё ещё допольно примитивны. Кстати, мы знаем, что нейрон-специфичная miR-338 локально регулирует уровни белка cytochrome c oxidase IV (COXIV) в аксонах симпатических нейронов и соотв. контролирует продукцию энергии во время развития нейронов (Aschrafi et al. 2008). Однако способно ли воздействие на сигналы наведения локально регулировать уровни белков в ростовом конусе и управлять его навигацией miRNA-зависимым способом является предметом будущих исследований.

Conclusion


In summary, the diversity and specificity of neuronal connectivity is regulated extensively by a post-transcriptional toolkit composed of AS, the RNA transport machinery, and miRNAs. AS has shown how a single gene locus can give rise to a wide range of proteins with differential functional and structural properties that work in concert to enable growth cones to respond to intermediate targets, stereotype neuritic branch patterns, and differentiate synaptic connections. However, the mechanism regulating the inclusion or exclusion of certain isoforms in a given cell type or developmental time, as well as the mechanisms involved in transporting these specific variants to their sites of action, remain largely unknown.
Studies on neuronal transport RNPs have identified a series of well-conserved RBPs that recognize specific pools of мРНК and regulate their selective subcellular localization and local translation. It bears pointing out that most of the work described here was performed in primary tissue culture systems. Thus, new technologies able to visualize local protein synthesis (Leung and Holt 2008; Wang et al. 2009) in vivo will enable a more direct analysis of the role мРНК transport and localization play in nervous system development.
miRNA-mediated silencing has emerged as a highly versatile post-transcriptional mechanism able to modulate neuronal connectivity by acting as either a regulatory “switch” or “rheostat” of gene expression. It is interesting to note that both neuronal RNPs and miRNA pathways converge substantially on the direct regulation of cytoskeletal dynamics during growth cone navigation and/or development of synaptic structure and function, alluding to a multilevel regulatory mechanism. Recent biochemical and genetic studies have implied that components of the neuronal transport granule, like FMRP and Staufen, interact with elements of the miRNA pathway such as Argonaute and Dicer proteins (Caudy et al. 2002; Ishizuka et al. 2002; Jin et al. 2004; Barbee et al. 2006). However, future studies are necessary to directly assess the role of the neuronal transport granule and the function of specific miRNA during nervous system development. Conversely, during neuronal differentiation, miR-124 has been shown to target PTB protein 1/2 (PTBP1/2), and regulate the switch between nonneuronal and neuronal AS (Makeyev and Maniatis 2008). Hence, a greater understanding of how this post-transcriptional toolkit interacts with each other to assemble neural networks is an exciting new frontier for neurobiology.
Сайт создан в системе uCoz