Как аксоны перемещаются в своем окружении во время развития нервной системы, ростовой конус на их кончике распознает сигналы от множества сигналов наведения с помощью осуществления динамической перестройки актинового цитоскелета. Rho подсемейство малых GTPases-Rho, Rac и Cdc42-является критическим для подобной модуляции актинового цитоскелета (Hall. 1992, 1998; Tapon and Hall, 1997). Разные Rho GTPases, как полагают, действуют на разного типа актиновые структуры. Напр., Rho стимулирует образование фокальных адгезий и стрессовых волокон (Ridley and Hall, 1992), Rac способствует ламеллиподиальным структурам (Ridley et al., 1992), а Cdc42 активирует филоподии (Nobes and Hall, 1995).

Среди Rho GTPases Rac наиболее загадочна. Активация Rac обусловливает многие эффекты на морфологию клетки, клеточную полярность и миграцию клеток (Etienne-Manneville and Hall. 2002; Jaffe and Hail. 2005). В частности, в ростовом конусе Rac играет важные роли для роста, ветвления и ведения аксонов (Luo, 2000b; Guan and Rao, 2003). У Drosophila, Rac мутантные эмбрионы обнаруживают тяжелые нарушения роста аксонов как в ЦНС, так и в ПНС (Hakeda-Suzuki et al., 2002). Очень большие количества молекул были идентифицированы в качестве партнеров по спариванию Rac и не совсем ясно, какие среди них являются ключевыми эффекторами для перестройки актина в определенных контекстах (Bishop and Hall, 2000; Luo, 2000a).

Разнообразные сигналы наведения аксонов действуют посредством Rac GTPases (Tapon and Hall, 1997: Luo, 2000b ). Напр., у C. elegans, Rac действует ниже UNC-40, Netrin рецептора (Gitai etal., 2003). Отталкивание аксонов с помощью передачи сигналов Slit-Robo обеспечивается с помощью Rac , а ограничение функции Rac ограничивает также передачу сигналов Slit-Robo (Hakeda-Suzuki et al., 2002; Fan et al., 2003; Yang and Bashaw, 2006). Внутриклеточный домен Plexin B, рецептор semaphorin, соединяется с Rac-GTP и снижает активность Rac путем секвестрации его от его мишени Pak, приводя в результате к отталкиванию аксонов (Vikis et. al., 2000; Hu et al., 2001). Rac1 дефицитные мозжечковые гранулярные нейроны в первичной культуре обнаруживают пониженное фосфорилирование PAK1 и неправильную локализацию WAVE комплекса мембраны ростового конуса (Tahirovic etal.,2010).

Подобно др. GTPases, цикл Rac GTPases проходит между активным GTP-связанным состоянием и неактивным GDP-связанным состоянием Fig. 1H). Активность Rac контролируется с помощью трех основных классов регуляторных белков, guanine nucleotide exchange factors (GEFs), GTPase-activating proteins (GAPs) и guanine nucleotide dissociation inhibitors (GDIs). GEFs инициируют высвобождение GDP приводя к накоплению GTP-связанных активных GTPases (Rossman et. al" 2005). GAPs превращают активное состояние в неактивную GDP-связанную форму (Moon et al., 2003). GDIs соединяются с GDP-связанной формой, предупреждая высвобождение GDP и удерживая Rac в неактивном состоянии (Dovas and Couchman, 2005). Подавляющее количество GEFs (~60) и GAPs (~70) у млекопитающих (Etienne-Manneville and Hail, 2002) указывает на то, что каждый из этих белков скорее всего выполняет свою собственную специфическую роль в разных контекстах.

Среди множества Rac-специфических GEFs и GAPs, GEF Trio вообще-то наиболее охарактеризованные Rac регуляторы формирования паттерна аксонов. Trio обладает двумя тандемными Dbl-homology (DH-PH) GEF доменами. GEF1 является специфическим активатором Rac GTPase. Это было показано с помощью генетического эпистаза у Drosophila, т.к. Rac мутация блокировала доминантные эффекты экспрессии GEF1 домена в изоляции. Это было также показано с помощью прямых биохим. экспериментов, т.к. Trio GEF1 активирует Rac in vitro, но не Rho или Cdc42, как в отношении Drosophila Trio (Newsome et al., 2000) так и Trio млекопитающих (Bellauger et al., 1998). GEF1, как было установлено генетически, критически необходим для функционирования Trio в наведении фоторецепторных аксонов у Drosophila, частично, чтобы регулировать активность PAK киназы (Newsome et aL, 2000). Домен GEF2 у Trio, напротив, является специфическим активатором Rho (Bellanger et al., 1998; Spencer et aL, 2001) и не нужен для наведения аксонов фоторецепторов в глазах мух (Newsome et al., 2000; Vanderzalm et al, 2009). Специфическая аксональная функциональная активность GEF1 была обнаружена также в C. elegans trio (UNC73; Vanderzalm et al., 2009), тогда как GEF2 регулировал мускулатуру глотки и вульвы, синаптическую нейротрансмиссию (Steven et al., 2005) и миграцию Р клеток (Spencer et al., 2001).

Роль Trio в ведении аксонов была связана с Abl тирозин киназой (Liebl et al., 2000). Мутанты Abl и Trio имеют сходные фенотипические отклонения наведения аксонов в отдельности, а в комбинации взаимодействовали синергически. Abl является одной из ключевых молекул, необходимых для нахождения пути аксонами (Wills et al., 2002: Forsthoefel et al., 2005; Song et al., 2008). Мнение, что активность Rac необходима для функции Abl также подтверждена и в др. контекстах (rev. Hernandez, 2004). Rac способствует активности онкогенных конституитивных активированных форм Abl, таких как p210Bcr-Abl и v-Abl в культурах клеток млекопитающих (Renshaw et al, 1996; Bassermann et al., 2002). Abl активирует Rac в сочетании с передачей сигналов рецепторной тирозин киназы частично за счет фосфорилирования Ras GEF Sos-1 (Sini et al., 2004) и также необходим для активации Rac после стимуляции cadherin-обусловленной межклеточной адгезии (Zandy et al., 2007).

Ранее мы показали, что Abl и Trio участвуют в неканонической функции рецептора Notch в нахождении пути аксонами у Drosophila (Giniger, 1998; Crowner et al., 2003). В противоположность обычному механизму передачи сигналов Notch функция Notch во время наведения аксонов не нуждается в канонических молекулярных событиях ядерной транслокации из внутриклеточного домена, чтобы контролировать экспрессию генов мишеней, обеспечиваемую транскрипционным фактором Su(H). Вместо этого, Notch представлен in vivo в мультибелковом комплексе вместе с Trio, а также с Disabled, др. стержневым компонентом передачи сигналов Abl, это продемонстрировано с помощью ко-иммунопреципитации Notch с Trio и Disabled белками в экстрактах Drosophila дикого типа (Le Gall et al., 2008; Song et aL 2010). Эта физическая ассоциация Notch с Trio и Disabled важна для Notch-зависимого контроля роста и наведения аксонов (Le Gall et al., 2008).

Базируясь на этих наблюдениях, мы исследовали потенциал участия малых Rho GTPases в некононической передаче сигналов Notch во время наведения аксонов у эмбрионов Drosophila. Мы впервые показали, что Rac-специфическая активность GEF1 в Trio избирательно необходима для Trio-зависимого ведения аксонов эмбриональных двигательных нервов и в частности для взаимодействия с Notch. Более того, мы показали избирательное генетическое взаимодействие Rac, а не Rho1 или Cdc42 с Notch, модифицирующее его аксональную функцию. Эти данные подтверждают гипотезу, что Rac является критическим игроком в Abl- и Trio-зависимом механизме, с помощью которого Notch контролирует рост и ведение аксонов.

Notch-зависимый паттерн наведения аксонов осуществляется посредством альтернативного, "неканонического" Notch сигнального пути, определяемого с помощью Abl тирозин киназы (Giniger, 1998). Notch белок ассоциирует in vivo с Abl кофакторами, Disabled и Trio, а генетические эксперименты указывают на то, что Notch противодействует активности сигнального пути Abl (Crowner et al.. 2003; I.e Gall et al., 2008). Мы установили, что Rac взаимодействует функционально с Notch тем же самым способом, как это делают стержневые Abl сигнальные белки. Снижение активности Rac супрессирует Notch аксональные фенотипы, точно также как это делают компоненты пути Abl или экспрессия Abl антагониста Enabled. Усиление активности Rac усиливает аксональные фенотипы Notch, так как это делает активация передачи сигналов Abl или мутация Enabled. Эти данные, следовательно, согласуются с гипотезой, предложенной нами ранее, что ключевая роль Notch в ведении intersegmental nerve b (ISNb) ограничивается Abl-зависимой адгезией ростовых конусов ISNb с путем нерва ISN (Crowner et al., 2003). Согласно этой модели, избыток Abl, Rac-зависимого субстрата адгезии у Notch мутантов предохраняет ростовые конусы ISNb от defasiculating от ISN, чтобы достичь мишени мышечного поля. Модуляция активности Rac прямо модифицирует эту адгезию, способствуя или препятствуя Notch-зависимому высвобождению ростового конуса от ISN пути в точке выбора. Эти наблюдения также согласуются с результатами модельных культурах клеток позвоночных, которые подтверждают критическую роль Rac в Abl-зависимой передаче сигналов и клеточной адгезии (Zandy et al., 2007; Zandy and Pendergast, 2008).

Биологическая функция Rac трудна для изучения in vivo. Во-первых, Rac осуществляет широкий круг функций во многих клетках, так что экспериментальные модуляции Rac часто вызывают сложные комбинации эффектов. Во-вторых, фенотипы, вызываемые избыточной экспрессией конституитивно активного Rac часто сходны с теми, что вызываются избыточной экспрессией доминантно-негативной формы скорее, чем оппозитной, позволяя чрезвычайно заманчивую интерпретацию экспериментальных манипуляций (Luo et al., 1994; Luo, 2000a). Напр., как увеличивая, так и снижая активность Rac, можно вызывать остановку ростовых конусов нейронов Drosophila. На молекулярном уровне это происходит по противоположным причинам: чрезвычайная активация Rac вызывает избыточную стабилизацию актиновых филамент, тогда как инактивация Rac чрезвычайно их дестабилизирует (Luo et al., 1994). Во всяком случае результатом является блокировка продвижения ростовых конусов. Эти свойства подвигли нас внести две технические модификации в наши эксперименты, которые оказались важными для получения четких выводов. Во-первых, мы использовали сенсибилизированный генетический фон, на котором одиночный молекулярный процесс ограничивался специфическим решением ведения аксона. Это минимизировало ошибки, обычно вносимые плейотропными функциями Rac. Мы достигли этого, используя точный температурный сдвиг для чувствительного к температуре аллеля Notch в синхронизированной популяции эмбрионов и используя поворот одиночного нерва, представленного 7 близко родственными аксонами в точной точке их траектории. Во-вторых, вместо использования серьезных манипуляций с уровнем или активностью Rac мы использовали более легкие манипуляции, мы смогли достичь и усреднить большое количество испытаний, чтобы определить количественную модуляцию промежуточного (гипоморфного) Notch фенотипа с помощью Rac. Рост и ведение аксонов базируется на динамике цикла актина. Крайние манипуляции приводят к риску остановки цикла в целом. Мы решили, что более легкие манипуляции позволят нам с большей чувствительностью выявить эффект определенной сигнальной молекулы на динамику цикла актина. Поэтому мы использовали гетерозиготные Rac мутации скорее, чем гомозиготные, чтобы исследовать генетические взаимодействия с Notch. Более того, когда экспрессировался доминантный Rac трансген, то мы искали GAL4 драйверы, которые экспрессируются на низком скорее. чем высоком уровне и не вызывают фенотипических отклонений собственно себя на генетическом фоне дикого типа. Эти пертурбации тем не мене достаточны, чтобы вызывать достоверные количественные эффекты на фенотип аксонов на сенсибилизированном фоне. Данные описанные здесь подтвердили, что Rac, действующий ниже Trio, является основным игроком в пути неканонической передачи сигналов, с помощью которого Notch контролирует рост и ведение аксонов. Ключевой задачей является открытие молекулярного механизма, с помощью которого Notch противодействует передаче сигналов Abl, и выяснение того, почему супрессия передачи сигналов Abl с помощью Notch собственно способствует росту и ведению Notch-зависимых аксонов.