Поразительным свойством ядра клеток эукариот является упаковка ДНК в сильно свернутый хроматин, который вписывается в очень ограниченное пространство. Однако хроматин оккупирует только половину доступного объёма ядра , остальное межхроматиновое пространство организовано в ядерные субкомпартменты, а растворимые компоненты участвуют в динамических структурных изменениях хроматиновых доменов. Увеличивается число доказательств, что расположение хромосом, генных локусов и ядерных телец неслучайно и обнаруживает признаки самоорганизации в пространстве и во времени. В контексте высоко упорядоченного окружения ядро таким образом подтверждает эффективность и точную координацию разнообразных процессов, включая транскрипцию, репарацию и репликацию ДНК.
Хромосомы и индивидуальные гены занимают предпочтительное местоположение относительно один другого и относительно вех в интерфазном ядре. Более того, локализация ассоциирует с транскрипционной активностью. У метазоа тонкая пластинка (lamina) выстилающая внутреннюю сторону ядерной оболочки рассматривается как репрессивное окружение, укрывающее транскрипционно неактивный факультативный гетерохроматин. Напротив, особенно у дрожжей, субнаборы активно транскрибируемых локусов могут находиться на ядерных порах, а также в специфических внутренних компартментах. Т.о., специфическая архитектура может создавать функциональные микроусловия, чтобы координировать транскрипционную активность. Более того, изменения в состоянии транскрипции ассоциируют с перемещением локусов в и из ядерных субкомпартментов.
Пространственная организация целых хромосом стала ясной в последние десятилетия, как важный фактор регуляции генов и геномной стабильности. используя окрашивание Giemsa и свтовую электронную микроскопию, Stack et al. (1977) наблюдали, что хромосомы оккупируют определенные домены в интерфазном ядре эукариот. Cremer et al. (1982) были первыми, предоставившими экспериментальные доказательства для существования таких интерфазных CTs (Cremer and Cremer, 2006, 2010; Heard and Bickmore, 2007). Поиск специфических регионов ядра с помощью микролазера показал, что повреждения неслучайно распределены вдоль большинства хромосом, а ограничены немногими местами и исследователи предположили, что хромосомы должны поэтому быть ограничены CTs. Расположение этих CTs определяется относительно др. др, а также по близости к периферии ядра. Неслучайное расположение было продемонстрировано при расхождении богатых генами и бедных генами хромосом, которые обнаруживали тенденцию локализоваться вместе в отношении ядерной середины или периферии, соотв. Эта неслучайная организация CTs выявляется среди многих разнообразных типов клеток и, по-видимому, законсервировано в ходе эволюции эукариот (Croft et al., 1999; Boyle et al., 2001; Cremer et al., 2001; Neusser et al., 2007). Считается, что эта высокого уровня организация вносит вклад в меж- и внутрихромосомные взаимодействия и координирует экспрессию среди набора генов. Динамическая активность в CTs дополняется чрезвычайно организованной системой. Перемещения генных локусов на большие расстояния в и из CTs были описаны (с расстояниями ~5 µm) и были связаны с активацией и молчанием генов, преимущественно как доступ к изменениям транскрипционного аппарата (Chuang et al., 2006; Dundr et al., 2007; Meister et al., 2010). Однако пока неясно, является ли образование генами петель первичным механизмом для колокализации удаленных локусов или перестройки высшего порядка хроматина обусловливают взаимодействия (Strickfaden et al., 2010).
3D архитектура хромосом может компартментализовать ядро и отражать региональную экспрессию генов (Kosak and Groudine, 2004; Bolzer et al., 2005; Misteli, 2007; Dekker, 2008), но анализ ядерной архитектуры ограничивается методами, которые концентрируются на взаимодействиях между специфическими локусами скорее, чем на беспристрастном анализе всего генома (Dostie et al., 2006; Simonis et al., 2006; Zhao et al., 2006). Техника chromosome conformation capture (3C) идентифицирует хроматиновые взаимодействия между двумя интересующими регионами путем поперечных сшивок, ограничения ферментативного переваривания, межмолекулярным связыванием и PCR анализом возникающих в результате сцепленных фрагментов ДНК (Dekker et al., 2002). Первоначально описанные варианты техники 3C были использованы для изучения ядерной организации на более глобальном уровне (Lieberman-Aiden et al., 2009). Используя один из них, Hi-C, который исследует 3D архитектуру всего генома путем лигации, базирующейся на близости стыковки с массивным параллельным секвенированием, Lieberman-Aiden et al. (2009) и van Berkum et al. (2010) сконструировали карты близости генома человека в B клетках и линиях эритроидных клеток и подтвердили наличие CTs, близости небольших, богатых генами хромосом и пространственную сегрегацию открытого и закрытого хроматина.
Расположение интерфазных хромосом по разным территориям сегодня общепринято как основной принцип ядерной организации (Cremer and Cremer, 2010). Существуют две широко распространенные модели организации CT в интерфазном ядре. В модели CT-interchromatin compartment (IC) ядра содержат CTs и IC. Взаимное соединение в высшего порядка хроматиновые сети предопределяет доминирующую структуру внутри индивидуальных CTs (Visser et al., 2000; Albiez et al., 2006). IC является 3D прилегающей пространственной сетью, которая формирует каналы между CTs (Albiez et al., 2006; Rouquette et al., 2009). Активно транскрибируемые гены лежат на поверхности CTs, в перихроматиновой области, где происходят транскрипция, процессинг пре-мРНК и репликация ДНК. Из-за варьирующей толщины ICs, модель CT-IC не исключает возможности взаимодействий между CTs, в которых могут происходить меж- и внутрихромосомные перестройки (Markaki et al., 2011; Rouquette et al., 2010). Напротив, в модели межхроматиновой сети пространство между хроматином действует как общее пространство (commons) для частых перемешанных хроматиновых петель в цис- и транс-положении (Branco and Pombo, 2006). Петлеобразование хроматина из CTs обусловливается только непосредственными стерическими взаимодействиями, такими как внутрихромосомные высшего порядка конформации, соседние хромосомы, ядерные субкомпартменты и ядерная оболочка. Существенные межхромосомные контакты, выявляемые с помощью Hi-C данных, показали регулярное перемешивание, которое согласуется с моделью межхроматиновой сети (Lieberman-Aiden et al., 2009). Смешивание хромосомных регионов может влиять на организацию хромосом в целом, а также потенциально способствовать повторному позиционированию по всей хромосоме и по всему геному путем воздействия на поведение соседнего хроматина в цис- и транс-положении. Активно транскрибируемые и репрессированные гены могут часто образовывать кластеры в разных функциональных субкомпартментах (Cremer and Cremer, 2010).
Важно также рассмотреть два ограничения микроскопических методов в исследованиях CTs и производных моделей. Во-первых, повторяющиеся последовательности элиминируются во время генерации хромосом-специфических картин. Хотя общим предположением является то, что повторы погружены в CT, формально этого не было продемонстрировано и возможно, что повторы могут покрывать территории или выступать из них. Во-вторых, хотя имеются многочисленные исследования специфических локусов, образующих петли из соответствующих CTs , чтобы активировать или репрессировать субкомпартменты, многочисленные петли из каждой данной CT неизвестны (Volpi et al., 2000; Ragoczy et al., 2003). Более того, с помощью визуализации CT и специфических локусов с образованными петлями, окружающие последовательности, соединяющие локус с CT обычно не детектируются. Т.о., настоящая протяженность CT (CT границы) и степень перемешивания не были определены с большой аккуратностью, учитывая ограничения и современные реагенты и методологии.
Peripheral dynamics
Ядерная организация д. зависеть от разнообразных клеточных сигналов, на которые влияют внешняя среда, состояние развития и стадия клеточного цикла. Т.о., модели ядерной организации д. заключать в себе динамическую гибкость хромосом, обусловленную с помощью поддающейся адаптации и чувствительной ядерной среды, и в то же самое время делающей возможным высшего уровня порядок как отражение специализации ядерных субкомпартментов. Взаимоотношения между пространственным расположением и генной экспрессией иллюстрируется динамической ассоциаций хромосом с периферическими структурами ядерной оболочки, а также с более центральными ядерными субкомпартментами. В целом периферическая локализация коррелирует с ослаблением транскрипции и гетерохроматином, тогда как перемещение в направлении ядерного центра коррелирует с более высоким уровнем транскрипции и эухроматином. Однако два конкурирующих домена могут испытывать влияние экспрессии генов на периферии ядра.
Одним из важных компонентов является ядерная ламина, сеть промежуточных филамент (lamins, LAP2?, emerin, etc.) , выстилающих внутреннюю ядерную мембрану, обеспечивающую как механический, так и сигнальный каркас для ядра. Ядерная ламина, как было установлено, взаимодействует с хроматином и локусы на этом интерфейсе обнаруживают тенденцию пониженной экспрессии. Более того, эксперименты по привязыванию, в которые локусы закрепляли на ядерной ламине, показали молчание после периферической локализации (Finlan et al., 2008; Reddy et al., 2008). Сканирование генома на локусы с тесной ассоциацией с ядерной ламиной, используя DNA adenine methyltransferase identification (DamID; метод, который использует слияния с бактериальной methyltransferase, чтобы идентифицировать сайты геномного связывания определенного белка), выявили многочисленные lamin-associated domains (LADs) в основном в молчащих гетерохроматиновых регионах ядер человека, мыши и Drosophila melanogaster (Pickersgill et al., 2006; Guelen et al., 2008). Регионы в десятки kilobases до более 10 Mb были идентифицированы, но точные ламин-связывающие мотивы не были определены (Peric-Hupkes et al., 2010). Повсеместная природа этих взаимодействий была недавно продемонстрирована Peric-Hupkes et al. (2010), которые идентифицировали LADs во время пространственной реорганизации при дифференцировке эмбриональных стволовых клеток (ESCs) в клетки нейральных предшественников и астроцитов. Исследование показало, что в каждой из трех стадий дифференцировки, а также в 3T3 эмбриональных фибробластах мыши ~40% генома представлено LADs и что LADs в разных типах клеток перекрываются ~70-90%. Важно, что во время дифференцировки наблюдаются некоторые изменения позиции LADs прочь от периферии, указывающие на предстоящую или действительную транскрипционную активность (Meister et al., 2010). Т.о., хотя перекрывающиеся наборы LADs присутствуют в разных типах клеток независимо от клонального происхождения или стадии развития, качественные особенности LAD динамичны.
Хроматин также взаимодействует с компонентами комплексов ядерных пор. В отличие от периферической ассоциации с ядерной ламиной, локусы вблизи комплексов ядерных пор стремятся быть эухроматиновыми и более активно транскрибируемыми (Blobel, 1985; Krull et al., 2010). Ассоциация между белками ядерных пор и геномной ДНК показана у дрожжей, Drosophila и у млекопитающих (Akhtar and Gasser, 2007; Luthra et al., 2007; Brown et al., 2008). У дрожжей, chromatin immunoprecipitation (ChIP) с ядерными порами ассоциированных белков выявила взаимодействия с активно транскрибируемыми генами (Casolari et al., 2004). Кроме того, ядерные porins в корзинке внутренней ядерной поры, как было установлено, ассоциируют с определенными последовательностями ДНК в активных промоторах, это может облегчать оптимальную экспрессию генов (Schmid et al., 2006; Taddei et al., 2006; Ahmed et al., 2010). Важно отметить, что взаимодействия между промоторами и растворимыми нуклеоплазменными ядерными porins установлены; , следовательно, локализация на ядерной поре не может быть определена с использованием только ChIP и DamID и д. быть подтверждена с помощью FISH (Capelson et al., 2010; Kalverda et al., 2010). Локализация хроматина в микроусловиях ядерных пор д. содействовать транспорту транскриптов в цитоплазму благодаря близости, более низким концентрациям обструктивно конденсированной ДНК и более высоким концентрациям аппарата процессинга пре-мРНК (Blobel, 1985; Ishii et al., 2002; Kylberg et al., 2008; Krull et al., 2010; Strambio-De-Castillia et al., 2010).
Хотя механизмы, управляющие пространственным позиционированием, и то, как специфические ядерные субкомпартменты на периферии влияют на состояние транскрипции, не совсем ясны, они, по-видимому, являются важными регуляторными событиями в развитии. В исследованиях ESCs человека, репрессированный хроматин, маркированный с помощью триметилирования H3K27, концентрировался на ядерной периферии, но небольшой процент активного хроматина на периферии сохранялся. Дифференцирующиеся клетки содержат тот же самый процент активного хроматина, но имеют достоверно меньше периферического репрессированного хроматина, чем ESCs (Luo et al., 2009). Кроме того, некоторые гистоновые деацетилазы ассоциируют с lamin-ассоциированными белками на периферии (Somech et al., 2005), указывая на активно поддерживаемые условия репрессии. Т.о., отправка определенных локусов в условия периферии может гарантировать сохранение репрессии до тех пор, пока не высвободится соотв. указующий сигнал и не произойдет активация необходимых для развития генов. Во время дифференцировки локусы, содержащие активированные гены перемещаются из репрессивного в активный ядерный компартмент, тогда как локусы, содержащие подавленные гены перемещаются в противоположном направлении (Brown et al., 1997; Skok et al., 2001; Kosak et al., 2002; Ragoczy et al., 2006). На локальном уровне, перемещения локусов могут сопровождаться петлеобразованием локусов от их CTs (Williams et al., 2006). Более того, исследования моноаллельно экспрессируемого гена GFAP показали, что активный аллель находится на более внутренней радиальной позиции, чем не экспрессируемый аллель (Takizawa et al., 2008).
Известная инверсия предоминантного паттерна ядерной организации обнаружена в палочковидных клетках сетчатки ночных млекопитающих, где, хотя и присутствует тот же самый высокий уровень порядка, гетерохроматин оказывается внутренним, а эухроматин периферическим, т. е. в положении, которое минимизирует рассеивание света (Solovei et al., 2009). Следовательно, палочковидные клетки являют пример широкой гибкости биологических систем и также иллюстрируют, что функциональные потребности специфических типов клеток могут сильно влиять на архитектуру ядра.
Central dynamics
Многие др. ядерные субкомпартменты участвуют в динамической регуляции генома и, скорее всего, накладывают определенную пространственную конфигурацию внутри интерфазного ядра. Напр., ядрышки, наиболее заметные ядерные тельца, возникают в результате скопления множественных тендемных повторов рибосомальной ДНК из нескольких хромосом. Они являются местом транскрипции рибосомальной РНК (rRNA) с помощью RNA polymerase I, посттранскрипционных преобразований рРНК и сборки субъединиц рибосом. Образование пространственных кластеров из этих отдаленных геномных локусов является критическим для их функции, делает ядрышки прекрасным примером специализированной ядерной компартментализации (Boisvert et al., 2007).
Околоядерный регион является др. ядерным доменом с отличающимися характеристиками, обладающие низкой транскрипционной активностью РНК полимеразы II (Nemeth et al., 2010). Секвенирование, геномный анализ микромассивов, 3D FISH и иммунофлюоресценция показали, что домены, ассоциированные с ядрышками, составляющие ~4% генома человека, в основном транскрипционно репрессированы и обогащены репрессивными гистоновыми модификациями и истощены по тем, что связаны с транскрипционной активностью (Nemeth et al., 2010). Заметным исключением относительно репрессии транскрипции в околоядерном регионе является РНК полимеразой III-транскрибируемые гены тРНК (Bertrand et al., 1998). tRNA гены концентрируются в доменах, ассоциированных с ядрышками, указывая на возможный общий механизм пространственного позиционирования многих геномных регионов, несущих гены tRNA (Nemeth et al., 2010). Такое позиционирование зависит от положения и транскрипционной активности РНК полимеразы III, поскольку точковые мутации промоторов элиминируют ассоциацию с ядрышком (Thompson et al., 2003). Тесная пространственная близость синтеза tRNA и rRNA может быть важной для скоординированной экспрессии трансляционного аппарата.
Polycomb тельца являются др. примером пространственного позиционирования внутри ядра, которое приводит к репрессии генов. Polycomb тельца являются дискретными фокусами, которые состоят из белков polycomb group (PcG), которые ослабляют генную экспрессию во многих типах клеток, а локусы мишени содержат PcG чувствительные элементы (Saurin et al., 1998). PcG белки и чувствительные элементы, как было установлено, облегчают дальнодействующие межхромосомные взаимодействия множественных локусов, даже когда локусы искусственно помещены в эктопические места (Bantignies et al., 2003; Vazquez et al., 2006). Гены, ассоциированные с polycomb тельцами, испытывают хроматиновые модификации, катализируемые с помощью белков PcG комплекса PRC1 и PRC2 (механизмы PcG репрессии рассмотрены Morey and Helin, 2010). Polycomb-обусловленная репрессия, по-видимому, критическая для поддержания соотв. временной репрессии локусов во время развития, поскольку её разрушение может вызывать активацию путей дифференцировки (O'Carroll et al., 2001; Pasini et al., 2007; Ezhkova et al., 2009).
Transcription factories
Динамические перемещения генов в и из CT могут дозволять специфическим локусам или наборам корегулируемых генов быстро задействовать аппарат транскрипции. В самом деле, транскрипция скоординированно регулируемых генов, которая базируется на одних и тех же транскрипционных факторах и кофакторах, будет значительно более эффективной, если этот аппарат предварительно собран в компартментах с высокими локальными концентрациями. Наблюдение, что меченные синтезируемые транскрипты располагаются в дискретных фокусах транскрипции привело к концепции таких "факторий транскрипции" (Jackson et al., 1993; Wansink et al., 1993), и сегодня известно, что РНК полимераза II накапливается в транскрипционных факториях ~1,000-раз более высоких концентрациях, чем либо в др. частях нуклеоплазмы (Cook, 2002). Кроме того, наблюдение, что РНК полимеразы являются довольно малоподвижными и закреплены в ядерных структурах, подтверждают модель транскрипционных факторий, что активно транскрибируемые гены могут перемещаться эффективно благодаря кластерам полимеразных комплексов скорее, чем отслеживанию полимеразами вдоль ДНК (Sexton et al., 2007; Papantonis et al., 2010).
Транскрипционные фактории специализируются в зависимости от типа полимераз, транскрипционных факторов и хромосомных регионов. Напр., РНК полимераза I локализуется в ядрышке для синтеза рибосом, тогда как РНК полимераза II и III локализуются, чтобы посвятить себя взаимно исключающим регионам нуклеоплазмы (Pombo et al., 1999). Геномные регионы и типы клеток могут также детерминировать функцию транскрипционных факторий (см. Bartlett et al. 2006). В недавнем исследовании Schoenfelder et al. (2010) с использованием изменчивости 3C для скрининга генома по локусам, которые колокализуются с активными α- и β-globin генами (Hba и Hbb) в эритроидных клетках. Многие эритроид-специфичные гены как на той же самой, так и разных хромосомах были обнаружены ассоциированными с глобиновыми генами. Каждый ген globin колокализовался с набором локусов с очень незначительным перекрыванием. Более того, субнабор генов, идентифицированных по колокализации с Hbb, обладал одинаковым сайтом связывания для Kruppel-like factor 1 (Klf1), транскрипционного фактора эритроидного клона. Klf1 был найден в субнаборе транскрипционных факторий вместе с идентифицированными Klf1-регулируемыми генами, указывая на существование клон-специфических факторий, оптимизированных для экспрессии корегулируемых генов. В соответствии с этой гипотезой, в отсутствие Klf1, корегулируемые гены неспособны к совместно локализации.
Однако остается множество вопросов, таких как являются ли транскрипционные фактории стабильными или они спонтанно и преходяще самоорганизуются и влияет ли состояние развития на статус и динамику транскрипционных факторий. Подтверждение действительной динамики транскрипционных факторов нуждается в дальнейшем исследовании локусов на геномной шкале, а также в разработке высоко разрешающих методов детекции и отслеживания формирования и локализации транскрипционных факторий во времени.
Methods for exploring the 3D genome
Разработаны многообразные биохимические методы для изучения конформации хроматиновых (или хромосомных) регионов, предоставляющие информацию об ядерных субкомпартментах и локальных паттернах генной экспрессии. Первоначально такие характеристики определяли при анализе одного или немногих локусов (Dostie et al., 2006; Simonis et al., 2006; Zhao et al., 2006), но последнее развитие беспристрастного высокопроизводительного пространственного анализа генома обладает потенциалом выявлять критические глобальные характеристики ядра, которые могут участвовать в регуляции транскрипционных программ.
Недавно разработан Hi-C метод зондов 3D архитектуры всего генома (Fig. 2 A) с помощью купирования базирующейся на близости лигации с массивным параллельным секвенированием (Fig. 2 B). Карты пространственной близости генома человека были сконструированы с использованием Hi-C с разрешением 0.1-1 Mb (Lieberman-Aiden et al., 2009), и использован сходный с Hi-C метод для получения модели 3D архитектуры генома дрожжей (Duan et al., 2010). Карты, сконструированные с использованием данных генома человека подтвердили присутствие CTs и пространственную близость малых, богатых генами хромосом. Карты также идентифицировали дополнительный уровень геномной организации, который характеризуется пространственной сегрегацией открытого и закрытого хроматина (на базе гиперчувствительности к DNase I) в два геномных компартмента. Хотя паттерны компартментов, по-видимому, сходны в разных типах клеток, состав индивидуальных локусов отличается и имеется строгая корреляция между паттерном компартмента и доступностью хроматина в одном и том же типе клеток (Lieberman-Aiden et al., 2009). Эти результаты демонстрируют мощь Hi-C для картирования конформаций целого генома и, более того, что домены открытого и закрытого хроматина по всему геному занимают разные пространственные компартменты в ядре. Эти паттерны могут служить отличием для специфических типов клеток или состояний. Метод, предшествующий Hi-C, 3C, позволял исследовать только небольшие области генома. Усовершенствования этой техники, такие как 4C или 5C, сделали возможным анализ регионов всего генома или дальнодействующих взаимодействий, но всё ещё тенденциозны в смысле, что они базируются на PCR амплификации наборов специфических наживок праймеров и применении микромассивов (for more information on these techniques see Naumova and Dekker, 2010; van Steensel and Dekker, 2010). Др. недавний метод, анализ взаимодействия хроматина со paired-end ditag секвенированием, использует комбинацию ChIP со специфическими антителами, внутримолекулярными сшивками обогащенных последовательностей, и секвенирование, позволяющее детекцию связывания белкового фактора, также как и дальнодействующих взаимодействий (Fullwood et al., 2009).
Современные биохимические анализы конформации хроматина измеряют возможность любого данного взаимодействия с помощью количества считываний последовательностей, выявляемых в популяции клеток. Однако эти техники не выявляют, какие из взаимодействий функционально важны, это должно быть подтверждено экспериментально. Более того, эти техники нуждаются в миллионах клеток для улучшения вероятности обнаружения определенного взаимодействия, что делает трудным определение, какие взаимодействия/конфигурации появляются одновременно в любой данной клетке (Simonis et al., 2007). Высоко разрешения картины живых клеток с меченными генными локусами и ядерными тельцами используют блестящие fluorophores и низкое photobleaching или новую мультиплексные системы мечения, скорее всего, будут необходимы для оценки многих находок по организации генома на уровне одиночной клетки. Микроскопические подходы более эффективно выявляют индивидуальные ядерные компоненты и их топографию относительно др. др. Многоцветные ДНК и РНК FISH (M-FISH или 3D-FISH) позволяют визуализовать интерфазные хромосомы во всей их целостности, а также транскрипционные события. Техника спектрального кариотипирования (SKY) использует 3D-FISH а также специализированную экипировку и компьютерный анализ, что позволяет отлавливать весь спектр эмиссии в одиночной картине (Fig. 2 C). Эта техника облегчает сравнения, которые могут помочь идентифицировать межклеточную изменчивость укладки хроматина и укладки, специфичные для типов клеток для определенных доменов хроматина.
Bolzer et al. (2005) впервые использовали 3D-FISH для одновременного обнаружения всех хромосом в одиночном диплоидном фибробласте человека в интерфазе и на стадии прометафазной розетки. Они открыли, что определенные CTs постоянно граничат только с избранными соседями и их анализ подтвердил, что перемешивание хроматиновых петель между CTs не очень обширное, если же это происходит, то CTs значительно менее дискретны. Однако это не исключает возможности неслучайного перемешивания между CTs или колокализации генов в IC. Кроме того, исследование относительного позиционирования всех CTs не было проверено или исследовано на др. типах клеток. Если происходит существенное перемешивание, то аккуратные измерения формы хромосом и относительной позиции становится трудно определимым микроскопически (Cremer and Cremer, 2010).
Одним из затруднений в любой 3D характеризации с использованием методов мечения и микроскопии, является форма ядер, которая зависит от типа клетки. Фибробласты человека, напр., имеют плоское элипсоидное ядро, в котором ориентация структур может быть определена с помощью большой и малой осей. Сферические ядра, однако представляют затруднение в назначении пространственной системы координат и полярности. Техники геометрических подсчетов могут помочь в определении специфических признаков, таких как центральна точка или centroid, и помочь охарактеризовать взаимоотношения между CTs путем определения расстояний между centroids и наиболее тесным расстоянием между любыми двумя CTs. Разработка более сложных вычислительных инструментов может позволить дальнейшее исследование сложных характеристик CT, такой как общий объем и область контакта (Eils et al., 1996; Roix et al., 2003; Cremer and Cremer, 2010). Более того, микроскопические техники, которые предоставляют высокое разрешение в трех измерениях, такие как базирующаяся на лазере микроскопия и сфокусированные пучки ионов со сканирующим ЭМ, позволят критически усовершенствовать существующие модели организации хроматина (Hell, 2007; Schroeder-Reiter et al., 2009).
Хотя одиночные временные точки в недавних Hi-C и M-FISH исследованиях предоставили важные намеки на то, как организованы геномы (Bolzer et al., 2005; Lieberman-Aiden et al., 2009), расширение этого на множественные временные точки необходимо, чтобы понять динамическую гибкость хромосомной организации. По ходу времени дифференцировки, напр., многое может быть выяснено о важности позиционирования генов в контексте развития и регуляции транскрипции. Исследование двух временных точке во время дифференцировки в гематопоэтическом клоне мыши показало, что имеют место драматические изменения в тотальном геномном порядке (Rajapakse et al., 2009). В этом исследовании прометафазные розетки были исследованы с помощью SKY. Хотя эта упорядоченность оценивалась парными сравнениями немногих интерфазных CTs (Kosak et al., 2007), всё ещё неизвестно, все ли расположения прометафазных хромосом отражаются в интерфазных ядрах. Более того, дополнительные временные точки во время хода дифференцировки могут предоставить более детальную картину реорганизации хромосом. Дополнительным сображением относительно 3D анализа всего генома является использование нетрансформированной первичной клеточной системы с нормальным кариотипом.
Технические успехи облегчили также геномные исследования специфических взаимодействий и процессов в линейном геноме. Время репликации во время S фазы может быть отслежено с использованием пульсового мечения BrdU, анализа микромассивов и глубокого секвенирования (Hiratani et al., 2008); взаимодействия транскрипционный фактор -- ДНК или гистоновые модификации могут быть глобальрно профилированы с использованием ChIP в комбинации с анализом микромассивов или секвенированием (ChIP-chip или ChIP-seq); а с хроматином взаимодействующие белки могут быть отслежены с использованием DamID. Гетерохроматин и эухроматин могут быть также профилированы с использованием обработки DNase I , которая нацелена на открытый хроматин, вместе с ligation-mediated PCR амплификацией и микромассивами или секвенированием (Naumova and Dekker, 2010). Сравнения между такими профилями и картами пространственной близости могут предоставить дополнительную информацию о том насколько, судя по виду, отдельные ядерные процессы совпадают и влияют др. на др.. Ryba et al. (2010) показали, что решения о временных точках G1 репликации связаны с пространственной архитектурой. Многие др. потенциальные взаимоотношения далеки от изучения. Напр., транскрипционные факторы, которые действуют как главные регуляторы, такие как MyoD в дифференцировке скелетномышечных клеток, могут влиять на ядерную архитектуру. MyoD, кроме своего ожидаемого связывания с мышце-специфическими регуляторными регионами, также соединяется широко через геном с сайтами, ассоциированными ацетилированием гистонов перед дифференцировкой мышечных клеток . Т.о., MyoD может также играть роль в регуляции эпигенетических признаков и геномной организации (Cao et al., 2010).
Spatial positioning and cancer
Различные раковые опухоли ассоциированы со специфическими транслокациями. Было показано, что высокая частота определенных транслокаций отражает превалирующее ткане-специфическое пространственное позиционирование определенных хромосом, т.к. эти транслокации возникают. когда партнеры хромосомы находятся в тесной близи (Misteli, 2004; Soutoglou and Misteli, 2008). Более того, транслокации влияют на пространственное расположение, а также генную экспрессию (Croft et al., 1999; Taslerova et al., 2003; Harewood et al., 2010) и могут играть роль в туморогенезе посредством нарушения связи между пространственным расположением и экспрессией. Напр., Harewood et al. (2010) изучали эффект реципрокной транслокации между хромосомой 11 и 22 (t(11;22)(q23;q11)) , которая ассоциирована с высоким риском рака груди и, как было установлено, влияет на пространственное расположение хромосом. При анализе транскриптома клеточные линии от индивидов с транслокацией обнаруживали более высокое количество дифференциально экспрессируемых генов по сравнению с ожидаемой изменчивостью в клеточных линиях от индивидов без транслокации (Harewood et al., 2010). Однако не каждая транслокация, даже ассоциированная с туморогенезом, приводила к изменениям пространственного позиционирования или генной экспрессии (Snow et al., 2011). Это не удивительно, если расположение хромосом является ключевым свойством генной регуляции. Время или путь достижения важной глобальной конфигурации может изменяться после транслокации или мутации, но только крупные нарушения в топологии хромосом, которые нарушают паттерны расположения индивидуальных генов могут повышать вероятность болезненных состояний.
Изменение позиций в раковых клетках по сравнению с нормальной тканью, также, по-видимому, ген специфично и сцеплено с со специфичными для болезни 3D перестройками. Meaburn et al. (2009) идентифицировали некоторые гены с измененной локализацией в клетках, происходящих из инвазивного рака груди, по сравнению с клетками из нормальной ткани. Изменения в количестве копий не коррелировали с хромосомной перестройкой, указывая, что пространственное репозиционирование не было результатом геномной нестабильности. Кроме того, клетки рака груди могут быть отличены от нераковых клеток базируясь на репозиционировании генов с почти 100% аккуратностью, используя ген HES5 (Meaburn et al., 2009). Т.о., пространственная организация, по-видимому, является важным свойством, связанным с функцией ядра, это может использоваться в качестве потенциального диагностического признака для идентификации раковой ткани.
Perspective
Self-organization and optimum configurations.
Было предположено, что позиционирование генов и хромосом, а также образование ядерных субкомпартментов является результатом самоорганизации (Misteli, 2001; Kosak and Groudine, 2004). Самоорганизация в системе является процессом, с помощью которого выявляется глобальный уровень паттерна исключительно из множества взаимодействий среди компонентов более низкого уровня; паттерн является неожиданно возникающим свойством системы скорее, чем собственно накладывается на эту систему внешними упорядоченными влияниями (Ashby, 1947; Camazine et al., 2003). Правилами поведения в таких системах являются нелинейность, и в целом нелинейность системы является не просто дополнительной функцией её частей (Anderson, 1972; Strogatz, 1994, 2001, 2003). Более изящное мнение о самоорганизации заключается в том, что самоорганизация является тем, что глобальный паттерн, хотя и не контролируется локальными взаимодействиями, может подпадать (feed back) под влиянием этих локальных компонентов (Fig. 3 A). Возникающие в результате изменения в локальном поведении могут затем менять глобальный паттерн и система самоорганизации со временем окажется тонко настроенной. Т.о., системы самоорганизации имеют локальные к глобальным и глобальные к локальным обратные связи, которые ведут к усилению упорядоченности и со временем система обнаруживает постоянное взаимодействие bottom-up и top-down процессов. Следовательно, координация активностей индивидуальных элементов комплекса позволяет системе развиваться, поддерживать сложность на более высоком уровне и изменяться со временем (Fig. 3 B).
Интригующий пример самоорганизации в биологии это слизистая плеснь
Physarum polycephalum, которая обладает талантом нахождения наиболее эффективной конфигурации в своих поисках пищи. Если слизистая плеснь помещается вблизи множества различного размера овсяных хлопьев, то она контактирует со всеми хлопьями, до которых дотягивается. Затем она начинает разрушать соединения с самыми мелкими овсяными хлопьями и усиливать соединения с наиболее крупными центральными хлопьями. В конечном итоге она принимает оптимальное решение, согласно которому большинство мощных соединений устанавливается с наиболее важными/центральными узлами, а избыточные соединения постепенно исчезают (Tero et al., 2010). Во многих научных дисциплинах оптимальность уже давно считается организующим принципом системы. Мы можем то де самое сказать о живых клетках. Клетка является самоорганизующейся, самореплицирующейся, чувствительной к окружению машиной варьирующей сложности. Инструкции для этой сложности содержатся внутри генетического кода клетки, но как эта информация получается. считывается и интерпретируется зависит от внешнесредовых и эпигенетических факторов во время развития и дифференцировки.
Networks.
Базовые механизмы. лежащие в основе самоорганизации в сложных биологических сетях всё ещё далеки от выяснения. Однако, самоорганизующиеся система может быть упрощена, если сохраняющаяся сложная информация деконструируется на её элементы в хорошо известные сети. Если мы считаем, что ядро это система, состоящая из таких сетей, то изучение динамики между сетями может предоставить пригодную основу для изучения сложной 4D ядерной организации. Сеть-график в математической литературе-это собрание точек или узлов, соединенных определенным образом линиями или краями. В последние годы наблюдается сильный подъём в исследовании сетей во многих дисциплинах, от вычислительных наук и коммуникаций до социологии и эпидемиологии (Newman et al., 2006). Для характеристики функции ядра, как генная регуляция, так и пространственная конфигурация могут быть определены в терминах сетей (Rajapakse et al., 2010). Конфигурация гена относительно хозяйской хромосомы, а также генов на др. хромосомах может быть обозначена как пространственная сеть, см. Fig. 4 A. Рисунок 4 A показывает структурную организацию ядра. Рисунок 4 B показывает сеть транскриптома, которая представляет функциональную организацию ядра. На рис. Fig. 4 A, узлами являются хромосомы или гены, в которых вычислены края на базе близости хромосом. На ри. Fig. 4 B, узлами являются хромосомы или гены, а края подсчитаны на базе генной ко-регуляции. Одним из показателей генной ко-регуляции является относительная энтропия между профилями генной экспрессии. Было показано, что сети двух клеток, показанные на рис. 4 (A and B) не только связаны во время дифференцировки, но и также высоко скоррелированы (Rajapakse et al., 2009). Эта интригующая взаимосвязь была установлена путем определения и показа коллективного сходства между ко-регулируемыми генными регуляторными сетями и сетями хромосомных взаимодействий в ядре во время дифференцировки in vitro гематопоэтических предшественников мыши (Bruno et al., 2004; Kosak et al., 2007; Rajapakse et al., 2009). Эти исследования показали, что фактически ко-регуляция генов ведет к хромосомным ассоциациям, которые в свою очередь подкрепляют силу локальных ассоциаций. Т.о., ядро реорганизует самого себя функционально и структурно. Хотя глобальная реорганизация хромосом происходит во время дифференцировки (Kim et al., 2004; Parada et al., 2004; Kosak et al., 2007), неясно, происходят ли локальные изменения в позиционировании, такие как образование петель из локусов от CTs, чтобы активировать или репрессировать компартменты, управлять глобальной реорганизацией на хромосомном уровне и наоборот.
В контексте этих недавних результатов, основной вопрос, как структурная организация ядра связана с его функцией, остается без ответа. Используя комбинацию Hi-C и интерфазный 3D-FISH вместе с более сложной вычислительной и imaging техникой, мы сможем оказаться способными продвинуться в направлении более полного картирования локальных и глобальных пространственных сближений, с конструкцией сетей хромосомных взаимодействий (Fig. 2 D), это позволит более аккуратно определить динамику клеточных функциональных и структурных сетей. Один из важных вопросов это, как идентифицировать фундаментальные процессы, которые помогут установить стабильные переходы между клеточными состояниями во время развития. Напр., мы можем обратиться к глобальной шкале, вызывает ли детерминация клонов формирование паттернов специфической ядерной архитектуры, что предопределяет экспрессию генов дифференцировки или транскрипция генов дифференцировки инициирует переходы в архитектуре ядра. Мы полагаем, что исследования взаимоотношений между ядерной архитектурой (форма) и экспрессией (функция) окажутся критическими для улучшения нашего понимания клеточных судеб (Fig. 3 B), включая ложные шаги, которые могут приводить в движение нормальные клетки к нестабильному состоянию, которое ведет к раку. При изучении нарушений в сетях, которые глобально представлены в ядрах любого типа клеток? мы в принципе сможем предсказать нестабильность и в конце концов определить, как перенаправить клетки из дифференцированного состояния к плюрипотентности или от патологического к доброкачественному состоянию. Появляющиеся технологии в микроскопии, высокопроизводительные биохимические методы и вычислительные инструменты создадут интегрированные подходы, которые позволят более четко понять ядерную организацию в пределах достигаемости.
Сайт создан в системе
uCoz 
