Посещений:
ИСТОЧНИК ГЕМАТОПОЭТИЧЕСКИХ ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ

Гемопоэтические Стволовые Клетки

Embryonic origin of human hematopoiesis
MANUELA TAVIAN, KATIA BIASCH, LIDIA SINKA, JUDITH VALLET and BRUNO PEAULT
Int. J. Dev. Biol. 54: 1061-1065 (2010) doi: 10.1387/ijdb.103097mt

ABSTRACT Hematopoietic stem cells (HSC) are at the of the adult hematopoietic system. They give rise to all blood cells through a complex series of proliferation and differentiation events that occur throughout the lifespan of the individual. Because of their potential clinical importance in transplantation, recent research has focused on the developmental origins of embryonic HSC.During development in vertebrate embryos, two independent anatomical sites generate hematopoietic cells. The yolk sac is responsible for a first ephemeral hematopoiesis, characterized by the early appearance of hematopoietic progenitors with limited development ability that rapidly differentiate toward erythro-myeloid lineages. Self-renewing, multipotent adult-type HSC that also exhibit B and T lymphoid potentials emerge autonomously in the aorta/gonad/mesonephros (AGM) region inside the embryo. In this review, we provide a brief summary of recent developments regarding the origins of hematopoietic stem cells in the early human embryo. The recent discovery that angiotensin-converting enzyme (ACE) is a novel cell surface marker of human HSC is discussed in detail.



The placenta as a haematopoietic organ
KATRIN OTTERSBACH and ELAINE DZIERZAK
Int. J. Dev. Biol. 54: 1099-1106 (2010) doi: 10.1387/ijdb.093057ko

Недавно плацента была описана как ткань, богатая гемопоэтическими стволовыми клетками и клетками предшественниками, это открывает не только новые горизонты исследования, в смысле как гематопоэз регулируется в этой уникальной ткани млекопитающих, но и также ведет к пересмотру давно стоящих и всё ещё нерешенных вопросов о значении множественных гемопоэтических органов во время развития. Благодаря удивительной способности к экспансии гемопоэтических стволовых клеток и клеток предшественников изучение плацентарного гематопоэза имеет очевидный клинический интерес. В работе суммируются современные известные данные о регуляторных процессов гематопоэза плаценты мыши и описываются самые последние данные, демонстрирующие, что плацента человека, подобно своему аналогу у мышей, также является источником гемопоэтических стволовых клеток и клеток предшественников в ходе всего развития.
Не млекопитающие виды позвоночных, такие как куры, рыбки данио и лягушки, имеют хорошо функционирующую гемопоэтическую систему в отсутствие плаценты (reviewed in Cumano and Godin, 2007; Dzierzak and Speck, 2008). Было предположено, что более одного источника необходимо для предоставления достаточных количеств HSCs для колонизации печени плода (Kumaravelu et al. 2002). Следовательно, плацента используется в качестве внешней HSC территории для предоставления больших количеств HSCs и предшественников, чем способны продуцировать YS и AGM? Вообще-то богатая факторами роста и гормонами, васкуляризованная плацентарная ниша способствует пролиферации HSCs, мигрирующих из AGM посредством пупочных сосудов в печень плода. Эта возможность подтверждается наблюдением на мышах, что HSCs становятся обнаружимыми в плаценте спустя день после появления и[ в AGM и их количества быстро снижаются опять же спустя день после того как останавливается продукция HSC в AGM (AGM прекращает свое существование после E12). Следовательно, так только продукция и миграция HSC в эмбрионах мыши заканчивается и печень плода полностью колонизируется, ток HSCs через плаценту также останавливается и HSCs здесь более не обнаруживаются. Также морфология плаценты, по-видимому, не изменяется драматически после того как снижается количество HSC на ст. E13. Т.о., может не происходить изменений в гемопоэтических условиях в плаценте, которые бы вызывали исчезновение HSCs. На самом деле, происходящие из плаценты мыши гемопоэтические предшественники, остаются многочисленными после E13 (Alvarez-Silva et al. 2003) и поддерживающие гематопоэз линии стромальных клеток выделяются из плаценты человека в ходе всего развития. Однако было бы интересно исследовать у мышей обладают ли происходящие из плаценты линии стромальных клеток на поздних стадиях развития той же самой поддерживающей способностью, как и линии стромальных клеток, продуцируемые на пике экспансии HSC в плаценте.
Др. возможность заключается в том, что HSCs возникают в плаценте. CD41+ гемопоэтические клетки обнаруживаются в плаценте в отсутствие клеточного обмена между разными тканями посредством циркуляции (Rhodes et al. 2008), а на ранних стадиях развития нормальной плаценты аллантоис и хорион обладают гемопоэтическим потенциалом (Corbel et al. 2007; Zeigler et al. 2006). Тот факт, что некоторые плацентарные HSCs обладают фенотипом, указывающим на эндотелиальное происхождение (Ottersbach and Dzierzak, 2005; Taoudi et al. 2005), подтверждает возможность, что некоторые HSCs происходят из плацентарного гемогенного эндотелия. Т.о., является ли плацента др. примером генерации HSC вместе с крупными сосудами плода ожидает подтверждения с помощью отслеживания клонов in vivo imaging. Плацента в качестве ниши HSC описана у мышей всего 5 лет назад и пока мало известно о клеточных и молекулярных механизмах регуляции гемопоэтической активности в этой ткани, особенно у человека. Как только некоторые из компонент ниш будут идентифицированы, станет возможным использование этой информации, чтобы специфически нарушать плацентарный гематопоэз и понять важность плаценты для гематопоэза у плода.
Гемопоэтическая система состоит из крупного массива дифференцированных кровяных клеток, включая эритроциты и клетки миелоидного и лимфоидного ряда. Эти зрелые кровяные клетки имеют ограниченный период жизни и постоянно замещаются за счет пролиферации и дифференцировки из очень небольшой кагорты плюрипотентных hematopoietic stem cells (HSC). В самом деле, HSC обладают способностью пополнять свой собственный компартмент (т.e., они демонстрируют самообновление ) и дифференцируются в клетки предшественники и зрелые кровяные клетки всех гемопоэтических клонов. У взрослых млекопитающих кровяные клетки генерируются прежде всего в костномозговых полостях некоторых костей. Принято считать. что HSC оказавшиеся во взрослом костном мозге возникли путем репликации и амплификации линии HSC, которая возникла в раннем онтогенезе, когда костного мозга еще не существовало.
Как и у всех позвоночных гематопоэз у человека начинается в желточном мешке (yolk sac (YS)) и затем временно действует в печени, прежде чем окончательно закрепиться в тимусе и костном мозге. Исследования, проведенные на др. видах, а именно мышах и курах, показали, что все гемопоэтические органы (печень, тимус и костный мозг) не продуцируют своих собственных гемопоэтических предшественников, а колонизируются внешними кровяными предшественниками (Le Douarin et al., 1984; Moore and Owen, 1967). Этот путь составляет основу преобладающей идеи, что YS является единственным местом генерации de novo кровяных клеток из HSC (Moore and Metcalf, 1970). Напротив, эксперименты на птицах позднее продемонстрировали, что дефинитивный гематопоэз происходит из предшественников, возникающих из собственно эмбрионов, расположенных в области, соседствующей с дорсальной аортой (rev.Dieterlen-Lievre, 1994). У млекопитающих доказательства внутриэмбрионоального происхождения гемопоэтических предшественников получены на эмбрионах мышей и человека. У мышей область aorta-gonad-mesonephros (AGM), территория, гомологичная той, что идентифицирована у птиц, и её зачаток paraaortic splanchnopleura (P-Sp), обладает гемопоэтическим потенциалом (rev. Dzierzak and Speck, 2008). В самом деле, клетки, экспрессирующие маркеры гемопоэтических предшественников присутствуют в дорсальной аорте (rev. Cumano and Godin, 2007). Мы участвовали в этом открытии путем идентификации в эмбрионах человека плотной популяции из HSC , появляющихся в ассоциации с вентральной стороной эндотелия аорты между 27th и 40th днем развития (rev.Tavian and Peault, 2005a).

The embryo proper as a site of blood cell generation


Первые доказательства существования прирожденной активности кровяных клеток внутри эмбриона человека получены группой L.Coulombel с использованием испытаний колоний с CD34+ клеток, очищенных от внеэмбрионального желточного мешка и внутриэмбриональных тканей (Huyhn et al., 1995). В этих условиях не-эритроидные предшественники преимущественно обнаруживались у эмбрионов, тогда как эритроидные предшественники были равномерно распределены. В частности, наивысшая пропорция не-эритроидных предшественников (включая высоко пролиферативные потенциальные клетки, HPP-CFC) присутствовала среди клеток, оставшихся после удаления печени, указывая, что внутриэмбриональная гемопоэтическая активность не является преимущественно печеночной (Huyhn et al., 1995). Присутствие внутри эмбриона компартмента предшественников, презентирующих HSC фенотип, было подтверждено нашей группой, которая идентифицировала плотную популяцию CD34+ ковяных клеток, приставшую к вентральной стороне эндотелия аорты (Fig. 1A) (Tavian et al., 1996). Эта популяция клеток обладает клеточной поверхностью и млекулярным фенотипом , типичным для примитивных гемопоэтических предшественников (CD45+, CD34+, CD31+, CD38-, негативных по клональным маркерам, GATA-2+, GATA-3+ , c-myb+, SCL/TAL1+ , c-kit+, flk-1/KDR+) (Labastie et al., 1998; Tavian et al., 1996). Кластеры гемопоэтических клеток появлялись точно у эмбрионов между 27th и 40th днём развития, что соответствовало 2-3 дням перед колонизацией печени CD34+ предшественниками (Tavian et al., 1999). Следовательно, тысячи гемопоэтических клеток hematopoietic были собраны в кластеры на эндотелии дорсальной аорты и вителлиновой артерии, указывая на существование в этом органе локальных микроусловий, которые могут регулировать клеточную судьбу, как в пространстве, так и времени. Ряд обстоятельных наблюдений уже сделан в этом отношении, такие как присутствие скоплений гладких актин-позитивных клеток с высокой экспрессией tenascin-C, указывающих на локальные изменения в мезодерме, расположенной под кластерами (Marshall et al., 1999; Tavian and Peault, 2005b).

The embryo is hemogenic even before the aorta forms


Возможность, что эти клетки происходят из кровяных островков YS скорее, чем генерируются локально внутри собственно эмбриона, была исключена исследованиями, предпринятыми на более ранних стадиях развития, когда кровь еще не циркулировала между YS и эмбрионом. Онтогенетический потенциал эмбриональных и YS-производных клеток человека, в терминах клона кровяных клеток, был проанализирован в новом многоступенчатом in vitro исследовании (, see Tavian and Peault,2005c). В этих условиях мы исследовали каждый компартмент перед и после ст. в 21 день, который отмечает начало циркуляции крови. Последовательно спланхноплевра (презумптивная дорсальная аорта), параортальная спланхноплевра и сама аорта были выделены и культивированы. Соответственно YSs были проанализированы в тех же самых условиях во всех экспериментах. С 27 по 40 день беременности, когда присутствовали внутрисосудистые кластеры HSC, аорта, как и ожидалось, давала долговременные культуры гемопоэтических клеток. Тот же самый потенциал однако, уже наблюдался в 19-дневной спланхноплевре (т.e., за 3 дня до начала циркуляции крови и за 1 неделю до обнаружения распознаваемых кластеров HSC в аорте). В завершение, гемопоэтические предшественники появлялись автономно в YS , также внутри собственно эмбриона человека из спланхноплевральной мезодермы (Tavian et al., 2001).

The embryo but not the yolk sac generates multipotent lymphomyeloid stem cells


Клетки, происходящие из этих двух независимых мест генерации стволовых клеток крови, внутриэмбриональной спланхноплевры и YS, культивировали на MS-5 линии стромальных клеток мышей, которые позволяли долговременное развитие как миэлоидных, так и лимфоидных предшественников человека. В этих условиях мы установили, что только желточный мешок генерирует клетки предшественники с ограниченной онтогенетической способностью, тогда как предшественники, возникающие автономно в презумптивной территории аорты, обладали многоклональным лимфо-миэлоидным потенциалом (Tavian et al., 2001). Следовательно, первые и единственные мультипотентные миэлолимфоидные стволовые клетки генерируются в спланхноплевре внутри собственно эмбриона и физически присутствуют внутри артерий туловища с 5-й недели развития. Эти клетки, следовательно, предположительно являются источником дефинитивного гематопоэза (Tavian et al., 2001).

Fig. 1. Hematopoietic stem cell clusters inside human embryonic arteries. (A) Cross sections of a 34-day human aorta (Ao) stained with the anti-CD34 (green) and anti-CD45 (red) antibodies. Arrows indicate the clusters of hematopoietic stem cells adhering to the ventral aspect of the aortic endothelium (white arrowhead). (B) Confocal images at higher magnification of the region included in the dotted white line in panel A show the changed morphology of endothelial cells underlying hematopoietic clustered progenitors (arrow).

Intraembryonic hematopoiesis: what is the origin of HSC?


Несмотря на достигнутый прогресс в понимании развития гемопоэтических стволовых клеток во время эмбриогенеза клеточные особенности популяции, ответственной за эту раннюю активность всё ещё остаются неизвестными. Предложено несколько гипотез.

Hemangioblasts or "hemogenic" endothelial cells?


Поскольку в примитивных сайтах появления кровяных клеток - желточном мешке и аорте - стволовые HSC находятся в тесной физической ассоциации с эндотелиальными клетками, то современная модель генерации гемопоэтических клеток придает особое значение онтогенетической связи между двумя клонами. В желточном мешке кровяные островки генерируются агрегатами мезодермальных клеток, которые дифференцируются как в гемопоэтические, так и эндотелиальные клетки. Одновременное появление этих двух клонов указывает на существование общего родоначального предшественника для эндотелиальных и гемопоэтических клеток - гемангиобластов (Murray, 1932). Дальнейшие и более недавние доказательства этих клональных взаимоотношений получены при наблюдении, что два типа клеток обладают рядом общих поверхностных маркеров и что нулевые мутации по ряду генов, таких как flk1 (Shalaby et al., 1997), затрагивают оба клеточные клона. противоположность желточному мешку, гемопоэтическая активность внутри эмбриона появляется, когда эндотелиальные клетки уже существуют, что затрудняет связь появления внутриэмбриональных кровяных клеток с популяцией гемангиобластов. Эти наблюдения заложили основу идее, что эндотелиальные клетки сами по себе могут играть главную роль в развитии кровяных клеток. Существование "hemogenic" эндотелия, который может давать гемопоэтические клетки, впервые было высказано в 1920 by Sabin (Sabin, 1920), и было недавно продемонстрировано для птичьего и мышиного внутриэмбрионального гематопоэза (de Bruijn et al., 2002; Jaffredo et al.,1998; Nishikawa et al.,1998; Pouget et al.,2006). Согласно этим сообщениям мы наблюдали, что также у эмбрионов человека эндотелиальные клетки, расположенные на вентральной стороне дорсальной аорты, обнаруживают морфологию, отличную от таковой эндотелия из дорсального сайта. На вентральном аспекте сайта нормальный слой эндотелиальных клеток, выстилающих просвет аорты, разрушается и замещается менее организованной популяцией округлых клеток (Fig. 1B). понуждаемые этими наблюдениями, мы отсортировали с помощью жидкостной цитометрии сосудистые эндотелиальные клетки от эмбриональных и плодных кровь-формирующих тканей человека и проанализировали их гемопоэтическую способность с помощью культивирования поверх слоя MS-5 стромальных клеток. В этом контексте, эндотелиальные клетки, отсортированные от от эмбриональной аорты человека между 27 и 40 развития - когда HSC присутствуют в этом регионе - давали мощный гематопоэз. Частота гематогенных эндотелиальных клеток в AGM, на данной стадии онтогенеза человека, прямо коррелировала с гемопоэтической активностью этой территории. Напротив, не обнаруживалось гемопоэтической активность в культивируемых эндотелиальных клетках, отсортированных от области AGM спустя 40 дней, когда HSC более не присутствовали в просвете аорты (Oberlin et al., 2002).

Fig. 2. Expression of BB9/angiotensin-converting-enzyme (BB9/ACE) in the human embryo. Cross sections through the dorsal aorta (Ao) in a 34-day embryo. BB9/ACE is expressed by hematopoetic CD34+CD45+ cell clusters associated with the endothelium on the ventral site of the aorta (arrowheads), as well as by underlying endothelial CD34+ cells (white arrowheads)

Alternative models: mesodermal precursors?


Эксперименты, описанные выше, указывают на то, что вентральные эндотелиальные клетки внутриэмбриональных артерий человека делятся и дифференцируются в предшественников кровяных клеток в источнике дефинитивного гематопоэза (Oberlin et al., 2002). Однако эндотелиальные CD34+ CD45- клетки, отсортированные от спланхноплевры человека на 24-26 день беременности - когда гемогенная способность существует in vitro, но кластеры аортальных HSC ещё отсутствуют - не дают потомства кровяных клеток в культуре. Напротив, кровь-формирующий потенциал у этих ранних эмбрионов полностью ограничен CD34- CD45- субнабором клеток (MT, personal observations). Это позволяет утверждать, что в спланхноплевральной мезодерме CD34 предшественники возможно детерминированы в отношении гемопоэтической судьбы, и что они д. мигрировать через периаортальную мезенхиму и служить источником HSC, ассоциированных с сосудистым эндотелием на ст. 27 развития (Tavian and Peault, 2005c).
Альтернатива гемогенному эндотелию была также подтверждена на эмбрионах мыши, базируясь на присутствии структур, потенциально участвующих во внутриэмбриональной генерации HSC - subaortic patches, SAPs -, расположенных ниже дна аорты (Bertrand et al., 2005; Manaia et al., 2000). Фенотип клеток, включенных в SAPs подтверждает, что гемогенная способность ограничена предшественниками с профилем экспрессии не-эндотелиальных антигенов (Bertrand et al., 2005; Manaia et al., 2000). Согласно этой модели, HSC д. генерироваться внутри SAPs, мигрировать в направлении дна аорты и достигать кровотока, чтобы колонизировать печень плода. Этот переход через вентральный эндотелий аорты д. оправдать присутствие гемогенного эндотелия, которые обнаруживается только на определенной ст. развития, когда HSC присутствуют в AGM (Oberlin et al., 2002; also reviewed in Cumano and Godin, 2007).

BB9/ACE (angiotensin-converting enzyme), a novel marker of HSC, can identify pre-hematopoietic precursors inside the human embryo


BB9 это моноклональные антитела (mAb), первоначально описанные по реакции в костном мозге взрослого человека на стромальные клетки и субпопуляцию CD34+ клеток, обладающих фенотипическими характеристиками незрелых предшественников, а именно, низкими до не обнаружимости уровнями CD38 и коэкспрессией CD90 и CD133 (Ramshaw et al., 2001).
В недавнем исследовании мы показали, что BB9, который использовался для распознавания соматической изоформы angiotensin converting enzyme (ACE/CD143), обладает реактивностью к примитивным гемопоэтическим клеткам на всех стадиях гемопоэтического онтогенеза, включая umbilical cord blood (UCB) и печень плода. Трансплантации NOD/SCID мышам продемонстрировали, что CD34+ BB9+ клетки из UCB, но не CD34+ клетки, лишенные экспрессии BB9, дают длительные трансплантаты мультиклональных геметопоэтических клеток человека и , следовательно, четко подтверждают, что BB9/ACE является bona fide маркером человеческих HSC (Jokubaitis et al.,2008).
В попытке отследить самые ранние предшественники внутриэмбриональной кровь-формирующей активности, мы недавно исследовали экспрессию BB9 у самых ранних эмбрионов человека. Мы наблюдали, что ACE также идентифицирует гемопоэтические кластеры (Fig. 2) , появляющиеся в вентральном эндотелии аорты на 4-5 неделе, а также соседние эндотелиальные клетки (Jokubaitis et al., 2008). Кроме того, BB9 идентифицировали небольшие количества клеток, вкрапленных в субаортальную мезодерму, которые не обнаруживали ко-локализации с CD34 или CD45, указывая тем самым на ангиогемопоэтический потенциал BB9-позитивных мезодермальных предшественников (Jokubaitis et al., 2008). Анализ, осуществленный даже на самых ранних стадиях развития человека согласуется с этой гипотезой (Sinka et al., submitted). В самом деле, начиная со стадии 19 и вплоть до 26 дня беременности, когда кластеры HSC ещё не сформировались внутри сосудистой стенки аорты, экспрессия BB9/ACE маркирует редкие CD34- CD45- клетки собственно эмбриона, вкрапленные в гемогенную часть P-Sp. Среди этих линий результаты, полученные при культивировании клеток, отсортированных от 24- до 26-дневных эмбрионов человека, показывают, что BB9+ , но BB9- клетки обладают гемопоэтической способностью (Sinka et al. submitted). В соответствии с этими наблюдениями, недавнее исследование эмбриональных стволовых клеток человека (hESC) показали, что hESC, происходящие из ACE+CD45-CD34+/- клеток являются общими с yolk sac-like предшественниками не только для эндотелия, но и также для примитивных и дефинитивных лимфо-гемопоэтических стволовых клеток человека (Zambidis et al., 2008).

Conclusions


Altogether, these findings put forth the concept that BB9/ACE, already accepted as a novel marker for very primitive HSC, could also mark pre-hematopoietic cells inside the human mesoderm, which would imply that definitive hematopoiesis arises inside the human embryo from intrinsic mesodermal stem cells identifiable with the BB9 antibody, and thereby expressing ACE. This pattern supports the hypothesis of the existence of a BB9+ CD34- CD45- hemangioblastic precursor cell that migrates from the P-Sp toward the ventral aorta, to give rise to BB9+ CD34+ CD45+ hematopoietic progenitors and underlying BB9+ CD34+ CD45- endothelial cells. In accord with such an interpretation, a recent work has shown, through lineage tracing approaches, that the endothelium lining the ventral wall of the aorta is responsible for HSC emergence in the mouse AGM and that this hemogenic endothelium is derived from a transient mesenchymal population (Zovein et al.,2008).


ESTELLE OBERLIN, BOUCHRA EL HAFNY , LAURENCE PETIT-COCAULT and MICHELE SOUYRI
Definitive human and mouse hematopoiesis originates from the embryonic endothelium: a new class of HSCs based on VE-cadherin expression
Int. J. Dev. Biol. 54: 1165-1173 (2010)
Hematopoietic stem cells (HSCs) возникают сначала на третьей неделе развития человека внутри развивающихся сосудов желточного мешка и независимо в стенке эмбриональной аорты неделю спустя. HSCs, продуцируемые в желточном мешке, и в укороченных артериях туловища мигрируют в и временно колонизируют печень плода и затем костный мозг, их постоянное место расположения. В данное время происхождение HSCs человека всё ещё спорно; одной из главных гипотез является то, то они генерируются гемогенными эндотелиальными клетками (ECs). Для подтверждения эндотелиального происхождения HSCs у эмбрионов человека мы очищали ECs от желточного мешка или укороченных артерий и установили. что они способны продуцировать кровяные клетки in vitro. Затем мы установили, что некоторые из HSCs , присутствующие в печни плодов человека ко-экспрессируют vascular endothelial (VE)-cadherin, эндотелиальный маркер, CD45, pan-hematopoietic marker, и CD34, общий эндотелиальный и гемопоэтический маркер, и продемонстрировали, что эти HSCs обладают двойным гемато-эндотелиальным фенотипом и обнаруживают чрезвычайно высокий уровень самообновления и пролиферативного потенциала. Более того, трансгенные модельные мыши, базирующиеся на VE-cadherin цис-регуляторных элементах, которые были получены, чтобы отслеживать судьбу VE-cadherin эксперссирующих клеток, позволили нам четко продемонстрировать, что большая часть HSCs взрослого костного мозга происходит из VE-cadherin родоначальника. В целом наши исследования строго подтверждают, что, по крайней мере, часть гемопоэтической системы как человека, так и мыши возникает из подобных эндотелию родоначальников.

Fig. 4. Generation of the VEC mice and LacZ analysis of VECR embryos. (A) Schematic representation of the VE-cadherin promoter+enhancer driven Cre recombinase transgene (VEC), and of the obtention of the double transgenic VECR mice. (B) Whole-mount X-gal staining of E9.5, E10.5 and E11.5 VECR embryos shows progressive LacZ expression in intersomitic vessels, endocardium, as well as in the aorta (Ao), fetal liver (FL), yolk sac (YS) and umbilical (UA) and vitelline (not shown) arteries at E10.5. Down panel shows representative illustrations of 7.5 µM cryosections of whole mounted E10.5 embryo and yolk sac, focused on UA, FL, Ao and YS respectively. Boxed areas are magnified. (C) Whole-mount X-gal staining of placenta at E10.5, 11.5, 12.5. 7.5 µM cryosections of E12.5 placenta showing that LacZ mainly labels the big vessels of the chorionic plate.
Сайт создан в системе uCoz