Небольшой размер обычных отоконий вместе с паттерном их распределения в saccule и utricle, является критическим для генерации оптимальной массы поверх каждой индивидуальной волосковой клетки, это существенно дя её стимуляции. Т.о., образование гигантских минералов у Slc26a4^loop/loop мутантов ведет отличающейся массе поверх сенсорных клеток. В то время как некоторые волосковые клетки лишены какого-либо груза отоконий, тогда как др. волосковые клетки испытывают избыточное давление гигантских камней. Поэтому обе популяции волосковых клеток лишены своего нативного источника стимуляции и не могут выполнять свою жизненно важную роль в вестибулярной функции и перцепции. Более того, гигнатские минералы у Slc26a4^loop/loop мышей не могут более ограничиваться saccule или utricle, в сравнении с нормальными отокониями. Эктопические гигантские камни были обнаружены в др. компонентах вестибулярной системы, таких как полукружные каналы и их гребешки. Изменчивость дефектного вестибулярного поведения Slc26a4^loop/loop мутантных мышей варьирует от средней до тяжелой степени и может частично объясняться варьирующим положением сдвинувшихся минерализованных тел. Было бы интересно протестировать эту гипотезу и выяснить возможные корреляции между позицией камня и специфическим вестибулярным дефектом. Смещение отоконий у людей связанны с BPPV и ведут к тяжелым головокружениям, неустойчивости и тошноте (35). Тяжелые эпизоды головокружения (vertigo) обычно короткой продолжительности и обусловливаются положением пациента. Распространенным способом лечения BPPV является маневрирование свободно плавающими отокониями вне полукружных каналов и гребней, доставляющие пациентам облегчение (36-38). Следовательно, Slc26a4^loop/loop мыши могут быть тестироаны в качестве платформы для оценки пионерских терапевтических подходов в отношении вестибулярной дисфункции как результата смещения отоконий.

Образование отоконий зависит от органических и неорганических компонентов, которые секретируются во внеклеточную жидкость и собираются, чтобы создать мириады отоконий. Сочетанная экспрессия генов, участвующих в формировании отоконий, вместе с пространственным и временным изобилием химических элементов, является критическим для собственно сборки отоконий. Следовательно, истощение компонентов органической и неорганической частей может приводить к дефектам отоконий. Напр., делеция PMCA2 Ca^{2 +} канала, ключевого игрока в установлении гомеостаза кальция в эндолимфе, ведет к отсутствию отоконий (39). Напротив, делеция otoconin-90, матричного белка отоконий млекопитающих, ведет к образованию гигантских calcite минералов, лишенных основной органической фракции отоконий (9, 40).

Pendrin, как известно, экспрессируется в переходном слое клеток, окружающем сенсорный эпителий saccule и utricle (41). Pendrin является членом семейства SLC транспортеров и транспортирует несколько отличающихся ионов, включая including Сl^-, I^-, HCO₃ и formate (42-44). Во внутреннем ухе измерения pH эндолимфы в utricle Pds^-/- мышей выявили ацидификацию жидкости (45). После этих исследований было предположено, что pendrin действует как Сl^-/НСО₃^- транспортер во внутреннем ухе, который активно секретирует bicarbonate в эндолимфу, который нейтрализует H⁺ и участвует в буфферизации нормального физиологического pH. Следовательно, контроль соотв. уровней pH является критическим для сборки и стабилизации минералов. Pendrin может также участвовать в формировании отоконий путем поставки HCO₃^-, это является важным для образования кристаллов calcite (CaC0₃) отоконий. Однако обширный рост минералов, наблюдаемый в utricle Slc26a4^loop мутантов в раннем развитии указывает на то, что резервуар bicarbonate для сборки отоконий не уменьшен существенно. Предполагаемая компенсация потери bicarbonate достигается за счет активности carbonic anhydrase, благодаря продукции ею HCO₃^- и H⁺ из C0₂ и H₂0. Этот энзим, как известно, широко экспрессируется в сенсорном и несенсорном эпителии utricle и saccule (47, 48).

Данная работа демонстрирует, как missense мутация (S408F) внутри очень консервативной области белка pendrin ведет к нарушению транспортной активности. Показано также, что эта мутация также ведет к дифференциальным дефектам образования отоконий между utricle и saccule мутантов Slc26a4^loop. Хотя аномальные гигантские минералы calcite всегда находятся в Slc26a4^loop/loop utricles, постепенные изменения состава минералов наблюдаются и в saccule, с образованием calcium oxalate камней у взрослых мышей. Эти гигантские минералы, независимо от формы и состава, не могут более выполнять свою витальную и элементарную роль по стимуляции волосковых клеток и вестибулярной функции. Интересно, что дефекты этой дифференциальной минерализации возникают несмотря на сходный паттерн экспрессии pendrin в saccule и utricle. Наши находки также подтверждают, что минералы в utricle и saccule подвержены действию разных эндолимфатических сред. Мы предполагаем, что устранение активности pendrin у Slc26a4^loop/loop мутантов ведет к разным уровням подкисления в каждом из этих двух компартментов. Следовательно, анатомические и гистологические отличия между utricle и saccule, вместе с pH-чувствительными белками, которые дифференциально экспрессируются в этих maculae, могут быть ключом к пониманию механизма, лежащего в основе сложной патологии.

Initial Formation of Giant Calcium Carbonate Stones in Slc26a4^loop/loop Vestibule. Сходство между utricle и saccule поразительно. Обе чувствительны к линейному ускорению, имеют отоконии в качестве инерционной массы для инициации стимуляции и содержат один и тот же тип сенсорных волосковых клеток. Однако, некоторые характерные анатомические и гистологические особенности уникальны для каждой из этих maculae. Различия между utricle и saccule проиллюстрированы (Fig. 8, top panel) и затрагивают два основных аспекта. Во-первых, эндолимфа utricle соединяется с таковой полукружных каналов и crista ampullaris и имеет общую циркуляцию жидкости с вестибулярными компонентами в противоположность saccule, который лишен прямого соединения. Во-вторых, выраженным различием является огромное изобилие пигментированных вестибулярных темных клеток в utricle и отсутствие их в saccule.

Предыдущие исследования Pds^-/- мышей показали, что ацидификация вестибулярной эндолимфы ингибирует pH-чувствительные кальциевые каналы, TRPV5 и TRPV6 (46, 49). TRPV5 и TRPV6 экспрессируются в вестибулярных темных клетках и в эпителиальных клетках эпителия протоков полукружных каналов (50, 51). Устранение ресорбции кальция этими каналами ведет к увеличению уровней кальция в эндолимфе, которая, которая омывает utricle. В обычных условиях концентрация кальция в эндолимфе очень низкая по сравнению с др. физиологическими жидкостями. Низкий уровень кальция существенен для аппарата механотрансдукции сенсорных волосковых клеток (52). Одним из способов поддержания этих условий это абсорбция кальция окружающими эпителиальными клетками. Др. способ контроля уровней кальция заключается в рекрутировании кальция на формирующиеся отоконии, которые, как полагают, являются способом создания резервуара кальция (53). Ключевым игроком в этом отношении является 0c90, который секвестрирует ионы кальция. У мышей дикого типа 0c90 секретируется в эндолимфу до образования зародышей отоконий и участвует в росте этих крошечных минералов (1, 9). При нормальных условиях секретируемые количества 0c90 конкурируют с обычно низким уровнем ионов кальция и поэтому существенны для инициальной нуклеации отоконий. Уровень экспрессии 0c90 и экспрессии в эндолимфу мутантов Slc26a4^loop/loop скорее всего не затрагивается мутацией pendrin S408F. Однако обнаруживается драматическое увеличение количества Oc90, которое обнаруживается в гигантском минерале Slc26a4^loop/loop мышей по сравнению с отокониями дикого типа. Это расхождение может быть объяснено предполагаемыми более высокими уровнями кальция в эндолимфе мутантов Slc26a4^loop/loop, это ведёт к быстрому отлавливанию любых остаточных 0c90 в гигантский кристалл.

Итак, подъем уровней кальция в эндолимфе внутри общего компартмента из utricle, cristae и полукружных каналов, ведет к дифференциальным концентрациям кальция в utricle и saccule, с более высокими уровнями кальция в utricle. Образование гигантских calcitic камней в utricle и значительно меньших камней в saccule может быть объяснено различиями в концентрации кальция. Более того, это



FIGURE 8. Proposed working model for calcium oxalate stone formation in the inner ear. The anatomical differences (top panels) between the utricle (green) and saccule (red) are illustrated and summarized in a table. A, under normal conditions, otoconia nucleation begins around E16.5 and reaches its Saturation at P7. To support the biomineralization events, otoconia proteins such as 0c90 are secreted to the endolymph prior to and during otoconia nucleation and maturation. B, in Slc26a4loop mice, the organic fraction of otoconia, including 0c90, is secreted normally to the extracellular space, but the homeostasis of the endolymph is impaired. Pendrin activity is depleted due to the S408F mutation, and the lack of HC03~ supply leads to acidification of the endolymphatic fluids. This acidification abolishes the reabsorption of calcium by the pH-sensitive calcium channels, TRPV5 and TRPV6 (46). The localization of TRPV5 and TRPV6 in the semicircular canal duct epithelium and in the vestibular dark cells, which share fluid circulation with the utricle, leads to a higher calcium concentration in the utricle as compared with the saccule. The excess calcium ions in the endolymph of the utricle are sequestered by large amounts of Oc90 and deposited into oversized calcite minerals, whereas in the saccule, significantly smaller minerals are formed. C, at progressive ages, wild-type otoconia are maintained with low calcium turnover, whereas in Slc26a4iocip mice, a differential process between saccule and utricle occurs. In the utricle, giant calcitic minerals reside all along the lifespan of the mouse. In the saccule, a gradual change in mineral morphology and composition from calcite into highly disordered calcite at the age of 7 months is observed. The ultrastructural morphology of the highly disordered mineral, a pitted and fissured surface, resembles morphology of calcite mineral after treatment with an acidic solution. Moreover, this stone contained domains that resembled the morphology of calcium oxalate in the form of weddellite. Between the age of 7 and 10 months, the highly disordered calcite dissolved, and giant calcium oxalate minerals in the form weddellite were generated. The symmetrical morphology of the weddellite resembles the classical calcium oxalate geological mineral, which is more stable at lower pH as compared with the calcium carbonate. In summary, constant acidification of the saccule leads to dissolution of the calcite mineral that is tied with favorable conditions for calcium oxalate stone formation in the inner ear.

постулируемое отличие в уровне кальция может быть связано с наблюдением, что одно гигантское минерализованное тело формируется у мутантов вместо множества маленьких униформных размеров и формы отоконий у мышей дикого типа. Вполне возможно, что поскольку высокие концентрации кальция в эндолимфе Slc26a4^loop/loop, то первый зародившийся отоконий продолжает быстрый рост и секвестрирует большую часть кальция. Любые др. маленькие кристаллы, которые могут впоследствии формироваться д. расстворяться из-за нехватки кальция в их микроокружении.

Данные, полученные в этом исследовании. ограничены постнатальными стадиями. Было предложено несколько моделей в литературе раннего зарождения и созревания отоконий (5, 54). Одна модель предполагает секрецию пузырьков с субстанциями отоконий в качестве платформы засеивания (55, 56), вторая модель исключает участие пузырьков в качестве предшественников отоконий и предполагает, что perimacular засеивание происходит вследствие временной и пространственной секреции индивидуальных компонентов отоконий (54). Стержневая структура гигантских calcitic минерализованных тел у мутантов Slc26a4^loop/loop указывает на то. что эти гигантские камни формируются из одного стержневого зародыша (nucleation core) с продолжающимся ростом скорее, чем из множественной сборки из тысяч зрелых частиц отоконий. Наблюдение E15.5 utricles показало, что аберрантный гигантский минерал уже существует на этой стадии (data not shown) и это подтверждает наше предположение. Дальнейшая характеристика ступеней раннего развития, инициирующего рост этих гигантских минералов, может предоставить важные указыния в отношении моделей развития отоконий.

Drastic Changes in Mineral Morphology and Composition in Slc26a4^loop/loop'Saccule Свойства минералов затрагиваются разными изменениями окружения, включая температуру и pH. Кинетика распада минерала зависит от уровней pH, который влияет на жесткость его поверхности и микроструктуру (33). Как следствие циркуляции эндолимфы в utricle, объём эндолимфы, которая омывает utricle, больше, чем таковой для saccule. Следовательно, снижение pH эндолимфы, сопровождающее аномальную активность pendrin, предположительно более умеренное в utricle, где эндолимфа цикулирует часто. Однако в saccule Slc26a4^loop/loop мутантов, которые лишены этой выраженной циркуляции, д. возникать более низкий уровень pH. Мы выявили прогрессивное постепенное изменение в морфологии и составе минерала в saccule мутантов. Более того, структура этих минералов показала, что постепенное снижение pH эндолимфы saccule происходит с возрастом. У новорожденных, небольшие calcium carbonate минералы редко развиваются в форме calcite. Однако в возрасте 7 мес., появляется гигантский, сильно неупорядоченный calcium carbonate минерал в форме calcite. Ультраструктурный анализ этого минерала выявил изъеденную с трещинами поверхность, напоминающую картину calcite минерала после воздействия кислым раствором. Важно, что этот камень содержит weddellite. В возрасте 10 мес. сильно неупорядоченный calcite более не обнаруживается, а вместо него гигантский oxalate камень в форме weddellite. Биосинтез oxalate из carbonate не известен in vitro. Поэтому мы полагаем, что сильно неупорядоченный calcite является нестабильным из-за постоянного подкисления (acidification) среды и это ведет к растворению минерала. Следовательно, среда эндолимфы, обогащенная ионами кальция, который соединяется с ионами oxalate и в конце концов откладывается как кристалл из calcium oxalate в форме weddellite. Симметричная морфологияe weddellite напоминает классический геологический минерал calcium oxalate, который боле стабилен при низком pH по сравнению с calcium carbonate. Т.о., acidification жидкости saccule способствует образованию минерала calcium oxalate (summarized in Fig. 8). Pendrin способен транспортировать formate, но не oxalate (42). Мы предполагаем, что S408F мутация может менять сродство pendrin транспорта к oxalate, который химически близкородственен formate. Мы проделали дополнительные эксперименты с помощью fast fluorometric подхода, чтобы протестировать эту гипотезу, что мутация S408F не наделяет новой функцией транспорта oxalate с помощью белка pendrin in vitro (data not shown). Образование минерала calcium oxalate также известно при патологии почек и объясняет более 80% почечных камней (57). Т.о., поскольку pendrin широко экспрессируется в собирающих канальцах кортекса почек (58), мы исследовали возможность образования почечных камней, используя окрашивание Pizzolato's отложений оксалатов (59). Гистологический анализ Slc26a4^loop/loop почек в возрасте 10 мес. не выявил накопления оксалатных камней (data not shown). У здоровых индивидов большинство кристаллов, которые образуются в почечных канальцах удаляются с мочой. Однако во внутреннем ухе закрытый заполненный жидкостью компартмент, лишенный циркуляции жидкости с др. системами тела. Поэтому когда кристаллы оксалата откладываются во внутреннем ухе, то они остаются в эндолимфе и их накопление и агрегация неизбежны.