У многих эукариот aminoglycerophospholipids PS, PE и PC составляют 75-80% от общего количества glycerophospholipids, обнаруживаемых внутри клетки (van Meer et al., 2008). Т.к. митохондрии обладают синтетической способностью, чтобы синтезировать весь пул PE, необходимый для клеточного роста (Birner et al., 2001), то приток PS в митохондрии и его последующее decarboxylation и экспорт в виде PE, может быть ответственен за биосинтез большинства glycerophospholipids, присутствующих во всех клеточных мембранах. Эта динамичная роль митохондрий в качестве источника фосфолипидов обычно недооценивается. Роль митохондрий в экспорте фосфолипидов верна и для эукариот иных, чем дрожжи. Клетки млекопитающих также могут продуцировать большинство от всех PE посредством митохондриального пути (Voelker, 1984).
Дифференциальная локализация энзимов путей биосинтеза фосфолипидов среди разных органелл и разных компартментов мембран внутри одной органеллы безусловно определяет потребность в экстенсивной внутриклеточной доставке липидов (Fig. 2, B and C). Должны существовать специфические механизмы, гарантирующие транспорт фосфолипидов из ER в митохондрии и между наружной и внутренней митохондриальными мембранами. Однако мы только начинаем понимать, как осуществляется подобный транспорт и как он регулируется.
Транспрот фосфолипидов в и внутри митохондрий, по-видимому, осуществляется благодаря тесному контакту мембран скорее, чем везикулярным путям. Тесное соединение двух мембран может облегчить непосредственный переход липидов между двумя слоями в регионах позитивного изгиба мембран или может позволять доставку липидов с помощью еще не идентифицированных переносчиков растворимых липидов или с помощью белковых комплексов, которые соединяют мембраны (Voelker, 2009). Межмембранный обмен липидами может также обеспечиваться посредством стабилизированных состояний полуслияния, которые могут обеспечивать непрерывность между листками обеих мембран, но доказательства такого механизма отсутствуют.
Tethering of ER and mitochondrial membranes.
Транспорт фосфолипидов между мембранами ER и митохондрий происходит в специализированных фракциях ER, которые тесно ассоциированы с митохондриями (Voelker, 1990) поэтому мы назвали их mitochondria-associated membranes (MAMs; Vance, 1990; Ardail et al., 1993; Gaigg et al., 1995; Shiao et al., 1995). MAMs обогащены определенными липидами и различными энзимами биосинтеза фосфолипидов, включая PSS-1 (PS synthase-1), FACL4 (long-chain fatty acid-CoA ligase type 4; Vance, 1990; Rusinol et al., 1994; Gaigg et al., 1995) и Ale1 acyltransferase (Riekhof et al., 2007). Прямые доказательства, что транспорт фосфолипидов использует MAMs, получены в исследованиях in vitro, которые показали, что транспорт PS из MAMs в митохондрии происходит более эффективно, когда MAMs, скорее, чем основная масса ER мембран, смешивается с митохондриями (Gaigg et al., 1995). Хотя и независимый от АТФ, транспорт, по-видимому, регулируется с помощью ubiquitination. Генетический скрининг у дрожжей по мутациям, затрагивающими транспорт PS в митохондрии, привел к идентификации F-box белка Met30, E3 ubiquitin ligase (Schumacher et al., 2002). Met30 убиквитинирует и тем самым инактивирует транскрипционный фактор Met4, приводя к усилению транспорта PS из MAMs в митохондрии (Schumacher et al., 2002; Voelker, 2009). Однако нижестоящие мишени для Met4 неизвестны.
Транспорт фосфолипидов из MAM-производных пузырьков в митохондрии, как показано, частично чувствителен к protease, указывая тем самым, что мембранные белки из ER или митохондрий испускаются в цитозоль, обеспечивая взаимодействие между двумя органеллами (Vance, 1991; Achleitner et al., 1999). Электронная томография интактных клеток выявило тесные соприкосновения ER мембран и митохондрий с относительно определенным разделяющим пространством примерно в 10-25 nm (Csordas et al., 2006). Некоторые белки, как полагают, участвуют в связывании мембран ER-митохондрии в клетках млекопитающих (Szabadkai et al., 2006; de Brito and Scorrano, 2008), но доказательства непосредственной роли в поставке фосфолипидов еще не описаны ни для одного из этих белков. Напротив, прямые доказательства подтверждают роль макромолекулярных белковых мостиков в транспорте фосфолипидов между органеллами у дрожжей (Fig. 3). Подходы синтетической биологии с использованием искусственных белков, прикрепляющихся к мембранам, привели к идентификации Mdm12 в качестве важного компонента для взаимодействия ER и митохондрий (Kornmann et al., 2009). Mdm12 ассоциирует с наружной мембраной митохондрий (Berger et al., 1997; Kornmann et al., 2009) и образует ансамбли с Mmm1, гликозилированным белком мембраны ER, и с белками наружной мембраны митохондрий Mdm10 и Mdm34 (Boldogh et al., 2003; Youngman et al., 2004; Kornmann et al., 2009). Поразительно, но клетки, лишенные индивидуальных субъединиц этого комплеса, который был назван как ER-mitochondria encounter structure (ERMES) комплекс (Kornmann et al., 2009), обнаруживают пониженные уровни митохондриального PE и CL, указывая тем самым, что ERMES структуры необходимы для обмена фосфолипидами в местах контактов ER-митохондрии. Соответственно, превращение PS в PE и PC замедлялось в клетках, лишенных компонентов ERMES (Kornmann et al., 2009). Было бы интересно установить, функционирует ли ERMES комплекс исключительно как мембранная связка, гарантирующая тесное соприкосновение ER и митохондриальных мембран или компоненты этого комплекса вносят активный вклад и в транспорт фосфолипидов.
Figure 2.
Figure 3.
A multiprotein complex involved in lipid movement and metabolism between the ER and mitochondria in yeast. A tethering complex composed of an integral ER glycoprotein (Mmm1) and three mitochondria-associated proteins (Mdm34, Mdm10, and Mdm12) promotes and stabilizes interactions between the two membranes affecting import of PS into mitochondria and the export of PE from the mitochondria. Ups1/PRELI-like proteins (Ups1, Ups2, and Ups3) regulate the accumulation of CL and PE within mitochondria and might be involved in intramitochondrial lipid movements. IM, mitochondrial inner membrane; OM, mitochondrial outer membrane.
Роль ERMES комплекса в соприкосновении ER-митохондрий ставит вопросы о функциях, ранее ассоциированных с субъединицами этого комплекса (Boldogh et al., 2003; Meeusen and Nunnari, 2003; Meisinger et al., 2004). Все компоненты были первоначально описаны, как необходимые для наследования митохондрий и для поддержания морфологии митохондрий. Вполне возможно, что эти фенотипы, вызываемые нарушениями в уровнях митохондриальных фосфолипидов, которые влияли на структуру и транспорт митохондрий. Сходным образом, сайты контактов ER-митохондрии, по-видимому, контролируют и др. митохондриальные функции, такие как стабильность митохондриальной ДНК (mtDNA). Расположение на ER локализованной субъединицы ERMES Mmm1 перекрывается с расположением mtDNA nucleoids (Hobbs et al., 2001), а клетки, лишенные ERMES комплекса теряют mtDNA (Meeusen and Nunnari, 2003). Однако необходимо отметить, что субъединицы ERMES комплекса могут быть частью др. белковых комплексов выполнять независимые функции. В самом деле, Mdm10 , как было установлено, является также составной частью комплекса sorting and assembly machinery (SAM), который обеспечивает инсерцию ?-barrel белков в митохондриальную наружную мембрану (Meisinger et al., 2004). Присутствие Mdm10 в ERMES и SAM комплексах может предоставлять способ баланса накопления фосфолипидов и биогенеза белков в митохондриях.
Intramitochondrial lipid trafficking.
Относительно мало известно о том, как вновь импортированные фосфолипиды или предшественники липидов транспортируются в митохондрии. Т.к. фосфолипиды или импортируются из ER или синтезируются на наружной или внутренней поверхности внутренней мембраны, то д. существовать механизмы, делающие возможным перемещения через бислой из одного листка в др. Такие перемещения, которые энергетически неблагоприятны, из-за присутствия полярных головных групп, в целом облегчается с помощью предназначенных для этого энзимов, обычно наз. flippases. Однако известно только, что митохондриальная flippase это PLS3 (phospholipid scramblase 3; Liu et al., 2003), которая катализирует flipping через бислой CL
in vitro (Liu et al., 2008). PLS3 модулирует уровни CL, экспозированного на митохондриальной поверхности, и может играть важную роль во время апоптической реакции (Fig. 4 C; Liu et al., 2008; Ndebele et al., 2008; see CL and apoptosis).
Figure 4.
The role of CL in mitochondrial processes. (A) CL (depicted in red) affects mitochondrial energy production and is required for dimerization and optimal activity of the AAC and the formation of respiratory chain supercomplexes. (B) Assembly and activity of protein translocases in the outer (TOM) and inner membrane (TIM22 and TIM23 complexes), the SAM complex in the outer membrane, and the assembly of TIM23 complex with the mitochondrial import motor (PAM complex) is supported by CL. (C) Various roles of CL during apoptosis. (1) Cytochrome c (Cyt c) binds to CL in the inner membrane. (2) Release of cytochrome c upon oxidation of CL. (3) Pro-caspase-8 (pro-8) binds to the surface of mitochondria, oligomerizes, and undergoes autocatalytic processing in a CL-dependent manner. (4 and 5) Bid cleavage to truncated Bid (t-Bid) by pro-caspase-8 (4) and activation and oligomerization of Bax/Bak is stimulated by CL (5). (6) PLS3 allows export of CL from the inner to the outer mitochondrial membrane. (D) CL affects fusion of mitochondrial outer and inner membranes. The phospholipase MitoPLD converts in trans CL into PA (depicted in red), triggering the fusion of outer membranes. CL in the inner membrane stimulates oligomerization and GTP hydrolysis of short Mgm1/OPA1 isoforms. IM, mitochondrial inner membrane; OM, mitochondrial outer membrane.
Транспорт фосфолипидов между наружной и внутренней митохондриальными мембранами, как полагают, осуществляется подобно транспорту белков, в местах контактов между мембранами (Ardail et al., 1991; Simbeni et al., 1991). Эксперименты с мутантными CHO клетками идентифицировали вариант с повреждением транспорта PS между наружной и внутренней митохондриальными мембранами, но ген, ответственный за этот дефект ещё не установлен (Emoto et al., 1999). Два белка, mitochondrial creatine kinase (MtCK) и nucleotide diphosphate kinase (NDPK-D) облегчают транспорт CL между липосомами с липидным составом, напоминающим тот, что присутствует в местах контактов (Epand et al., 2007). Однако, значение этого пути in vivo остается неизвестным.
Недавняя идентификация консервативных белков в межмембранном пространстве, которые регулируют накопление CL и PE в митохондриях, может предоставить новый намек на механизм транспорта фосфолипидов через этот компартмент. Ups1 первоначально был идентифицирован, как затрагивающий процессинг dynamin-like GTPase Mgm1 у дрожжей (Sesaki et al., 2006), а позднее было показано , что он регулирует уровнь CL в митохондриях (Osman et al., 2009a; Tamura et al., 2009). Ups1 относится к законсервированному семейству Ups1/PRELI белков, которые характеризуются присутствием консервативного MSF? домена (originally identified in yeast Msf?) с неизвестной функцией (Dee and Moffat, 2005). Гомолог Ups1, наз. Ups2 или Gep1, регулирует накопление PE в митохондриях (Osman et al., 2009a; Tamura et al., 2009). Хотя уровни PE снижены в отсутствие Ups2, избыточная экспрессия Ups2 снижает CL, подчеркивая скоординированную регуляцию PE и CL с помощью этих консервативных регуляторных белков. Соответственно делеция UPS2 восстанавливает нормальные уровни CL у Ups1-дефицитных дрожжевых клеток. Два недавних исследования идентифицировали Mdm35 как общий партнер по связыванию для Ups1 и Ups2 в межмембранном пространстве, это делает возможным молекулярное объяснение скоординированной регуляции CL и PE в митохондриях (Potting et al., 2010; Tamura et al., 2010). Mdm35 связывание гарантирует митохондриальный импорт Ups1 и Ups2 и защищает обла белка от протеолиза. Очевидно, что и Ups1 и Ups2 являются от природы нестабильными белками и деградируют с помощью i-AAA протеазы Yme1 и Atp23 в клетках дикого типа даже в нормальных условиях роста (Potting et al., 2010). Следовательно, вполне возможно, что система контроля качества митохондрий влияет на накопление CL и PE в митохондриях, путем регуляции стабильности Ups1-подобных белков. Строгая консервация всех компонентов регуляторного циркуита и измененные уровни PE в митохондриях, дефицитных по i-AAA protease (Nebauer et al., 2007) указывают в этом направлении.
Однако молекулярная функция Ups1 и Ups2 остается спорной. Поскольку снижены уровни PE в митохондриях в отсутствие Ups2 были обусловлены снижением стабильности скорее, чем измененным синтезом PE (Osman et al., 2009a), Ups2 может регулировать экспорт PE из митохондрий. Возникает интересная возможность, что перенос липидов между внутренней и наружной митохондриальными мембранами, контролируемый с помощью Ups1/PRELI-like белков, детерминирует состав фосфолипидов в митохондриальных мембранах.
The role of CL in mitochondria
Хотя исследования функциональных ролей фосфолипидов внутри митохондрий затруднены из-за их широкого распределения между разными клеточными мембранами, преимущественная локализация CL в митохондриях позволяет идентифицировать всё увеличивающееся количество митохондриальных процессов, зависимых от этого липида и оценивать патологии, ассоциированные с альтерациями метаболизма CL и дисфункцией митохондрий (Chicco and Sparagna, 2007; Joshi et al., 2009). Уникальная, димерная поперечно связанная фосфолипидная структура CL влияет на стабильность и активность различных мембранных белковых комплексов и переносчиков метаболитов (Fig. 4; Houtkooper and Vaz, 2008). CL молекула присутствуют в кристаллической структуре present ATP/ADP carrier (AAC) и в респираторных комплексах III и IV и , как было предположено, выполняют важные структурные роли (Lange et al., 2001; Pebay-Peyroula et al., 2003; Shinzawa-Itoh et al., 2007). В самом деле, респираторные сверхкомплексы, состоящие из комплексов III и IV , дестабилизируются в митохондриях, лишенных CL (Pfeiffer et al., 2003; Claypool et al., 2008b). Сходным образом, димеры из AAC и др. AAC-содержащих комплексов диссоциируют в CL-дефицитных митохондриях (Claypool et al., 2008b). Эти примеры иллюстрируют важность CL для биогенетических функций; но, кроме того, последние исследования показали, что CL оказывает более широкое влияние на физиологию митохондрий.
CL and protein import into mitochondria.
Огромное большинство митохондриальных белков кодируются в ядре и импортируются в органеллу посредством гетероолигомерных белковых translocases, располагающихся на внутренней и наружной митохондриальной мембранах (Schmidt et al., 2010). Несколько независимых исследований показали, что сборка и функция этих TIM (translocase of the inner mitochondrial membrane) и TOM (translocase of the outer mitochondrial membrane) комплексов зависит от CL (Fig. 4 B).
Tam41 (translocator assembly and maintenance protein 41) был идентифицирован как новый митохондриальный матричный белок, который необходим для интеграции TIM23 комплекса на внутренней мембране, и его функционального взаимодействия с митохондриальным мотором импорта PAM (presequence translocase-associated motor; Gallas et al., 2006; Tamura et al., 2006). Последующие исследования приписали эти дефициты потере CL в отсутствие Tam41 (Kutik et al., 2008). Сходным образом взаимодействие TIM и PAM комплексов нарушено в митохондриях, которые лишены CL synthase Crd1 или Ups1 (Kutik et al., 2008; Tamura et al., 2009). Интересно, что изменение электрофоретической подвижности др. протеин translocase внутренней мембраны, TIM22 комплекса, обеспечивающего инсерцию в мембрану белков переносчиков метаболитов, наблюдалось, когда анализировали ?crd1 и ?tam41 митохондрии, это может указывать на изменение сборки из translocase или на специфическую ассоциацию CL молекул с этим комплексом (Kutik et al., 2008). Независимо от этого, становится ясным из этих исследований, что пониженный импорт белков в CL-дефицитные митохондрии не просто следствие измененной биоэнергетики и сниженного мембранного потенциала поперек внутренней мембраны, а скорее отражает специфическую потребность в CL для функциональной целостности аппарата импорта в митохондрии.
Это мнение подтверждается недавним наблюдением, что уровни CL также регулируются протеин translocases в наружной мембране (Gebert et al., 2009), подтверждая ранние наблюдения, что импорт белков в митохондрии может быть ингибирован хим. соединениями, соединяющимися с кислыми фосфолипидами (Eilers et al., 1989) и нарушен в CL-дефицитных дрожжевых клетках (Jiang et al., 2000). Сборка важного рецептора Tom20 с TOM комплексом, также как и организация SAM комплексов, которые обеспечивают сборку
?-barrel белков в наружной мембране, нарушена в CL-дефицитных митохондриях (Fig. 4 B; Gebert et al., 2009). Как следствие биогенез
?-barrel белков в наружной мембране, а также белков, локализованных в др. митохондриальных субкомпартментах нарушен.
CL and apoptosis.
Дальнейшим подтверждением фундаментальной роли CL в митохондриальной наружной мембране получены в исследованиях роли митохондрий во время апоптоза, которые показали, что CL регулирует множественные ступени апоптической программы (Fig. 4 C). Апоптоз может быть индуцирован активацией death рецептора (Fas рецептора) в плазматической мембране. Лигандом связанный Fas рецептор олигомеризуется и рекрутирует pro-caspase-8, которая в результате подвергается аутолитическому процессингу, приводящему к её активации. Однако активация caspase-8 в плазматической мембране, как было установлено, недостаточна для запуска апоптоза в некоторых клетках и поэтому завершение апоптической программы нуждается в зависимой от митохондрий петле обратной связи (Scaffidi et al., 1998). Недавнее исследование показало, что CL в митохондриальной наружной мембране обеспечивает якорь и активирующую платформу для caspase-8, которая подвергается процессингу и транслоцируется в митохондрии посредством активации Fas рецептора (Gonzalvez et al., 2008).
Caspase-8-обеспечиваемое расщепление BH3-only BID белка ведет к его транслокации в митохондрии. Укороченный BID запускает активацию Bax и Bak, членов семейства Bcl2, которые индуцируют проницаемость наружной мембраны и высвобождение цитохрома c (Lovell et al., 2008). CL вместе с основным белком посредником MTCH2/MIMP в наружной мембране регулирует рекрутирование укороченного BID в место контакта между внутренней и наружной мембраной (Lutter et al., 2000; Lucken-Ardjomande et al., 2008; Sani et al., 2009; Zaltsman et al., 2010). Сходным образом, инсерция в мембрану Bax и его олигомеризация, как было установлено, осуществляются более эффективно в присутствии CL (Lutter et al., 2000; Lucken-Ardjomande et al., 2008; Sani et al., 2009).
Наконец, CL влияет на высвобождение цитохрома c из митохондрий во время апоптоза. Он соединяется непосредственно с цитохромом c, удерживая его внутри гребешков (Choi et al., 2007; Sinibaldi et al., 2008). Взаимодействие между цитохромом c и CL ослаблено после переокисления ненасыщенных acyl цепочек в CL (Nomura et al., 2000). Высвобождение цитохрома c во время апоптоза, как полагают, облегчается ремоделированием митохондриальных гребешков, это помогает перераспределению цитохрома c из просвета гребешков (Scorrano et al., 2002). Морфология гребешков контролируется с помощью dynamin-подобной GTPase OPA1, центрального компонента аппарата слияния митохондрий, чья активность затрагивается CL (see next section). Т.о., CL выполняет множественные роли во время апоптоза как в митохондриальных мембранах, так и может служить в качестве фактора, который координирует последовательность апоптических событий в митохондриях.
CL and mitochondrial dynamics.
Ранние исследования с модельными мембранами продемонстрировали, что образование гексогональных структур индуцирует слияние мембран и подчеркивает критическую роль non-bilayer липидов, таких как CL или PE в слиянии мембран in vivo (Cullis and de Kruijff, 1979). В самом деле, снижение митохондриальных уровней PE и CL , как сообщалось, приводит к аномальной морфологии митохондрий (Kawasaki et al., 1999; Steenbergen et al., 2005; Choi et al., 2006; Claypool et al., 2008a) и к высокой частоте генерации респираторного дефицита митохондрий (Birner et al., 2003; Zhong et al., 2004). Слияние мембран обеспечивается с помощью эволюционно закрепленных dynamin-подобных GTPases, присутствующих в обеих митохондриальных мембранах (Hoppins et al., 2007). Во внутренней мембране, OPA1 (или Mgm1 у дрожжей) подвергается протеолитическому процессингу, приводя в результате к сбалансированному накоплению длинных и коротких изоформ белка в митохондриях, обе они необходимы для слияния митохондрий и морфогенеза гребешков (Herlan et al., 2003; Ishihara et al., 2003; Song et al., 2007). Процессинг дрожжевого Mgm1 нарушен в отсутствие Ups1 или Ups2, которые регулируют накопление CL и PE в митохондриях, соотв. (Sesaki et al., 2006; Osman et al., 2009a). Нарушение процессинга Mgm1 может объяснить аберрантную морфологию митохондрий за счет изменения композиции мембранных липидов, но расщепление Mgm1 не было проанализировано столь глубоко в др. CL-дефицитных клетках, возможны и др. сценарии. Короткие изоформы Mgm1 и OPA1 соединяются с негативно заряженными фосфолипидами, в частности с CL, это стимулирует его олигомеризацию и его GTPase активность (Fig. 4 D; DeVay et al., 2009; Meglei and McQuibban, 2009; Rujiviphat et al., 2009; Ban et al., 2010). Возможно, что взаимодействие с CL ограничивает функцию Mgm1/OPA1 специфическими мембранными доменами, которые, как известно. обогащены CL (Ardail et al., 1990).
Эти места контактов, как предполагается, являются местами действия phospholipase D, наз. MitoPLD, которая превращает CL в наружной мембране в PA (Fig. 4 D; Choi et al., 2006). MitoPLD необходима для слияния митохондрий
in vitro, а модуляция её экспрессии
in vivo вызывает морфологические аномалии (Choi et al., 2006). Образование PA может позволить рекрутирование дополнительных компонет слияния или делать мембраны способными к слиянию. Такая роль PA может напоминать SNARE-обеспечиваемое слияние (Huang et al., 2005) и может указывать на критическую роль локальных альтераций мембранных липидов, по-видимому, в процессе слияния неродственных мембран.
Perspectives
Recent discoveries have brought about significant progress in our understanding of the metabolism of mitochondrial phospholipids. This development was accompanied by a drastically altered view of the role that specific phospholipids play in various mitochondrial processes and the role of mitochondria in broader aspects of the biogenesis of nonmitochondrial membranes. Defined molecular functions of specific phospholipids, like CL, have been recognized, and the accumulation of these lipids in specific membrane domains is emerging as an important property of mitochondrial membranes. The recent identification of novel genes in yeast affecting the phospholipid composition of mitochondria, many of them conserved in mammals, now promises to provide insight into some of the mysteries of mitochondrial phospholipid metabolism and trafficking. Mitochondria may prove once again to be an excellent model to unravel basic cell biological processes that will be relevant to other membrane systems. Undoubtedly, exciting discoveries are just around the corner.
Сайт создан в системе
uCoz
Figure 1. 
Figure 2.