Роль открытого хроматина в репрограммировании

Open chromatin in pluripotency and reprogramming Alexandre Gaspar-Maia, Adi Alajem, Eran Meshorer and Miguel Ramalho-Santos ‡ NATURE REVIEWS \| Molecular cell Biology VOLUME 12 \| JANUARY 2011 \| 36-47 \| doi:10.1038/nrm3036
Pluripotent stem cells can be derived from embryos or induced from adult cells by reprogramming. They are unique among stem cells in that they can give rise to all cell types of the body. Recent findings indicate that a particularly ‘open’ chromatin state contributes to maintenance of pluripotency. Two principles are emerging: specific factors maintain a globally open chromatin state that is accessible for transcriptional activation; and other chromatin regulators contribute locally to the silencing of lineage-specific genes until differentiation is triggered. These same principles may apply during reacquisition of an open chromatin state upon reprogramming to pluripotency, and during de-differentiation in cancer. Рис.1. \| Chromatin in pluripotent stem cells versus differentiated cells. The structure of chromatin differs between undifferentiated embryonic stem (ES) cells (a) and differentiated cells (b) in several ways. Chromatin structure becomes more condensed upon differentiation and more open upon reprogramming. In ES cells, chromatin is globally decondensed; there are fewer heterochromatin foci and they are larger and more dispersed compared with those of differentiated cells. Architectural chromatin proteins, represented here by the histone H1 and heterochromatin protein 1 (HP1), are loosely bound to chromatin in ES cells and are bound more tightly to chromatin in differentiated cells. In ES cells, chromatin, including heterochromatin, is transcriptionally hyperactive, shown here by high levels of RNA transcripts. Рис.1. \| The balance between euchromatin and heterochromatin in ES cells. Several epigenetic regulators orchestrate the open chromatin state of embryonic stem (ES) cells and set the stage for the transcriptional network. Relevant epigenetic marks include histone modifications and incorporation of different core histone variants (yellow and orange cylinders) that alter access and efficiency of the transcriptional machinery. The main histone marks, the active H3 tri-methylated on Lys 4 (H3K4me3) and the repressive H3K9me3 and H3K27me3 (represented by the circles K4, K9 and K27), are positively regulated by specific histone methyltransferases (HMTs; including G9a (also known as EHMT2), SUV39H1, SUV39H2 and SETDB1) and negatively regulated by the respective histone demethylases (HDMs; including jumonji domain-containing 2C (JMJD2C; also known as KDM4C) and JMJD1A (also known as KDM3A)). Active (K4) and repressive (K27) marks can be present in the promoter regions of developmental genes to prevent their expression while allowing rapid activation by transcription factors such as the polycomb proteins Enhancer of zeste homologue 1 (EZH1) and EZH2 (termed bivalent domains). Histone acetylation also marks active chromatin, and the acetyl group (the orange triangle, Ac) can be added through complexes such as TAT-interacting protein of 60 kDa (TIP60; also known as KAT5)–p400 and removed by histone deacetylases (HDACs), which can be part of repressive complexes such as the nucleosome-remodelling (NuRD) complex. DNA (dark blue line) methylation is typically present on CpG islands in promoter regions and heterochromatin (marked by H3K9me3 and heterochromatin protein 1 (HP1)). DNA can be hypermethylated, as a result of the action of DNMTs, such as DNMT3a–DNMT3b or DNMT3L, but in euchromatic regions DNA is generally unmethylated. Chromatin-remodelling proteins such as chromodomain helicase DNA-binding 1 (CHD1) and BRG1 in the ES cell-specific BRG- or BRM-associated factor (esBAF) complex may regulate the open chromatin state, possibly by contributing to boundary determination between euchromatin and heterochromatin. There is growing evidence that the formation of euchromatin can repress the establishment of heterochromatin nearby (as it has not been confirmed in ES cells, this is denoted by a question mark). Табл.1 Chromatin remodellers in ES cells Endoderm The innermost of the three germ layers that are formed during embryonic development. Prominent examples of endodermal tissues include the epithelia of the gastrointestinal and respiratory tracts, thyroid, liver and pancreas, as well as of the auditory and urinary systems. Mesoderm The middle of the three germ layers that are formed during embryonic development. Prominent examples of mesodermal tissues include bone, cartilage, blood, muscle, heart, connective tissue and kidney. Ectoderm The outermost of the three germ layers that are formed during embryonic development. Prominent examples of ectodermal tissues include the nervous system, hair, skin, nails and eyes, as well as the various derivatives of the neural crest, including bones of the head and peripheral nerves. Heterochromatin Highly compacted chromatin that is transcriptionally inactive. Includes structural regions of the chromosome, such as centromeres, that lack genes (‘constitutive’ heterochromatin) and regions in which genes are silenced in a given cell type (‘facultative’ heterochromatin). Euchromatin A form of chromatin that is relatively decondensed and often transcriptionally active during interphase. Electron spectroscopic imaging (esI). energy-filtered transmission electron microscopy, in which the imageis formed only by electrons transmitted within a certain energy window. It allows direct quantitative imaging of elements within the specimen. Embryoid body (eB). A cellular aggregate that is produced when es cells are induced to differentiate in non-adherent conditions that mimic the early stages of embryogenesis. ChIP–chip Chromatin immunoprecipitation (ChIP) followed by microarray. ChIP is a method that allows isolation of DNA sequences that are bound to a protein of interest using specific antibodies. DNA isolated by ChIP is denatured and hybridized to a tiling array, which typically includes probescovering the entire genome. Paired probes indicate that the protein of interest was bound to that particular region of DNA. ChIP–seq Chromatin immunoprecipitation (ChIP) followed by sequencing. refers to high-throughput sequencing of ChIP-isolated DNA, and provides genome-wide information of the DNA binding sites of the protein of interest. Heterochromatin protein 1 (HP1). A heterochromatin binding protein that recognizesand binds to histone H3 tri-methylated on Lys9. It includes three isoforms (α, β and γ), which are encoded by three different genes (CBX5, CBX1 and CBX3, respectively). Proteasome A large multisubunit protein complex that degrades proteins. Undesired proteins are labelled for degradation by the addition of a chain of the small protein ubiquitin; a process that is mediated by a family of enzymes called ubiquitin ligases. CpG island A genomic region which contains a high content of cytosine (C) and guanine (G) dinucleotides (the ‘p’ refers to the phosphodiester bond linking the two bases). CpG islands are found in many mammalian promoters, and unlike scattered CpGs throughout the genome, which are usually hypermethylated, promoter CpG islands are normally hypomethylated. Helicase A protein that can unwind DNA or rNA. Teratoma A confined tumour, originating from pluripotent cells, that includes tissues of the three germ layers, endoderm, mesoderm and ectoderm. Telomeric region A region of repetitive DNA at the ends of chromosomes that protects the chromosomes from premature deterioration, rearrangements and chromosome fusion. Histone hyperacetylation A state in which many Lys residues are acetylated on many of the histones present in a given region of chromatin. Genetic epistasis The relationship or order in which two genes act in a pathway (that is, upstream or downstream, synergistic or antagonistic), which can be studied by analysing single and double mutants. DamID A method that is used to analyse binding of proteins to DNA. Genetically modified Drosophila melanogaster culture cell lines express a protein of interest fused with a bacterial DNA adenine methyltransferase. Local DNA methyltransferase activity indicates protein binding.	Embryonic stem (ES) клетки являются прототипическими плюрипотентными стволовыми клетками^1-3: они обладают способностью генерировать дифференцированное потомство всех трех эмбриональных зародышевых листков (энтодермы, мезодермы и эктодермы), а также зародышевую линию⁴. ES клетки обладают очень высокой способностью к самообновлению и могут увеличиваться почти бесконечно в культуре. В противоположность ES клеткам стволовые клетки взрослых, такие как нейральные стволовые клетки⁵ или гематопоэтические стволовые клетки⁶ обладают более ограниченной способностью к дифференцировке: они обычно генерируют клетки ткани, в которой они располагаются и поэтому наз. мультипотентными. В последние годы обнаруживается повышенный интерес к плюрипотентным стволовым клеткам, поскольку они многообещающие как модель для изучения развития и болезней in vitro (7,8). Однако происхождение ES клеток из ранних эмбрионов ставит технические и этические ограничения по использованию их в исследованиях и клинике. Плюрипотентные стволовые клетки могут также быть получены из зародышевых линий плодов и взрослых^9-11 и за счет перепрограммирования соматических клеток. Описаны три основных пути репрограммирования соматических клеток к плюрипотентности: перенос ядер из соматических клеток в энуклеированные ооциты; слияние соматических клеток с ES клетками; и индукция плюрипотентности в соматических клетках путем принудительной экспрессии ключевых транскрипционных факторов (BOX 1). Все эти методы репрограммирования остаются пригодными и информативными. Относительные преимущества и недостатки каждого из методов рассмотрены в др. месте¹² и не будут обсуждаться здесь. Наибольшее внимание привлечено к процессу, в котором плюрипотентность индуцируется в соматических клетках¹³ из-за его технической простоты и широты использования. Путем эктопической экспрессии генов, которые избыточно представлены в ES клетках, набор из 4-х транскрипционных факторов (OCT4 (также известен как POU5F1), Sry-box containing gene 2 (SOX2), myelocytomatosis oncogene (MYC) и Kruppel-like factor 4 (KLF4)) было продемонстрировано репрограммирование дифференцированных мышиных клеток (как эмбриональных, так и взрослых соматических клеток) в induced pluripotent stem (iPS) клетки, которые очень сходны с ES клетками. Неожиданная способность только 4-х факторов индуцировать драматические изменения в судьбе клеток открыло целую новую область исследований. Важно. что клетки человека^14-17 также могут превращаться в iPS клетки с использованием тех же самых 4-х факторов или др. комбинации факторы: OCT4, SOX2, LIN28 and NANOG¹⁷. Следовательно, репрограммирование соматических клеток, в особенности индукция плюрипотентности сильно расширяет возможности базовых исследований и потенциального клинического использования плюрипотентных стволовых клеток. Понимание молекулярной регуляции плюрипотентности принципиально важно и поможет сделать безопасным и эффективным применение плюрипотентных стволовых клеток в клинике. Состояние плюрипотентности стволовых клеток находится под контролем транскрипционных схем (circuitry), которые включают репрограммирующие факторы, указанные выше (rev.12). Недавние исследования показали, что эта транскрипционная программа осуществляется в контексте 'открытого' состояния хроматина и было предположено, что это состояние позволяет транскрипционным программам быстро переключаться на индукцию дифференцировки18. Это может быть особенно важным для плюрипотентных стволовых клеток, где необходима доступность широкого спектра опций дифференцировки. Box 1 \| Pluripotent stem cells can be derived from several sources There are three sources of pluripotent stem cells in vivo (see the figure, top half). Embryonic stem (ES) cells are derived from the inner cell mass of the blastocyst, before embryo implantation 1-3. Embryonic germ (EG) cells are derived from primordial germ cells (PGCs) during mid-gestation (embryonic days 8.5-12.5 in the mouse) and germline-derived pluripotent stem (gPS) cells are derived from spermatogonial stem cells of neonatal and adult testes. In addition, three major routes for somatic cell reprogramming to pluripotency have been described 12 11 (see the figure, bottom half): fusion between a somatic cell and an ES cell giving rise to reprogrammed hybrid cells; the generation of nuclear transfer embryonic stem (NT-ES) cells, produced by reprogramming of a somatic nucleus by an enucleated oocyte, which is then cultured to the blastocyst stage to allow derivation of ES cells; and the production of induced pluripotent stem (iPS) cells, derived by somatic cell overexpression of reprogramming transcription factors, most commonly OCT4 (also known as POU5F1), Sry-box containing gene 2 (SOX2), myelocytomatosis oncogene (MYC) and Kruppel-like factor 4 (KLF4)13. 9,10 18 Мы обсудим, как организация хроматина регулируется в плюрипотентных клетках. Open chromatin and pluripotency Defining open chromatin. Термин хроматин предложен Walther Flemming в 1882, после разработки им новыъ методов гистологического окрашивания, что позволило ему наблюдать уникальные ниеобразные структуры в ядрах. Название chromatin ('stainable material')^19,20. Почти 50 лет спустя в 1928 выло выявлено различие между гетерохроматином и эухроматном Emil Heitz. Он различал эти два компонента хроматина, базируясь на различной сжатости (compaction) в интерфазных ядрах²¹: гетерохроматин наиболее сильно окрашен, компактные области, тогда как эухроматин представлен рыхло окрашиваемым хроматином. На базе преимущественно гистологических доказательств многие стволовые и клетки предшественники от клеток необластов у планарий²² до гематопоэтических стволовых клеток млекопитающих²³, получены классические описания типичной открытой конформации хроматина, т.е. по большей части лишенных гетерохроматина. В этих исследованиях гистологический анализ ядер оказался достаточным, чтобы продемонстрировать достоверные отличия в структуре хроматина в клетках предшественниках и их дифференцированном потомстве. Open chromatin in pluripotent stem cells. Идея открытого хроматина подтверждена не только гистологическими исследованиями. В последнее время, состояние хроматина плюрипотентных стволовых клеток привлекло большое внимание благодаря его определенным свойствам²⁴. В самом деле, хроматин плюрипотентных стволовых клеток всё больше распознается как открытый по сравнению с хроматином соматических клеток, указывая тем самым, что его общая структура менее конденсирована и что соотношение между эухроматином и гетерохроматином выше, чем дифференцированных клетках. Прежде всего доказательства получены при визуализации хроматина ES клеток с использованием ЭМ: гетерохроматин превалирует в дифференцированных клетках, но его значительно меньше в недифференцированных ES клетках²⁵. Сходным образом electron spectroscopic imaging (ESI) продемонстрировало, что большинство хроматина в ES клетках гомогенно распределено и в основном лишено компактных гетерохроматиновых блоков, тогда как в дифференцированных клетках хроматин выглядит гетерогенным с четкими блоками компакции²⁶. Важно, что этот паттерн организации хроматина недавно был обнаружен и in vivo: клетки inner cell mass (ICM) мышиного бластоциста на 3.5 день, которые являются источником ES клеток, обладают той же самой открытой конформацией хроматина что и ES клетки²⁷. ICM клетки обнаруживают высоко диспергированный хроматин с достоверно более низким количеством конденчированных кластеров по сравнению с клон-детерминированными клетками. Анализ сжатия глобального хроматина с использованием nucleases, таких как DNase I и micrococcal nuclease (MNase) также показывает, что хроматин становится менее доступным к перевариванию нуклеазами после дифференцировки ES клеток в эмбриоидные тела (EBs) (A.A. and E.M., unpublished observations, and K. Ura, personal communication) или индукции дифференцировки ретиноевой кислотой²⁸. Относительно низкое содержание гетерохроматина также подтверждает идею, что хроматин нахоится в открытой конформации. Western blot и анализ иммунофлюоресценции гистоновых пост-трансляционных модификаций (post-translational modifications (PTMs)), таких как , триметилирование гистона H3 по Lys9 (H3K9me3), которым богат гетерохроматин (BOX 2), указывает на то, что ES клетки имеют существенно меньше гетерохроматина, чем дифференцированные клетки²⁹. Далее, ChIP-chip анализ на H3K9me2, который формирует 'large organized chromatin K9 modifications' (LOCKs), показал, что эти домены существенно расширяются во время дифференцировки³⁰. Более того, ChIP-seq анализ показал, что H3K9me3 и H3K27me3 увеличиваются от приблизительно 4% в геноме ES клеток до 12% и 16%, соотв., дифференцированных клетках³¹ Box 2 \| Chromatin and epigenetic patterns Chromatin is a complex assembly of DNA, histone proteins and other non-histone protein components. Histone proteins form chromatin building blocks, the nucleosomes, around which DNA is wrapped. Each nucleosome consists of an octamer of the canonical core histones H2A, H2B, H3 and H4 and, between two nucleosomes, the histone H1 acts as a linker. Alterations to the chromatin structure that do not affect the genomic sequence are defined as epigenetic modifications. These epigenetic patterns include methylation of DNA, post-translational modifications (PTMs) of histones (also called histone marks) and histone variants that are incorporated into nucleosomes. The amino-terminal tails of histones are subject to various PTMs with either activating or inhibiting effects on transcription, including acetylation, methylation, phosphorylation, ubiquitylation, sumoylation, poly-ADP ribosylation and proline isomerization. The most commonly studied are: methylation, in which histone methyltransferases (HMTs) add a methyl group and histone demethylases (HDMs) remove this group; and acetylation, in which the addition and removal of an acetyl group is regulated by histone acetyltransferases (HATs) and histone deacetylases (HDACs), respectively. Typically, the tri-methylation of Lys 4 in H3 (H3K4me3), together with histone acetylation, signals binding of RNA polymerase II and transcriptional activation. H3K27me and H3K9me3 signal a repressive transcriptional state, although through recruitment of distinct silencing factors. Chromatin-remodelling complexes also often include regulators of PTMs and may mediate incorporation of histone variants (such as H3.3 and H2AZ or macroH2A), which can be associated with either inactive or active chromatin⁵⁸. Modification of the DNA itself is also important. Cytosine DNA methylation on CpG islands is mediated by DNA methyltransferases (DNMTs) and is usually repressive. DNA methylation is typically a more stable and inheritable epigenetic pattern that can persist for several cell generations. However, DNA methylation can be lost passively by a lack of methylation after replication, and there also appear to be factors that can actively de-methylate DNA⁵⁸. See fIG. 2 for schematic details of these histone and DNA modifications. C др. стороны, ацетилирование гистонов, общая метка открытого хроматина, как было установлено, увеличивается в недифференцированных ES клетках человека. особенно на H3K9 остатке³². Существуют также косвенные доказательства, которые подтверждают концепцию преимущественно открытого состояния хроматина в плюрипотентных стволовых клетках. В ES клетках, восстановление флюоресценции после photobleaching экспериментов показывает, что хроматин содержит фракцию рыхло связанных архитектурных белков хроматина, таких как стержневые³³ и линкерные гистоны и heterochromatin protein 1 (HP1) ²⁹; эта фракция не наблюдается в дифференцирующихся клетках^29,33. Кроме того, геном ES клеток транскрипционно гиперактивен: его транскрипты обычно замалчиваемые повторяющиеся элементы, а также кодирующие и некодирующие регионы, приводят к повышенным уровням всей РНК и мРНК²⁶ (FIG. 1). Одним из способов противодействия этой распространяющейся повсюду транскрипции в ES клетках может быть протеосомами обеспечиваемая деградация пре-иниационных транскрипционных ансамблей, которые формируются на специфических регуляторных генах, готовых к транскрипции³⁴. Итак, эти данные показывают. что хроматин в ES клетках глобально деконденсирован по сравнению с дифференцированными клетками и что значительно меньшая фракция генома в ES клетках организована как репрессивный гетерохроматин. is organized as repressive heterochromatin. Control of the chromatin landscape Хроматин в ES клетках характеризуется определенным набором признаков и лучшее знание ферментов, которые модифицируют эту структуру прольет свет на контроль состояния хроматина. Картирование по всему геному стержневых гистоновых PTMs, или гистоновых меток, широко используется в определении эпигенетических паттернов (BOX 2), которые могут регулировать плюрипотентность^30,31,35,36. Кроме того, некоторые модифицирующие хроматин энзимы, такие как DNA methyltransferases (DNMTs), histone methyltransferases (HMTs), histone demethylases (HDMs), histone acetyltransferases (HATs), histone deacetylases (HDACs) и хроматин моделирующие белки, как известно, играют важные роли в ES клетках и будут описаны ниже. Взаимосвязь между регуляцией хроматина и транскрипционной сетью, которая управляет плюрипотентностью ³⁷, также является критической и рассматривается в др. месте³⁸. Chromatin poised for differentiation. ES клетки обладают глобально открытой хроматиновой структурой с высокими уровнями эпигенетических меток, которые указывают на активную транскрипцию, такие как гистон H3K4me3 и ацетилирование гистонов H3 и H4 (refs 29,32,39). Однако д. существовать механизмы противодействия, которые замалчивают онтогенетические регуляторные гены и предупреждают преждевременную дифференцировку. Считается, что эти онтогенетические регуляторы молчат, но готовы к активации за счет присутствия как активирующих меток (H3K4me3), так и репрессивных меток (H3K27me3) 35,36,39. Такие 'bivalent' домены, хотя не исключительно специфичны для ES клеток, могут приводить к быстрой активации клон-специфических генов благодаря потере H3K27me3, когда индуцируется дифференцировка. Репрессивная H3K27 метиляционная метка регулируется с помощью белков группы polycomb group (PcG). Белки PcG включают polycomb repressive complex 2 (PRC2), который участвует в добавлении гистоновой метки, и PRC1, который распознает эту метку. Геномный анализ некоторых PcG белков в ES клетках человека и мыши выявил, их локальное скопление на молчащих онтогенетически регуляторных генах^40,41. Более того, гены мишени для PcG белков обнаруживают тенденцию одновременно оккупироваться транскрипционными факторами OCT4, SOX2 и NANOG, которые является критическими регуляторами плюрипотентного состояния. Однако, PcG белки несущественны для самообновления ES клеток: в отсутствие PcG белков, таких как embryonic ectodermal development (EED)^40,42, Suppressor of zeste 12 homologue (SUZ12)⁴¹ и Enhancer of zeste homologue 2 (EZH2)⁴³, ES клетки всё ещё будут накапливаться в недифференцированном состоянии. Однако эти PcG-дефицитные ES клетки не могут замалчивать некоторые клон-специфические маркеры и могут иметь дефекты дифференцировки. PcG белки рекрутируются ДНК мишени с помощью кофактора jARID2 (jumonji/ARID domain-containing 2)⁴⁴. jARID2 также, по-видимому, ингибирует ферментативную активность methyltransferase в PRC2, и таким образом может регулировать как доставку, так и тонкую настройку активности PRC2 в ES клетках и во время дифференцировки^44-47. Heterochromatin regulation in ES cells. Др. гистоновая метка, которая обычно ассоциирует в генной репрессией это метилирование H3K9, которая возрастает с дифференцировкой ES клеток. Один энзим. которые ответственен за H3K9 метилирование это HMT G9a (известен также как EHMT2). Интересно, что G9a необходима для замалчивания OCT4 после дифференцировки⁴⁸. G9a соединяется непосредственно с промотором OCT4 и ведет к метилированию H3K9, которое сопровождается рекрутированием DNMTs, чтобы пердавать сигнал о более окончательном репрессивном состоянии. G9a может выполнять двойную роль по метилированию H3K9 (как известная HMT) и рекрутировать DNMTs - пример того, как несколько слоев регуляции сопровождают собственно молчание определенных генов⁴⁹. Следовательно, увеличение гетерохроматина, которое происходит после дифференцировки ES клеток, может вносить непосредственный вклад в замалчивание регуляторов самообновления и плюрипотентности. G9a также необходим для установления доменов из H3K9me2 (LOCKs) в дифференцированных клетках³⁰, указывая на более глобальную роль G9a в индуцированной дифференцировкой гетерохроматинизации. Низкий уровень метилирования H3K9 в недифференцированных ES клетках поддерживается с помощью гистоновых H3K9 HDMs JMJD1A (jumonji domain-containing 1A; также известен как KDM3A) и JMJD2C (также известного как KDM4C). Они регулируют глобальные уровни репрессивных маркеров H3K9me2 и H3K9me3, соотв., и поддерживают ES клеточное состояние за счет непосредственного деметилирования H3K9 в промоторных регионах ES клеточных факторов, делая возможной их экспрессию⁵⁰. Интересно, что гены, кодирующие JMJD1A и JMJD2C, регулируются с помощью OCT4, представляющего позитивную петлю обратной связи, которая интегрирует действие транскрипционных факторов и гистоновых модификаторов, чтобы поддерживать недифференцированное состояние ES клеток. Др. слой эпигенетической регуляции в ES клетках это метилирование ДНК по CpG островкам. DNMTs ответственны за эту репрессивную метку, которая коррелирует со специфическими гистоновыми метками⁵¹: метилированные CpG островки представляют собой в основном промоторные регионы репрессируемых генов, обычно скоррелированные с неметилированным H3K4 и H3K9me3, затрагивают около 30% генов в ES клетках⁵². Однако , перекрестно-ссылающиеся геномные области с паттернами метилирования и связыванием OCT4, NANOG, SOX2 и PcG обнаруживают мало перекрывания⁵². Более того, ES клетки обнаруживают достоверное величение метилирования вне CpG островков, свойство, которое, по-видимому, уникально для этих клеток⁵³. Эти наблюдения указывают на то, что метилирование ДНК может представлять собой уникальный эпигенетический слой, который дополняет др. механизмы репрессии генов и вносит вклад в тонкую регуляцию транскрипционных программ, которые активируются после дифференцировки. Chromatin remodelling in ES cells Добавление или удаление гистоновых меток или метилирование ДНК только один из способов, с помощью которого состояние хроматина может влиять на транскрипционную программу и тем самым на плюрипотентность стволовых клеток. Структура самого хроматина и положение нуклеосом также могут меняться как глобально, так и на уровне специфических генетических локусов с помощью хроматин-ремоделирующих белков, которые изменяют контакты гистоны-ДНК, используя энергию АТФ гидролиза⁵⁴. Разрушение контактов гистоны-ДНК само по себе изучено плохо, но следствием этого является то, что ДНК оказывается подверженной действию регуляторных белков, а нуклеосомы и гистоны становятся более активно подвижными⁵⁵. Хроматин-ремоделирующие белки могут быть подразделены на 4 семейства: SWI/SNF (switch/sucrose nonfermentable), CHD (chromodomain helicase DNA-binding), ISWI (imitation switch) и INO80 (inositol-requiring 80). Ремодельеры хроматина обычно формируют комплексы, которые содержат каталитическую субъединицу с SWI2/SNF2 ATPase доменом, субъединиц, которая распознает хроматин, и дополнительную регуляторную субъединицу, которая обеспечивает взаимодействия с др. белками и с собственно хроматином⁵⁶. По крайней мере, каждый из этих 4-х семейств существенен для эмбриогенеза мыши (TABLE 1), демонстрируя централную роль, которую ремодельеры хроматина оказывают на развитие. Недавние исследования начинают проливать свет на специфические роли, которые ремодельеры хроматина обнаруживают в ES клетках. SWI/SNF family. Семейство SWI/SNF состоит из двух основных комплексов: BRG- или BRM-associated factor (BAF) и polybromo BAF (PBAF) (TABLE 1). Существует некоторая гетерогенность в составе BAF и PBAF комплексов в разных типах клеток и тканей⁵⁸. ES клетки содержат специализированный субъединичный состав, наз. esBAF, который динамически регулируется во время дифференцировки и пока не совсем ясно, существуют ли два самостоятельных комплекса (esBAF и esPBAF) в ES клетках или разные субъединицы комбинируют, чтобы сформировать одиночный esBAF. BRG1 (также известный как SMARCA4) является каталитической субъединицей комплекса esBAF. Он подавляется после дифференцировки и, по-видимому, постепенно замещается др. каталитической субъединицей, BRM^59,60. Brg1-нулевые мыши погибают на пери-имплантационной стадии⁶¹, а нокдаун эксперименты в ES клетках приводят к аберрантной морфологии, снижению скорости пролиферации и редукции способрности к дифференцировке^26,59,62,63. Более того, геномные ChIP-chip и ChIP-seq эксперименты выявляют скопление BRG1 на промоторных регионах генов, которые также оккупируются регуляторами плюрипотентности OCT4, SOX2 и NANOG^63,64. Интересно, что ингибирование BRG1 в ES клетках ведет к активации как онтогенетических генов, так и ES клеточно-специфических генов. Эти результаты указывают на то, что BRG1 может не только вносить вклад в репрессию онтогенетических генов, но и может также тонко настраивать уровень экспрессии генов, специфических для ES клеток, таких как Oct4 и Sox2 (refs 63,64). Дополнительным членом комплекса BAF, который играет роль в ES клетках, это BAF250 (также известен как ARID1), который содержит две родственные субъединицы, BAF250A и BAF250B. Включение BAF250A в комплекс BAF наиболее выражено в недифференцированных ES клетках, тогда как BAF250B в основном инкорпорируется после дифференцировки⁵⁹. Baf250a-дефицитные ES клетки мыши неспособны поддерживать экспрессию маркеров стволовых клеток и вместо этого активируют гены с известными ролями в раннем развитии и органогенезе⁶⁵. Более того, Baf250a ES клетки склонны к дифференцировке, но они, по-видимому, теряют способность формировать клетки мезодермального клона, это согласуется с отсутствием обнаружимой мезодермы у ранних мышиных Baf250a^-/- эмбрионов⁶⁵. В отличие от Baf250a^-/- ES клеток, Baf250b-^/- ES клетки дают все три зародышевых слоя, но разрушение Baf250b ведет к редукции способности к самообновлению и ускоряет дифференцировку ES клеток⁶⁶. Существуют противоречивые сообщения также о роли BAF155 (также известного как SMARCC1) в ES клетках^28,59. Он экспрессируется на высоком уровне в ES клетках и его редукция ведет к аберрантной морфологии колоний⁶² и к снижению экспрессии OCT4 в недифференцированных ES клетках. Однако в дифференцирующихся ES клетках потеря BAF155 вызывает нарушения конденсации хроматина и усилению экспрессии OCT4. Базируясь на этих результатах можно предполагать, что стоихометрия разных субъединиц BAF, а не их действительный уровень, предопределяет их функции, что подтверждается этими исследованиями. CHD family. 4 субъединицы CHD семейства хроматин-моделирующих энзимов - CHD1, CHD3, CHD4 и CHD7 - участвуют в приобретении качественных особенностей и функции ES клетками, хотя механизмы их действия отличаются. CHD1 и CHD7 ещё не ассоциированы четко с известным комплексом (TABLE 1), но последний связывает множественные субъединицы PBAF комплекса в клетках нервного гребня, происходящих из ES клеток человека. В этих клетках нервного гребня и мышиных ES клетках⁶⁸, CHD7 концентрируется в энхансерных регионах вместе с H3K4me1, указывая на то, что CHD7 может поддерживать компетентность к транскрипции как в недифференцированных, так и дифференцирующихся ESклетках. CHD1 соединяется глобально с активным эухроматином и ко-локализуется с RNA polymerase II (RNAPII) в ES клетках⁶⁹. ES клетки, в которых CHD1 был истощен с помощью RNA interference, накапливают высокие уровни гетерохроматина и, хотя они могут накапливаться в недифференцированном состоянии, они не могут дифференцироваться нормально. Эти результаты указывают на то, что CHD1 устанавливает баланс между эухроматином и гетерохроматином в ES клетках, это может быть критическим для поддержания плюрипотентности. CHD3 и CHD4 составляют каталитическую субъединицу nucleosome-remodelling (NuRD) комплекса (TABLE 1), которая участвует в регуляции ES клеток. Напр., ES клетки, лишенные NuRD субъединицы methyl-CpG-binding domain 3 (MBD3) сохраняют свою экспрессию OCT4, если индуцированы дифференцироваться и обнаруживают аберрантный потенциал дифференцировки^70,71. MBD3-нокаутированный ES клетки также экспрессируют трофэктодермальные маркеры, которые обычно не обнаруживаются в ES клетках. Делеция др. субъединицы, кодируемой Hdac1, также ведет к аберрантной дифференцировке мышиных ES клеток, приводя к спонтанной генерации мезодермального и эктодермального клона за счет энтодермы⁷². Важно, что нокаут по Hdac1 (но не Hdac2) ведет мышей к эмбриональной летальности^73-76. NuRD, по-видимому, выполняет двойную роль в замалчивании генов дифференцировки в ES клетках, а также специфичных для ES клеток генов во время дифференцировки. Наконец, NuRD субъединицы MBD3 и metastasis-associated 2 (MTA2) взаимодействуют с SWI/SNF компонентом BRG1, особенно в ES клетках, но не в дифференцирующихся клетках⁵⁹, указывая тем самым, что существует перекрестное общение между хроматин-ремоделирующими комплексами в плюрипотентных клетках. ISWI family. Семейство ISWI family ремодельеров может формировать три самостоятельных комплекса - nucleosome-remodelling factor (NURF), chromatin accessibility complex (CHRAC) и ATP-utilizing chromatin assembly and remodelling factor (ACF) - из которых комплекс NURF, по-видимому, обладает наиболее выделяющейся ролью в ES клетках. Bromodomain PHD finger transcription factor (BPTF), член комплекса NURF, необходим для дифференцировки ES клеток как in vivo, так и in vitro. Bptf-нокаутные ES клетки не мгут формировать тератомы, а Bptf-нокаутные EBs обнаруживают тяжелую дефектную экспрессию маркеров всех трех зародышевых листков. В соответствии с этим, Bptf-нокаутные мышиные эмбрионы дефектны по закладке передне-задней оси во время самых ранних стадий развития и являются эмбриональными леталями на ст. Е8.5 (ref. 77) (TABLE 1). Box 3 \| The actions of chromatin-remodelling factors Chromatin remodellers are ATP-dependent machines that act to alter the local structure of chromatin by repositioning (or 'sliding'), ejecting or incorporating nucleosomes. During DNA replication, for example, a group of chromatin remodellers act to insert nucleosomes into the newly forming chromatin fibre (see the figure, bottom left), but other groups of remodellers are active throughout the cell cycle to modify the local structure of chromatin, thereby regulating gene expression. For example, chromatinremodelling factors such as SWI/SNF (switch/sucrose nonfermentable) and CHD (chromodomain helicase DNA-binding) family proteins can trigger ejection of a nucleosome (top left). Other chromatin-remodelling factors, such as ISWI (imitation switch) family proteins, can slide a nucleosome (top right). The INO80 (inositol-requiring 80) family proteins exchange histone dimers (bottom right), which can introduce histone variants or modified histones, and have a local impact on chromatin activity⁵⁶ . INO80 family. Члены семейства INO80 могут формировать три самостоятельных комплекса, INO80, SNF2-related CBP activator protein (SRCAP) и TAT-interacting protein of 60 kDa (TIP60; также известен как KAT5)-p400, но только последний, как было установлено, важен в ES клетках. Комплекс TIP60-p400 облегчает транскрипцию путем комбинирования ремоделирования нуклеосом с histone acetylase активностью. ES клетки, истощенные по разным субъединицам TIP60-p400 комплекса обнаруживают довольно сходные фенотипы, включая измененную морфологию колоний, снижение скорости пролиферации, снжение плюрипотентности и общее снижение жизнеспособности⁶², которые, по-видимому, являются фенотипическими отклонениями, специфичными для ES клеток⁷⁸. TIP60-p400 возможно действует, чтобы поддерживать недифференцированное состояние ES клеток путем соединения с H3K4me3 меткой, взаимодействие, которое облегчается с помощью NANOG. Кроме того, TIP60-p400 способствует ацетилированию гистона H4 как активных, так и репрессивных генов⁶², которые также, скорее всего, поддерживают состояние стволовых клеток. Итак, эти исследования подчеркивают важность хроматин-ремоделирующих комплексов для интеграции транскрипционных программ для плюрипотентности с эпигенетической информацией и для замалчивания этих программ плюрипотентности после дифференцировки. Кроме того, ремоделирование хроматина может потенциально играть более широкую роль в глобальном поддержании открытого состояния хроматина ES клеток. Maintaining open chromatin in ES cells Помимо влияния, оказываемого с помощью обогащенных активных гистоновых меток, открытый хроматин может также активно поддерживаться в ES клетках с помощью упомянутого выше АТФ-зависимых хроматин-ремоделирующих энзимов, напр., посредством демонтажа нуклеосом и/или 'раскручивания' хроматиновых структур высокого порядка (BOX 3). Интересно, что экспрессия многих из хроматин-ремоделирующих энзимов значительно обогащена в ES клетках, включая esBAF комплекс и CHD членов²⁶. Возможно, что интеграция высоких уровней гистоновых меток с высокой экспрессией особенно хроматиновых ремодельеров глобально обеспечивает состояние открытого хроматина. Ремодельер хроматина CHD1 может репрессировать формирование гетерохроматина в ES клетках⁶⁹. Однако механизмы, которые управляют этим открытым хроматином, смещают баланс между эухроматином и гетерохроматином в направлении в направлении первого, неизвестны (FIG. 2). Такие глобальные 'anti-silencing' механизмы были изучены на др. видах. таких как почкующиеся и делящиеся дрожжи, и эти исследования помогли понять принципы, которые управляют этой битвой между гетерохроматином и эухроматином. У дрожжей silent information regulator (SIR) белки соединяются преимущественно с теломерными регионами и способствуют образованию гетерохроматина. Два перекрывающихся механизма предупреждают распространение SIR белков и гетерохроматина: включение гистонового варианта H2AZ и метилирование H3K4, обеспечиваемых methyltransferase SET domain-containing 1 (Set1). Т.о., включение специфических гистоновых вариантов или модификации канонических гистонов предупреждают связывание SIR белков⁷⁹. Др. важным анти-замалчивающим механизмом является гиперацетилирование гистонов, которое также предупреждает SIR от связывания⁸⁰. Локальное молчание, обеспечиваемое с помощью белка SIR семейства Sir3, нуждается в сложном взаимодействии между HAT Sas2, HMTs disrupter of telomere silencing 1 (Dot1) и Set1, и HDM Jhd2 (ref. 81), которое предопределяет динамический баланс молчания против активации путем управления конкурентным добавлением и удалением метильных групп на H3K4 и H3K79. Следовательно, не только могут разные типы гистоновых модификаций (ацетилирование и метилирование) взаимодействовать, чтобы регулировать молчание, но и также существует динамический баланс между противоположными действиями гистон-модифицирующих энзимов, чтобы регулировать формирование эухроматина или гетерохроматина. Экстраполяция после исследований на теломерах дрожжей одного из возможных механизма, с помощью которого поддерживается открытое состояние хроматина в ES клетках, это отложение специфических вариантов гистонов. Напр., H3.3 обычно ассоциирован с активными генами и менее склонен к H3K9 метилированию^82,83. H3.3 инкорпорируется независимым от репликации способом с помощью шаперона HIRA⁸⁴, и обычно ко-локализуется с регионами, богатыми метилированными H3K4 (refs 85,86). Считается, что это механизм, с помощью которого клетки могут поддерживать транскрипционную память; напр., клон-специфические гены, маркированные с помощью H3.3 всё ещё экспрессируются после репрограммирования у Xenopus laevis⁸⁷. Интересно, что CHD1 необходим в ооцитах Drosophila melanogaster для инкорпорации H3.3 в хроматин спермиев: CHD1-мутантные ооциты не могут инкорпорировать H3.3 в мужские пронуклеусы, которые делают мужской геном неспособным вносить вклад в развитие⁸⁸. Эти результаты демонстрируют широкое воздействие, которое включение H3.3 оказывает на хроматин самцов ^{D. melanogaster}. Возможность, что сходный механизм с использованием включения H3.3 также поддерживает глобальное открытое состояние хроматина ES клеток покажут будущие исследования, даже если учитывать, что этот вариант присутствует также в теломерных регионах⁸⁵. Альтернативно или в дополнение др. механизмы могут непосредственно защищать H3K4me3 от деметилирования. Связывание хроматиновых ремодельеров, таких как CHD1 непосредственно с H3K4me3 посредством их chromodomains⁸⁹ может защищать от действия деметилаз и селективно кооперировать с HMTs, чтобы поддерживать H3K4me3 метку. Напр., CHD1 взаимодействует посредством своего chromodomain, с HMT ASH2, которая метилирует H3K4 (ref. 90). Эта гистоновая метка предупреждает от связывания репрессивного комплекса, такого как NuRD deacetylation комплекса^91,92 и DNMT субъединицы DNMT3L (ref. 93). Открытие хроматина может также дополняться гиперацетилированием гистонов, как показано для теломер дрожжей⁸⁰. Фактически, HAT и ремоделирующий комплекс TIP60-p400 распознают H3K4me3 и зависят от этой метки при связывании своих мишеней⁶². Все эти механизмы могут управлять сложной, динамической регуляцией открытым в противовес компактному хроматином в ES клетках (FIG. 2). Поэтому важно определить геномным способом с использованием ChIP-seq, как эпигенетические метки изменяются, когда регуляторы открытого хроматина, такие как CHD1 теряются. Дальнейшие генетические и биохимические исследования, особенно с помощью эпистатического анализа и вычленения межбелковых взаимодействий, д. помочь определить относительный вклад этих механизмов в состояние хроматина и плюрипотентность ES клеток. Lessons from reprogramming somatic cells Процесс генерации iPS клеток обращает соматические клетки обратно к плюрипотентному стволовому состоянию, которое очень сходно с таковым в ES клетках и может предоставить альтернативу к использованию ES клеток для выяснения взаимоотношений между открытым хроматином и плюрипотентностью⁹⁴. Хотя молекулярные ориентиры, которые возникают о время репрограммирования были идентифицированы, но процесс остается в основном нерешенным на механистическом уровне. После экспрессии факторов репрограммирования (обычно OCT4, SOX2, MYC и KLF4), активность alkaline phosphatase (AP) и экспрессия маркера клеточной поверхности SSEA1 (также известного как FUT4) являются ранними маркерами недифференцированного состояния. AP и SSEA1 могут обнаруживаться уже на 3 и 9 день, соотв., после нала репрограммирования в клетках мыши. Эндогенная экспрессия OCT4 и NANOG может определяться только спустя 10 дней после индукции, а 4 экзогенных фактора, обычно доставляемые вирусной конструкцией, д. быть экспрессированы во время всего этого периода. Однако клетки полностью репрограммируются только после замалчивания вирусных векторов⁹⁵. Возникает главный вопрос: каковы непосредственные нижестоящие эффекты факторов репрограммирования, которые запускают индукцию плюрипотентности? OCT4 и SOX2 являются частью ауторегуляторной петли, которая поддерживает плюрипотентность в ES клетках⁹⁶, а MYC соединяется с отдельным классом генов, не связанных с OCT4, SOX2 или KLF4 (ref. 97), в согласии с регуляторами само-обновления Box 4 \| Open chromatin and the undifferentiated state in cancer cells The acquired ability of cancer cells to divide perpetually and at the same time to support tumour growth, metastasis and invasiveness, bears resemblance to stem cell biology . It is thought that this acquired immortality is obtained through the activation of stem cell-specific pathways that are essential for self-renewal, such as Wnt, sonic hedgehog (SHH) or Notch pathways 118,119 117. There is also a correlation between the transcriptomes of stem cells and highly undifferentiated cancer cells from tumours with higher proliferation rates and poorer prognosis. For example, myelocytomatosis oncogene (MYC) can reactivate an embryonic stem (ES) cell-like programme in normal and cancer cells 120-124 . However, MYC has several functions, and the mechanism by which MYC activates this ES cell-like programme could be independent of its canonical transcription factor activity . In particular, MYC regulates large domains of euchromatin, possibly by inducing histone hyperacetylation126,127 . It is therefore possible that there are commonalities between undifferentiated cancer cells and ES cells that include a shared transcriptional programme linked with reorganization of the chromatin to include euchromatic histone marks. Some aspects of higher order chromatin conformation may have similarities between ES cells and certain128 undifferentiated types of cancer. For example, loss of heterochromatin markers such as heterochromatin protein 1? (HP1?)129,130 and H3 di-methylated on Lys 9 (H3K9me2) have been observed in metastatic breast cancer and lymphoid cancer cell lines, respectively. In addition, many genes marked with bivalent domains in ES cells, including those encoding tumour suppressors and pro-differentiation factors, further acquire H3K9 methylation in embryonic carcinoma cells and DNA methylation in adult cancer cells 121. These additional repressive marks may contribute to a higher-order chromatin organization and permanent silencing of tumour suppressors and pro-differentiation factor genes in cancer cells. Furthermore, the process of inducing pluripotency has similarities to cellular transformation and is facilitated by the activation of oncogenes such as MYC and the inhibition of tumour suppressors such as p53 (for reviews, see refs 94,132). It will therefore be of interest to explore potential parallels between the regulation of the chromatin state in pluripotent stem cells and cancer cells. такими как E2F1 и zinc-finger X-chromosomal (ZFX). MYC не обязателен для репрограммирования, но он облегчает ранние стадии процесса возможно благодаря его прямому действию на хроматин¹⁰⁰ или косвенному действию посредством репрессии генов дифференцировки¹⁰¹. Способность выяснить, как индивидуальные факторы вносят свой вклад в генерацию iPS клеток будет в значительной степени зависть от методов, которые сделают возможным высоко эффективное синхронизированное репрограммирование, в идеале, с одновременным анализом на уровне одиночной клетки, ни один из них пока невозможен. Тем не менее подобные исследования уже предоставили информацию о регуляции на уровне хроматина репрограммирования. Chromatin reconfiguration during reprogramming. Крупная реконфигурация структуры хроматина, от метилирования ДНК до гистоновых модификаций и пространственного распределения нуклеосом, происходит во время репрограммирования. Такие слои эпигенетический регуляции часто используются как репрезентативные механизмы в соматических клетках для предупреждения нежелательной экспрессии с др. клонов. Как эти эпигенетические барьеры преодолеваются, чтобы осуществить репрограммирование, ключевой вопрос. Несколько линий доказательств подтверждают мнение, что процесс репрограммирования использует редкие стохастические эпигенетические события. Процесс репрограммирования медленный и постепенный с несколькими промежуточными состояниями^101-103. Реактивация эндогенных генов ES клеток, таких как OCT4, может происходить в очень разные временные точки в разных линиях iPS клеток, происходящих из одного и того же клона¹⁰². В конечном счете почти все клетки репрограммируются до плюрипотентности, хотя с разными и часто длительными латентными периодами¹⁰⁴. Ингибирование пути p53/p21 и избыточная экспрессия LIN28 ускоряет кинетику репрограммирования путем увеличения скорости деления клеток, что может способствовать приобретению модификаций ДНК и гистонов. Это подкрепляет идею, что репрограммирование является сложным процессом, который может использовать стохастические события для преодоления эпигенетических барьеров; однако лежащие в основе молекулярные механизмы остаются неизвестными. Интересно, что некоторые из тех же самых эпигенетических барьеров могут также быть преодолены при раковом росте (BOX 4). Недавняя информация, получен от воздействия на репрограммирующиеся клетки агентов, которые влияют на состояние хроматина. В частности, воздействие агентами, которые способствуют деконденсации хроматина, такими как DNMT ингибитор 5-aza-cytidine, HDAC ингибитор valproic acid или G9a methyltransferase chemical inhibitor, ведут к увеличению эффективности генерации iPS клеток и иногда может замещаться определенным транскрипционным фактором^{103, 105-107}. Очевидно, что ключевой ступенью генерации iPS клеток является повторное открытие хроматина соматических клеток. В соответствии с этим недавний беспристрастный скрининг компонентов из экстрактов ES клеток, которые облегчают репрограммирование, показал, что компоненты BAF семейства BRG1 и BAF155 (ref. 108) могут заместить MYC. Более того, они способствуют открытию хроматина во время процесса репрограммирования посредством деметилирования ДНК и увеличению H3K4me3 в промоторных регионах важных транскрипционных факторов¹⁰⁸. Супрессия CHD1 также ингибирует генерацию iPS клеток⁶⁹. Дополнительные доказательства получены в др. исследованиях репрограммирования, таких как перенос ядер соматических клеток¹⁰⁹. Здесь снова BRG1 является важным ядерным фактором для репрограммирования ядер¹¹⁰. Более того, обработка ингибиторами HDAC усиливает эффективность развития после ядерного переноса¹¹⁰. Эти результаты указывают на то, что ремодельеры хроматина, которые поддерживают состояние ES клеток, включая BRG1, BAF155 и CHD1, могут повторно открывать хроматин во время репрограммирования и организовывать активацию транскрипционной сети для плюрипотентности. Transcriptional memory. Финальная информация об эпигенетической регуляции клеточных состояний получена в недавнем наблюдении, что хотя iPS клетки довольно сходны с ES клетками, они могут обнаруживать различия в транскрипции^112,113. Мышиные iPS клетки, по-видимому, сохраняют остаточную сигнатуру метилирования ДНК из своих исходных соматических клеток, сходный феномен наблюдался в человеческих iPS клетках (M.R.-S. laboratory, unpublished observations). Профили транскрипции человеческих iPS клеток становятся более сходными с человеческими ES клетками после нескольких пассажей¹¹², указывая тем самым, что некоторые формы репрограммирования происходят при продолжительном культивировании. Функциональное значение этих транскрипционных различий полностью понятно. Интересно, что у эмбрионов лягушек, генерируемых с помощью ядерного переноса в мышечные клетки, которые экспрессировали мышце-специфический ген myogenic differentiation 1 (MYOD1), экспрессия этого гена сохраняется в немышечном клоне даже после нескольких делений⁸⁷. Эта транскрипционная память может быть обеспечена закреплением гистонового варианта H3.3 (ref. 87). Эта хроматиновая метка может устанавливать посредством неизвестного механизма память генов, которые были до этого транскрибированы в соматических клетках. Такая эпигенетическая память, потенциально обусловленная метилированием ДНК или включением варианта гистонов, может вносить вклад в различия между iPS и ES клетками и указывать на то, что конкурентные эпигенетические влияния м. нарушать повторное открытие хроматина во время репрограммирования. Механистическое понимание этих эпигенетических влияний, которое пока отсутствует, д. пролить свет на только на то, как генерируются iPS , но и также более широко на клеточные переходы, которые возникают во время дифференцировки или трансформации. Conclusions Significant new insights have been gained into the regulation of pluripotency and reprogramming at the chromatin level. The emerging picture is that a globally open chromatin state that is accessible for transcriptional activation is actively maintained in pluripotent stem cells. In this context that is permissive for transcription, there are additional epigenetic mechanisms that promote silencing of lineage-specific genes while leaving them poised for rapid activation. A major gap in our understanding of pluripotency is how the different layers of epigenetic regulation of the chromatin state impact one another and the transcriptional network. Clearly, much effort should now focus on integrating the various levels of epigenetic regulation in pluripotent stem cells — for example, using analyses of genetic epistasis and protein–protein interactions — and understanding how such information may be parsed out during differentiation. New approaches for defining the chromatin landscape are being established, which will allow for a better understanding of the chromatin structure and its significance for the identity of a particular cell type. For example, the use of DamID in D. melanogaster has identifed five different types of chromatin (instead of the classic three: euchromatin, heterochromatin and facultative heterochromatin), according to the chromatin proteins that are bound to these domains¹¹⁶ . They include three types of silencing or repressive chromatin — one bound by HP1, another bound by Polycomb and a third with no apparent known repressive or active marks — which encompass more than 50% of the genome. The euchromatic regions are divided into two domains, one enriched with H3K36me3 and the other mostly bound by regulatory factors, and include most developmental genes. Studies such as this in mammalian cells will hopefully provide a more comprehensive picture of ‘open’ and ‘closed’ chromatin. In addition, much remains to be learned about the mechanisms that regulate epigenetic reprogramming during the generation of iPS cells. We must remember that ES cells and iPS cells are cultured in vitro, and that the molecular mechanisms that underlie their biology evolved for processes in the context of the whole embryo that remain poorly understood and deserve further investigation. Finally, it will be important to assess the significance of the intriguing epigenetic similarities observed between pluripotent stem cells and undifferentiated cancer cells (BOX 4).

Embryonic stem (ES) клетки являются прототипическими плюрипотентными стволовыми клетками^1-3: они обладают способностью генерировать дифференцированное потомство всех трех эмбриональных зародышевых листков (энтодермы, мезодермы и эктодермы), а также зародышевую линию⁴. ES клетки обладают очень высокой способностью к самообновлению и могут увеличиваться почти бесконечно в культуре. В противоположность ES клеткам стволовые клетки взрослых, такие как нейральные стволовые клетки⁵ или гематопоэтические стволовые клетки⁶ обладают более ограниченной способностью к дифференцировке: они обычно генерируют клетки ткани, в которой они располагаются и поэтому наз. мультипотентными.

В последние годы обнаруживается повышенный интерес к плюрипотентным стволовым клеткам, поскольку они многообещающие как модель для изучения развития и болезней in vitro (7,8). Однако происхождение ES клеток из ранних эмбрионов ставит технические и этические ограничения по использованию их в исследованиях и клинике. Плюрипотентные стволовые клетки могут также быть получены из зародышевых линий плодов и взрослых^9-11 и за счет перепрограммирования соматических клеток. Описаны три основных пути репрограммирования соматических клеток к плюрипотентности: перенос ядер из соматических клеток в энуклеированные ооциты; слияние соматических клеток с ES клетками; и индукция плюрипотентности в соматических клетках путем принудительной экспрессии ключевых транскрипционных факторов (BOX 1). Все эти методы репрограммирования остаются пригодными и информативными. Относительные преимущества и недостатки каждого из методов рассмотрены в др. месте¹² и не будут обсуждаться здесь.

Наибольшее внимание привлечено к процессу, в котором плюрипотентность индуцируется в соматических клетках¹³ из-за его технической простоты и широты использования. Путем эктопической экспрессии генов, которые избыточно представлены в ES клетках, набор из 4-х транскрипционных факторов (OCT4 (также известен как POU5F1), Sry-box containing gene 2 (SOX2), myelocytomatosis oncogene (MYC) и Kruppel-like factor 4 (KLF4)) было продемонстрировано репрограммирование дифференцированных мышиных клеток (как эмбриональных, так и взрослых соматических клеток) в induced pluripotent stem (iPS) клетки, которые очень сходны с ES клетками. Неожиданная способность только 4-х факторов индуцировать драматические изменения в судьбе клеток открыло целую новую область исследований. Важно. что клетки человека^14-17 также могут превращаться в iPS клетки с использованием тех же самых 4-х факторов или др. комбинации факторы: OCT4, SOX2, LIN28 and NANOG¹⁷. Следовательно, репрограммирование соматических клеток, в особенности индукция плюрипотентности сильно расширяет возможности базовых исследований и потенциального клинического использования плюрипотентных стволовых клеток. Понимание молекулярной регуляции плюрипотентности принципиально важно и поможет сделать безопасным и эффективным применение плюрипотентных стволовых клеток в клинике.

Состояние плюрипотентности стволовых клеток находится под контролем транскрипционных схем (circuitry), которые включают репрограммирующие факторы, указанные выше (rev.12). Недавние исследования показали, что эта транскрипционная программа осуществляется в контексте 'открытого' состояния хроматина и было предположено, что это состояние позволяет транскрипционным программам быстро переключаться на индукцию дифференцировки18. Это может быть особенно важным для плюрипотентных стволовых клеток, где необходима доступность широкого спектра опций дифференцировки.

Box 1 | Pluripotent stem cells can be derived from several sources There are three sources of pluripotent stem cells in vivo (see the figure, top half). Embryonic stem (ES) cells are derived from the inner cell mass of the blastocyst, before embryo implantation 1-3. Embryonic germ (EG) cells are derived from primordial germ cells (PGCs) during mid-gestation (embryonic days 8.5-12.5 in the mouse) and germline-derived pluripotent stem (gPS) cells are derived from spermatogonial stem cells of neonatal and adult testes. In addition, three major routes for somatic cell reprogramming to pluripotency have been described 12 11 (see the figure, bottom half): fusion between a somatic cell and an ES cell giving rise to reprogrammed hybrid cells; the generation of nuclear transfer embryonic stem (NT-ES) cells, produced by reprogramming of a somatic nucleus by an enucleated oocyte, which is then cultured to the blastocyst stage to allow derivation of ES cells; and the production of induced pluripotent stem (iPS) cells, derived by somatic cell overexpression of reprogramming transcription factors, most commonly OCT4 (also known as POU5F1), Sry-box containing gene 2 (SOX2), myelocytomatosis oncogene (MYC) and Kruppel-like factor 4 (KLF4)13. 9,10 18

Мы обсудим, как организация хроматина регулируется в плюрипотентных клетках.

Open chromatin and pluripotency

Defining open chromatin. Термин хроматин предложен Walther Flemming в 1882, после разработки им новыъ методов гистологического окрашивания, что позволило ему наблюдать уникальные ниеобразные структуры в ядрах. Название chromatin ('stainable material')^19,20. Почти 50 лет спустя в 1928 выло выявлено различие между гетерохроматином и эухроматном Emil Heitz. Он различал эти два компонента хроматина, базируясь на различной сжатости (compaction) в интерфазных ядрах²¹: гетерохроматин наиболее сильно окрашен, компактные области, тогда как эухроматин представлен рыхло окрашиваемым хроматином. На базе преимущественно гистологических доказательств многие стволовые и клетки предшественники от клеток необластов у планарий²² до гематопоэтических стволовых клеток млекопитающих²³, получены классические описания типичной открытой конформации хроматина, т.е. по большей части лишенных гетерохроматина. В этих исследованиях гистологический анализ ядер оказался достаточным, чтобы продемонстрировать достоверные отличия в структуре хроматина в клетках предшественниках и их дифференцированном потомстве.

Open chromatin in pluripotent stem cells. Идея открытого хроматина подтверждена не только гистологическими исследованиями. В последнее время, состояние хроматина плюрипотентных стволовых клеток привлекло большое внимание благодаря его определенным свойствам²⁴. В самом деле, хроматин плюрипотентных стволовых клеток всё больше распознается как открытый по сравнению с хроматином соматических клеток, указывая тем самым, что его общая структура менее конденсирована и что соотношение между эухроматином и гетерохроматином выше, чем дифференцированных клетках.

Прежде всего доказательства получены при визуализации хроматина ES клеток с использованием ЭМ: гетерохроматин превалирует в дифференцированных клетках, но его значительно меньше в недифференцированных ES клетках²⁵. Сходным образом electron spectroscopic imaging (ESI) продемонстрировало, что большинство хроматина в ES клетках гомогенно распределено и в основном лишено компактных гетерохроматиновых блоков, тогда как в дифференцированных клетках хроматин выглядит гетерогенным с четкими блоками компакции²⁶. Важно, что этот паттерн организации хроматина недавно был обнаружен и in vivo: клетки inner cell mass (ICM) мышиного бластоциста на 3.5 день, которые являются источником ES клеток, обладают той же самой открытой конформацией хроматина что и ES клетки²⁷. ICM клетки обнаруживают высоко диспергированный хроматин с достоверно более низким количеством конденчированных кластеров по сравнению с клон-детерминированными клетками. Анализ сжатия глобального хроматина с использованием nucleases, таких как DNase I и micrococcal nuclease (MNase) также показывает, что хроматин становится менее доступным к перевариванию нуклеазами после дифференцировки ES клеток в эмбриоидные тела (EBs) (A.A. and E.M., unpublished observations, and K. Ura, personal communication) или индукции дифференцировки ретиноевой кислотой²⁸.

Относительно низкое содержание гетерохроматина также подтверждает идею, что хроматин нахоится в открытой конформации. Western blot и анализ иммунофлюоресценции гистоновых пост-трансляционных модификаций (post-translational modifications (PTMs)), таких как , триметилирование гистона H3 по Lys9 (H3K9me3), которым богат гетерохроматин (BOX 2), указывает на то, что ES клетки имеют существенно меньше гетерохроматина, чем дифференцированные клетки²⁹. Далее, ChIP-chip анализ на H3K9me2, который формирует 'large organized chromatin K9 modifications' (LOCKs), показал, что эти домены существенно расширяются во время дифференцировки³⁰. Более того, ChIP-seq анализ показал, что H3K9me3 и H3K27me3 увеличиваются от приблизительно 4% в геноме ES клеток до 12% и 16%, соотв., дифференцированных клетках³¹

Box 2 | Chromatin and epigenetic patterns Chromatin is a complex assembly of DNA, histone proteins and other non-histone protein components. Histone proteins form chromatin building blocks, the nucleosomes, around which DNA is wrapped. Each nucleosome consists of an octamer of the canonical core histones H2A, H2B, H3 and H4 and, between two nucleosomes, the histone H1 acts as a linker. Alterations to the chromatin structure that do not affect the genomic sequence are defined as epigenetic modifications. These epigenetic patterns include methylation of DNA, post-translational modifications (PTMs) of histones (also called histone marks) and histone variants that are incorporated into nucleosomes. The amino-terminal tails of histones are subject to various PTMs with either activating or inhibiting effects on transcription, including acetylation, methylation, phosphorylation, ubiquitylation, sumoylation, poly-ADP ribosylation and proline isomerization. The most commonly studied are: methylation, in which histone methyltransferases (HMTs) add a methyl group and histone demethylases (HDMs) remove this group; and acetylation, in which the addition and removal of an acetyl group is regulated by histone acetyltransferases (HATs) and histone deacetylases (HDACs), respectively. Typically, the tri-methylation of Lys 4 in H3 (H3K4me3), together with histone acetylation, signals binding of RNA polymerase II and transcriptional activation. H3K27me and H3K9me3 signal a repressive transcriptional state, although through recruitment of distinct silencing factors. Chromatin-remodelling complexes also often include regulators of PTMs and may mediate incorporation of histone variants (such as H3.3 and H2AZ or macroH2A), which can be associated with either inactive or active chromatin⁵⁸.

Modification of the DNA itself is also important. Cytosine DNA methylation on CpG islands is mediated by DNA methyltransferases (DNMTs) and is usually repressive. DNA methylation is typically a more stable and inheritable epigenetic pattern that can persist for several cell generations. However, DNA methylation can be lost passively by a lack of methylation after replication, and there also appear to be factors that can actively de-methylate DNA⁵⁸. See fIG. 2 for schematic details of these histone and DNA modifications.

C др. стороны, ацетилирование гистонов, общая метка открытого хроматина, как было установлено, увеличивается в недифференцированных ES клетках человека. особенно на H3K9 остатке³².

Существуют также косвенные доказательства, которые подтверждают концепцию преимущественно открытого состояния хроматина в плюрипотентных стволовых клетках. В ES клетках, восстановление флюоресценции после photobleaching экспериментов показывает, что хроматин содержит фракцию рыхло связанных архитектурных белков хроматина, таких как стержневые³³ и линкерные гистоны и heterochromatin protein 1 (HP1) ²⁹; эта фракция не наблюдается в дифференцирующихся клетках^29,33. Кроме того, геном ES клеток транскрипционно гиперактивен: его транскрипты обычно замалчиваемые повторяющиеся элементы, а также кодирующие и некодирующие регионы, приводят к повышенным уровням всей РНК и мРНК²⁶ (FIG. 1). Одним из способов противодействия этой распространяющейся повсюду транскрипции в ES клетках может быть протеосомами обеспечиваемая деградация пре-иниационных транскрипционных ансамблей, которые формируются на специфических регуляторных генах, готовых к транскрипции³⁴.

Итак, эти данные показывают. что хроматин в ES клетках глобально деконденсирован по сравнению с дифференцированными клетками и что значительно меньшая фракция генома в ES клетках организована как репрессивный гетерохроматин. is organized as repressive heterochromatin.

Control of the chromatin landscape

Хроматин в ES клетках характеризуется определенным набором признаков и лучшее знание ферментов, которые модифицируют эту структуру прольет свет на контроль состояния хроматина. Картирование по всему геному стержневых гистоновых PTMs, или гистоновых меток, широко используется в определении эпигенетических паттернов (BOX 2), которые могут регулировать плюрипотентность^30,31,35,36. Кроме того, некоторые модифицирующие хроматин энзимы, такие как DNA methyltransferases (DNMTs), histone methyltransferases (HMTs), histone demethylases (HDMs), histone acetyltransferases (HATs), histone deacetylases (HDACs) и хроматин моделирующие белки, как известно, играют важные роли в ES клетках и будут описаны ниже. Взаимосвязь между регуляцией хроматина и транскрипционной сетью, которая управляет плюрипотентностью ³⁷, также является критической и рассматривается в др. месте³⁸.

Chromatin poised for differentiation. ES клетки обладают глобально открытой хроматиновой структурой с высокими уровнями эпигенетических меток, которые указывают на активную транскрипцию, такие как гистон H3K4me3 и ацетилирование гистонов H3 и H4 (refs 29,32,39). Однако д. существовать механизмы противодействия, которые замалчивают онтогенетические регуляторные гены и предупреждают преждевременную дифференцировку. Считается, что эти онтогенетические регуляторы молчат, но готовы к активации за счет присутствия как активирующих меток (H3K4me3), так и репрессивных меток (H3K27me3) 35,36,39. Такие 'bivalent' домены, хотя не исключительно специфичны для ES клеток, могут приводить к быстрой активации клон-специфических генов благодаря потере H3K27me3, когда индуцируется дифференцировка.

Репрессивная H3K27 метиляционная метка регулируется с помощью белков группы polycomb group (PcG). Белки PcG включают polycomb repressive complex 2 (PRC2), который участвует в добавлении гистоновой метки, и PRC1, который распознает эту метку. Геномный анализ некоторых PcG белков в ES клетках человека и мыши выявил, их локальное скопление на молчащих онтогенетически регуляторных генах^40,41. Более того, гены мишени для PcG белков обнаруживают тенденцию одновременно оккупироваться транскрипционными факторами OCT4, SOX2 и NANOG, которые является критическими регуляторами плюрипотентного состояния. Однако, PcG белки несущественны для самообновления ES клеток: в отсутствие PcG белков, таких как embryonic ectodermal development (EED)^40,42, Suppressor of zeste 12 homologue (SUZ12)⁴¹ и Enhancer of zeste homologue 2 (EZH2)⁴³, ES клетки всё ещё будут накапливаться в недифференцированном состоянии. Однако эти PcG-дефицитные ES клетки не могут замалчивать некоторые клон-специфические маркеры и могут иметь дефекты дифференцировки. PcG белки рекрутируются ДНК мишени с помощью кофактора jARID2 (jumonji/ARID domain-containing 2)⁴⁴. jARID2 также, по-видимому, ингибирует ферментативную активность methyltransferase в PRC2, и таким образом может регулировать как доставку, так и тонкую настройку активности PRC2 в ES клетках и во время дифференцировки^44-47.

Heterochromatin regulation in ES cells. Др. гистоновая метка, которая обычно ассоциирует в генной репрессией это метилирование H3K9, которая возрастает с дифференцировкой ES клеток. Один энзим. которые ответственен за H3K9 метилирование это HMT G9a (известен также как EHMT2). Интересно, что G9a необходима для замалчивания OCT4 после дифференцировки⁴⁸. G9a соединяется непосредственно с промотором OCT4 и ведет к метилированию H3K9, которое сопровождается рекрутированием DNMTs, чтобы пердавать сигнал о более окончательном репрессивном состоянии. G9a может выполнять двойную роль по метилированию H3K9 (как известная HMT) и рекрутировать DNMTs - пример того, как несколько слоев регуляции сопровождают собственно молчание определенных генов⁴⁹. Следовательно, увеличение гетерохроматина, которое происходит после дифференцировки ES клеток, может вносить непосредственный вклад в замалчивание регуляторов самообновления и плюрипотентности. G9a также необходим для установления доменов из H3K9me2 (LOCKs) в дифференцированных клетках³⁰, указывая на более глобальную роль G9a в индуцированной дифференцировкой гетерохроматинизации.

Низкий уровень метилирования H3K9 в недифференцированных ES клетках поддерживается с помощью гистоновых H3K9 HDMs JMJD1A (jumonji domain-containing 1A; также известен как KDM3A) и JMJD2C (также известного как KDM4C). Они регулируют глобальные уровни репрессивных маркеров H3K9me2 и H3K9me3, соотв., и поддерживают ES клеточное состояние за счет непосредственного деметилирования H3K9 в промоторных регионах ES клеточных факторов, делая возможной их экспрессию⁵⁰. Интересно, что гены, кодирующие JMJD1A и JMJD2C, регулируются с помощью OCT4, представляющего позитивную петлю обратной связи, которая интегрирует действие транскрипционных факторов и гистоновых модификаторов, чтобы поддерживать недифференцированное состояние ES клеток.

Др. слой эпигенетической регуляции в ES клетках это метилирование ДНК по CpG островкам. DNMTs ответственны за эту репрессивную метку, которая коррелирует со специфическими гистоновыми метками⁵¹: метилированные CpG островки представляют собой в основном промоторные регионы репрессируемых генов, обычно скоррелированные с неметилированным H3K4 и H3K9me3, затрагивают около 30% генов в ES клетках⁵². Однако , перекрестно-ссылающиеся геномные области с паттернами метилирования и связыванием OCT4, NANOG, SOX2 и PcG обнаруживают мало перекрывания⁵². Более того, ES клетки обнаруживают достоверное величение метилирования вне CpG островков, свойство, которое, по-видимому, уникально для этих клеток⁵³. Эти наблюдения указывают на то, что метилирование ДНК может представлять собой уникальный эпигенетический слой, который дополняет др. механизмы репрессии генов и вносит вклад в тонкую регуляцию транскрипционных программ, которые активируются после дифференцировки.

Chromatin remodelling in ES cells

Добавление или удаление гистоновых меток или метилирование ДНК только один из способов, с помощью которого состояние хроматина может влиять на транскрипционную программу и тем самым на плюрипотентность стволовых клеток. Структура самого хроматина и положение нуклеосом также могут меняться как глобально, так и на уровне специфических генетических локусов с помощью хроматин-ремоделирующих белков, которые изменяют контакты гистоны-ДНК, используя энергию АТФ гидролиза⁵⁴. Разрушение контактов гистоны-ДНК само по себе изучено плохо, но следствием этого является то, что ДНК оказывается подверженной действию регуляторных белков, а нуклеосомы и гистоны становятся более активно подвижными⁵⁵.

Хроматин-ремоделирующие белки могут быть подразделены на 4 семейства: SWI/SNF (switch/sucrose nonfermentable), CHD (chromodomain helicase DNA-binding), ISWI (imitation switch) и INO80 (inositol-requiring 80). Ремодельеры хроматина обычно формируют комплексы, которые содержат каталитическую субъединицу с SWI2/SNF2 ATPase доменом, субъединиц, которая распознает хроматин, и дополнительную регуляторную субъединицу, которая обеспечивает взаимодействия с др. белками и с собственно хроматином⁵⁶. По крайней мере, каждый из этих 4-х семейств существенен для эмбриогенеза мыши (TABLE 1), демонстрируя централную роль, которую ремодельеры хроматина оказывают на развитие. Недавние исследования начинают проливать свет на специфические роли, которые ремодельеры хроматина обнаруживают в ES клетках.

SWI/SNF family. Семейство SWI/SNF состоит из двух основных комплексов: BRG- или BRM-associated factor (BAF) и polybromo BAF (PBAF) (TABLE 1). Существует некоторая гетерогенность в составе BAF и PBAF комплексов в разных типах клеток и тканей⁵⁸. ES клетки содержат специализированный субъединичный состав, наз. esBAF, который динамически регулируется во время дифференцировки и пока не совсем ясно, существуют ли два самостоятельных комплекса (esBAF и esPBAF) в ES клетках или разные субъединицы комбинируют, чтобы сформировать одиночный esBAF.

BRG1 (также известный как SMARCA4) является каталитической субъединицей комплекса esBAF. Он подавляется после дифференцировки и, по-видимому, постепенно замещается др. каталитической субъединицей, BRM^59,60. Brg1-нулевые мыши погибают на пери-имплантационной стадии⁶¹, а нокдаун эксперименты в ES клетках приводят к аберрантной морфологии, снижению скорости пролиферации и редукции способрности к дифференцировке^26,59,62,63. Более того, геномные ChIP-chip и ChIP-seq эксперименты выявляют скопление BRG1 на промоторных регионах генов, которые также оккупируются регуляторами плюрипотентности OCT4, SOX2 и NANOG^63,64. Интересно, что ингибирование BRG1 в ES клетках ведет к активации как онтогенетических генов, так и ES клеточно-специфических генов. Эти результаты указывают на то, что BRG1 может не только вносить вклад в репрессию онтогенетических генов, но и может также тонко настраивать уровень экспрессии генов, специфических для ES клеток, таких как Oct4 и Sox2 (refs 63,64).

Дополнительным членом комплекса BAF, который играет роль в ES клетках, это BAF250 (также известен как ARID1), который содержит две родственные субъединицы, BAF250A и BAF250B. Включение BAF250A в комплекс BAF наиболее выражено в недифференцированных ES клетках, тогда как BAF250B в основном инкорпорируется после дифференцировки⁵⁹. Baf250a-дефицитные ES клетки мыши неспособны поддерживать экспрессию маркеров стволовых клеток и вместо этого активируют гены с известными ролями в раннем развитии и органогенезе⁶⁵. Более того, Baf250a ES клетки склонны к дифференцировке, но они, по-видимому, теряют способность формировать клетки мезодермального клона, это согласуется с отсутствием обнаружимой мезодермы у ранних мышиных Baf250a^-/- эмбрионов⁶⁵. В отличие от Baf250a^-/- ES клеток, Baf250b-^/- ES клетки дают все три зародышевых слоя, но разрушение Baf250b ведет к редукции способности к самообновлению и ускоряет дифференцировку ES клеток⁶⁶.

Существуют противоречивые сообщения также о роли BAF155 (также известного как SMARCC1) в ES клетках^28,59. Он экспрессируется на высоком уровне в ES клетках и его редукция ведет к аберрантной морфологии колоний⁶² и к снижению экспрессии OCT4 в недифференцированных ES клетках. Однако в дифференцирующихся ES клетках потеря BAF155 вызывает нарушения конденсации хроматина и усилению экспрессии OCT4. Базируясь на этих результатах можно предполагать, что стоихометрия разных субъединиц BAF, а не их действительный уровень, предопределяет их функции, что подтверждается этими исследованиями.

CHD family. 4 субъединицы CHD семейства хроматин-моделирующих энзимов - CHD1, CHD3, CHD4 и CHD7 - участвуют в приобретении качественных особенностей и функции ES клетками, хотя механизмы их действия отличаются. CHD1 и CHD7 ещё не ассоциированы четко с известным комплексом (TABLE 1), но последний связывает множественные субъединицы PBAF комплекса в клетках нервного гребня, происходящих из ES клеток человека. В этих клетках нервного гребня и мышиных ES клетках⁶⁸, CHD7 концентрируется в энхансерных регионах вместе с H3K4me1, указывая на то, что CHD7 может поддерживать компетентность к транскрипции как в недифференцированных, так и дифференцирующихся ESклетках.

CHD1 соединяется глобально с активным эухроматином и ко-локализуется с RNA polymerase II (RNAPII) в ES клетках⁶⁹. ES клетки, в которых CHD1 был истощен с помощью RNA interference, накапливают высокие уровни гетерохроматина и, хотя они могут накапливаться в недифференцированном состоянии, они не могут дифференцироваться нормально. Эти результаты указывают на то, что CHD1 устанавливает баланс между эухроматином и гетерохроматином в ES клетках, это может быть критическим для поддержания плюрипотентности.

CHD3 и CHD4 составляют каталитическую субъединицу nucleosome-remodelling (NuRD) комплекса (TABLE 1), которая участвует в регуляции ES клеток. Напр., ES клетки, лишенные NuRD субъединицы methyl-CpG-binding domain 3 (MBD3) сохраняют свою экспрессию OCT4, если индуцированы дифференцироваться и обнаруживают аберрантный потенциал дифференцировки^70,71. MBD3-нокаутированный ES клетки также экспрессируют трофэктодермальные маркеры, которые обычно не обнаруживаются в ES клетках. Делеция др. субъединицы, кодируемой Hdac1, также ведет к аберрантной дифференцировке мышиных ES клеток, приводя к спонтанной генерации мезодермального и эктодермального клона за счет энтодермы⁷². Важно, что нокаут по Hdac1 (но не Hdac2) ведет мышей к эмбриональной летальности^73-76. NuRD, по-видимому, выполняет двойную роль в замалчивании генов дифференцировки в ES клетках, а также специфичных для ES клеток генов во время дифференцировки. Наконец, NuRD субъединицы MBD3 и metastasis-associated 2 (MTA2) взаимодействуют с SWI/SNF компонентом BRG1, особенно в ES клетках, но не в дифференцирующихся клетках⁵⁹, указывая тем самым, что существует перекрестное общение между хроматин-ремоделирующими комплексами в плюрипотентных клетках.

ISWI family. Семейство ISWI family ремодельеров может формировать три самостоятельных комплекса - nucleosome-remodelling factor (NURF), chromatin accessibility complex (CHRAC) и ATP-utilizing chromatin assembly and remodelling factor (ACF) - из которых комплекс NURF, по-видимому, обладает наиболее выделяющейся ролью в ES клетках. Bromodomain PHD finger transcription factor (BPTF), член комплекса NURF, необходим для дифференцировки ES клеток как in vivo, так и in vitro. Bptf-нокаутные ES клетки не мгут формировать тератомы, а Bptf-нокаутные EBs обнаруживают тяжелую дефектную экспрессию маркеров всех трех зародышевых листков. В соответствии с этим, Bptf-нокаутные мышиные эмбрионы дефектны по закладке передне-задней оси во время самых ранних стадий развития и являются эмбриональными леталями на ст. Е8.5 (ref. 77) (TABLE 1).

Box 3 | The actions of chromatin-remodelling factors Chromatin remodellers are ATP-dependent machines that act to alter the local structure of chromatin by repositioning (or 'sliding'), ejecting or incorporating nucleosomes. During DNA replication, for example, a group of chromatin remodellers act to insert nucleosomes into the newly forming chromatin fibre (see the figure, bottom left), but other groups of remodellers are active throughout the cell cycle to modify the local structure of chromatin, thereby regulating gene expression. For example, chromatinremodelling factors such as SWI/SNF (switch/sucrose nonfermentable) and CHD (chromodomain helicase DNA-binding) family proteins can trigger ejection of a nucleosome (top left). Other chromatin-remodelling factors, such as ISWI (imitation switch) family proteins, can slide a nucleosome (top right). The INO80 (inositol-requiring 80) family proteins exchange histone dimers (bottom right), which can introduce histone variants or modified histones, and have a local impact on chromatin activity⁵⁶ .

INO80 family. Члены семейства INO80 могут формировать три самостоятельных комплекса, INO80, SNF2-related CBP activator protein (SRCAP) и TAT-interacting protein of 60 kDa (TIP60; также известен как KAT5)-p400, но только последний, как было установлено, важен в ES клетках. Комплекс TIP60-p400 облегчает транскрипцию путем комбинирования ремоделирования нуклеосом с histone acetylase активностью. ES клетки, истощенные по разным субъединицам TIP60-p400 комплекса обнаруживают довольно сходные фенотипы, включая измененную морфологию колоний, снижение скорости пролиферации, снжение плюрипотентности и общее снижение жизнеспособности⁶², которые, по-видимому, являются фенотипическими отклонениями, специфичными для ES клеток⁷⁸. TIP60-p400 возможно действует, чтобы поддерживать недифференцированное состояние ES клеток путем соединения с H3K4me3 меткой, взаимодействие, которое облегчается с помощью NANOG. Кроме того, TIP60-p400 способствует ацетилированию гистона H4 как активных, так и репрессивных генов⁶², которые также, скорее всего, поддерживают состояние стволовых клеток.

Итак, эти исследования подчеркивают важность хроматин-ремоделирующих комплексов для интеграции транскрипционных программ для плюрипотентности с эпигенетической информацией и для замалчивания этих программ плюрипотентности после дифференцировки. Кроме того, ремоделирование хроматина может потенциально играть более широкую роль в глобальном поддержании открытого состояния хроматина ES клеток.

Maintaining open chromatin in ES cells

Помимо влияния, оказываемого с помощью обогащенных активных гистоновых меток, открытый хроматин может также активно поддерживаться в ES клетках с помощью упомянутого выше АТФ-зависимых хроматин-ремоделирующих энзимов, напр., посредством демонтажа нуклеосом и/или 'раскручивания' хроматиновых структур высокого порядка (BOX 3). Интересно, что экспрессия многих из хроматин-ремоделирующих энзимов значительно обогащена в ES клетках, включая esBAF комплекс и CHD членов²⁶. Возможно, что интеграция высоких уровней гистоновых меток с высокой экспрессией особенно хроматиновых ремодельеров глобально обеспечивает состояние открытого хроматина.

Ремодельер хроматина CHD1 может репрессировать формирование гетерохроматина в ES клетках⁶⁹. Однако механизмы, которые управляют этим открытым хроматином, смещают баланс между эухроматином и гетерохроматином в направлении в направлении первого, неизвестны (FIG. 2). Такие глобальные 'anti-silencing' механизмы были изучены на др. видах. таких как почкующиеся и делящиеся дрожжи, и эти исследования помогли понять принципы, которые управляют этой битвой между гетерохроматином и эухроматином. У дрожжей silent information regulator (SIR) белки соединяются преимущественно с теломерными регионами и способствуют образованию гетерохроматина. Два перекрывающихся механизма предупреждают распространение SIR белков и гетерохроматина: включение гистонового варианта H2AZ и метилирование H3K4, обеспечиваемых methyltransferase SET domain-containing 1 (Set1). Т.о., включение специфических гистоновых вариантов или модификации канонических гистонов предупреждают связывание SIR белков⁷⁹. Др. важным анти-замалчивающим механизмом является гиперацетилирование гистонов, которое также предупреждает SIR от связывания⁸⁰. Локальное молчание, обеспечиваемое с помощью белка SIR семейства Sir3, нуждается в сложном взаимодействии между HAT Sas2, HMTs disrupter of telomere silencing 1 (Dot1) и Set1, и HDM Jhd2 (ref. 81), которое предопределяет динамический баланс молчания против активации путем управления конкурентным добавлением и удалением метильных групп на H3K4 и H3K79. Следовательно, не только могут разные типы гистоновых модификаций (ацетилирование и метилирование) взаимодействовать, чтобы регулировать молчание, но и также существует динамический баланс между противоположными действиями гистон-модифицирующих энзимов, чтобы регулировать формирование эухроматина или гетерохроматина.

Экстраполяция после исследований на теломерах дрожжей одного из возможных механизма, с помощью которого поддерживается открытое состояние хроматина в ES клетках, это отложение специфических вариантов гистонов. Напр., H3.3 обычно ассоциирован с активными генами и менее склонен к H3K9 метилированию^82,83. H3.3 инкорпорируется независимым от репликации способом с помощью шаперона HIRA⁸⁴, и обычно ко-локализуется с регионами, богатыми метилированными H3K4 (refs 85,86). Считается, что это механизм, с помощью которого клетки могут поддерживать транскрипционную память; напр., клон-специфические гены, маркированные с помощью H3.3 всё ещё экспрессируются после репрограммирования у Xenopus laevis⁸⁷. Интересно, что CHD1 необходим в ооцитах Drosophila melanogaster для инкорпорации H3.3 в хроматин спермиев: CHD1-мутантные ооциты не могут инкорпорировать H3.3 в мужские пронуклеусы, которые делают мужской геном неспособным вносить вклад в развитие⁸⁸. Эти результаты демонстрируют широкое воздействие, которое включение H3.3 оказывает на хроматин самцов ^{D. melanogaster}. Возможность, что сходный механизм с использованием включения H3.3 также поддерживает глобальное открытое состояние хроматина ES клеток покажут будущие исследования, даже если учитывать, что этот вариант присутствует также в теломерных регионах⁸⁵.

Альтернативно или в дополнение др. механизмы могут непосредственно защищать H3K4me3 от деметилирования. Связывание хроматиновых ремодельеров, таких как CHD1 непосредственно с H3K4me3 посредством их chromodomains⁸⁹ может защищать от действия деметилаз и селективно кооперировать с HMTs, чтобы поддерживать H3K4me3 метку. Напр., CHD1 взаимодействует посредством своего chromodomain, с HMT ASH2, которая метилирует H3K4 (ref. 90). Эта гистоновая метка предупреждает от связывания репрессивного комплекса, такого как NuRD deacetylation комплекса^91,92 и DNMT субъединицы DNMT3L (ref. 93). Открытие хроматина может также дополняться гиперацетилированием гистонов, как показано для теломер дрожжей⁸⁰. Фактически, HAT и ремоделирующий комплекс TIP60-p400 распознают H3K4me3 и зависят от этой метки при связывании своих мишеней⁶².

Все эти механизмы могут управлять сложной, динамической регуляцией открытым в противовес компактному хроматином в ES клетках (FIG. 2). Поэтому важно определить геномным способом с использованием ChIP-seq, как эпигенетические метки изменяются, когда регуляторы открытого хроматина, такие как CHD1 теряются. Дальнейшие генетические и биохимические исследования, особенно с помощью эпистатического анализа и вычленения межбелковых взаимодействий, д. помочь определить относительный вклад этих механизмов в состояние хроматина и плюрипотентность ES клеток.

Lessons from reprogramming somatic cells

Процесс генерации iPS клеток обращает соматические клетки обратно к плюрипотентному стволовому состоянию, которое очень сходно с таковым в ES клетках и может предоставить альтернативу к использованию ES клеток для выяснения взаимоотношений между открытым хроматином и плюрипотентностью⁹⁴. Хотя молекулярные ориентиры, которые возникают о время репрограммирования были идентифицированы, но процесс остается в основном нерешенным на механистическом уровне. После экспрессии факторов репрограммирования (обычно OCT4, SOX2, MYC и KLF4), активность alkaline phosphatase (AP) и экспрессия маркера клеточной поверхности SSEA1 (также известного как FUT4) являются ранними маркерами недифференцированного состояния. AP и SSEA1 могут обнаруживаться уже на 3 и 9 день, соотв., после нала репрограммирования в клетках мыши. Эндогенная экспрессия OCT4 и NANOG может определяться только спустя 10 дней после индукции, а 4 экзогенных фактора, обычно доставляемые вирусной конструкцией, д. быть экспрессированы во время всего этого периода. Однако клетки полностью репрограммируются только после замалчивания вирусных векторов⁹⁵. Возникает главный вопрос: каковы непосредственные нижестоящие эффекты факторов репрограммирования, которые запускают индукцию плюрипотентности? OCT4 и SOX2 являются частью ауторегуляторной петли, которая поддерживает плюрипотентность в ES клетках⁹⁶, а MYC соединяется с отдельным классом генов, не связанных с OCT4, SOX2 или KLF4 (ref. 97), в согласии с регуляторами само-обновления

Box 4 | Open chromatin and the undifferentiated state in cancer cells The acquired ability of cancer cells to divide perpetually and at the same time to support tumour growth, metastasis and invasiveness, bears resemblance to stem cell biology . It is thought that this acquired immortality is obtained through the activation of stem cell-specific pathways that are essential for self-renewal, such as Wnt, sonic hedgehog (SHH) or Notch pathways 118,119 117. There is also a correlation between the transcriptomes of stem cells and highly undifferentiated cancer cells from tumours with higher proliferation rates and poorer prognosis. For example, myelocytomatosis oncogene (MYC) can reactivate an embryonic stem (ES) cell-like programme in normal and cancer cells 120-124 . However, MYC has several functions, and the mechanism by which MYC activates this ES cell-like programme could be independent of its canonical transcription factor activity . In particular, MYC regulates large domains of euchromatin, possibly by inducing histone hyperacetylation126,127 . It is therefore possible that there are commonalities between undifferentiated cancer cells and ES cells that include a shared transcriptional programme linked with reorganization of the chromatin to include euchromatic histone marks. Some aspects of higher order chromatin conformation may have similarities between ES cells and certain128 undifferentiated types of cancer. For example, loss of heterochromatin markers such as heterochromatin protein 1? (HP1?)129,130 and H3 di-methylated on Lys 9 (H3K9me2) have been observed in metastatic breast cancer and lymphoid cancer cell lines, respectively. In addition, many genes marked with bivalent domains in ES cells, including those encoding tumour suppressors and pro-differentiation factors, further acquire H3K9 methylation in embryonic carcinoma cells and DNA methylation in adult cancer cells 121. These additional repressive marks may contribute to a higher-order chromatin organization and permanent silencing of tumour suppressors and pro-differentiation factor genes in cancer cells. Furthermore, the process of inducing pluripotency has similarities to cellular transformation and is facilitated by the activation of oncogenes such as MYC and the inhibition of tumour suppressors such as p53 (for reviews, see refs 94,132). It will therefore be of interest to explore potential parallels between the regulation of the chromatin state in pluripotent stem cells and cancer cells.

такими как E2F1 и zinc-finger X-chromosomal (ZFX). MYC не обязателен для репрограммирования, но он облегчает ранние стадии процесса возможно благодаря его прямому действию на хроматин¹⁰⁰ или косвенному действию посредством репрессии генов дифференцировки¹⁰¹. Способность выяснить, как индивидуальные факторы вносят свой вклад в генерацию iPS клеток будет в значительной степени зависть от методов, которые сделают возможным высоко эффективное синхронизированное репрограммирование, в идеале, с одновременным анализом на уровне одиночной клетки, ни один из них пока невозможен. Тем не менее подобные исследования уже предоставили информацию о регуляции на уровне хроматина репрограммирования.

Chromatin reconfiguration during reprogramming. Крупная реконфигурация структуры хроматина, от метилирования ДНК до гистоновых модификаций и пространственного распределения нуклеосом, происходит во время репрограммирования. Такие слои эпигенетический регуляции часто используются как репрезентативные механизмы в соматических клетках для предупреждения нежелательной экспрессии с др. клонов. Как эти эпигенетические барьеры преодолеваются, чтобы осуществить репрограммирование, ключевой вопрос. Несколько линий доказательств подтверждают мнение, что процесс репрограммирования использует редкие стохастические эпигенетические события. Процесс репрограммирования медленный и постепенный с несколькими промежуточными состояниями^101-103. Реактивация эндогенных генов ES клеток, таких как OCT4, может происходить в очень разные временные точки в разных линиях iPS клеток, происходящих из одного и того же клона¹⁰². В конечном счете почти все клетки репрограммируются до плюрипотентности, хотя с разными и часто длительными латентными периодами¹⁰⁴. Ингибирование пути p53/p21 и избыточная экспрессия LIN28 ускоряет кинетику репрограммирования путем увеличения скорости деления клеток, что может способствовать приобретению модификаций ДНК и гистонов. Это подкрепляет идею, что репрограммирование является сложным процессом, который может использовать стохастические события для преодоления эпигенетических барьеров; однако лежащие в основе молекулярные механизмы остаются неизвестными. Интересно, что некоторые из тех же самых эпигенетических барьеров могут также быть преодолены при раковом росте (BOX 4).

Недавняя информация, получен от воздействия на репрограммирующиеся клетки агентов, которые влияют на состояние хроматина. В частности, воздействие агентами, которые способствуют деконденсации хроматина, такими как DNMT ингибитор 5-aza-cytidine, HDAC ингибитор valproic acid или G9a methyltransferase chemical inhibitor, ведут к увеличению эффективности генерации iPS клеток и иногда может замещаться определенным транскрипционным фактором^{103, 105-107}. Очевидно, что ключевой ступенью генерации iPS клеток является повторное открытие хроматина соматических клеток. В соответствии с этим недавний беспристрастный скрининг компонентов из экстрактов ES клеток, которые облегчают репрограммирование, показал, что компоненты BAF семейства BRG1 и BAF155 (ref. 108) могут заместить MYC. Более того, они способствуют открытию хроматина во время процесса репрограммирования посредством деметилирования ДНК и увеличению H3K4me3 в промоторных регионах важных транскрипционных факторов¹⁰⁸. Супрессия CHD1 также ингибирует генерацию iPS клеток⁶⁹. Дополнительные доказательства получены в др. исследованиях репрограммирования, таких как перенос ядер соматических клеток¹⁰⁹. Здесь снова BRG1 является важным ядерным фактором для репрограммирования ядер¹¹⁰. Более того, обработка ингибиторами HDAC усиливает эффективность развития после ядерного переноса¹¹⁰. Эти результаты указывают на то, что ремодельеры хроматина, которые поддерживают состояние ES клеток, включая BRG1, BAF155 и CHD1, могут повторно открывать хроматин во время репрограммирования и организовывать активацию транскрипционной сети для плюрипотентности.

Transcriptional memory. Финальная информация об эпигенетической регуляции клеточных состояний получена в недавнем наблюдении, что хотя iPS клетки довольно сходны с ES клетками, они могут обнаруживать различия в транскрипции^112,113. Мышиные iPS клетки, по-видимому, сохраняют остаточную сигнатуру метилирования ДНК из своих исходных соматических клеток, сходный феномен наблюдался в человеческих iPS клетках (M.R.-S. laboratory, unpublished observations). Профили транскрипции человеческих iPS клеток становятся более сходными с человеческими ES клетками после нескольких пассажей¹¹², указывая тем самым, что некоторые формы репрограммирования происходят при продолжительном культивировании. Функциональное значение этих транскрипционных различий полностью понятно. Интересно, что у эмбрионов лягушек, генерируемых с помощью ядерного переноса в мышечные клетки, которые экспрессировали мышце-специфический ген myogenic differentiation 1 (MYOD1), экспрессия этого гена сохраняется в немышечном клоне даже после нескольких делений⁸⁷. Эта транскрипционная память может быть обеспечена закреплением гистонового варианта H3.3 (ref. 87). Эта хроматиновая метка может устанавливать посредством неизвестного механизма память генов, которые были до этого транскрибированы в соматических клетках.

Такая эпигенетическая память, потенциально обусловленная метилированием ДНК или включением варианта гистонов, может вносить вклад в различия между iPS и ES клетками и указывать на то, что конкурентные эпигенетические влияния м. нарушать повторное открытие хроматина во время репрограммирования. Механистическое понимание этих эпигенетических влияний, которое пока отсутствует, д. пролить свет на только на то, как генерируются iPS , но и также более широко на клеточные переходы, которые возникают во время дифференцировки или трансформации.

Conclusions

Significant new insights have been gained into the regulation of pluripotency and reprogramming at the chromatin level. The emerging picture is that a globally open chromatin state that is accessible for transcriptional activation is actively maintained in pluripotent stem cells. In this context that is permissive for transcription, there are additional epigenetic mechanisms that promote silencing of lineage-specific genes while leaving them poised for rapid activation. A major gap in our understanding of pluripotency is how the different layers of epigenetic regulation of the chromatin state impact one another and the transcriptional network. Clearly, much effort should now focus on integrating the various levels of epigenetic regulation in pluripotent stem cells — for example, using analyses of genetic epistasis and protein–protein interactions — and understanding how such information may be parsed out during differentiation. New approaches for defining the chromatin landscape are being established, which will allow for a better understanding of the chromatin structure and its significance for the identity of a particular cell type. For example, the use of DamID in D. melanogaster has identifed five different types of chromatin (instead of the classic three: euchromatin, heterochromatin and facultative heterochromatin), according to the chromatin proteins that are bound to these domains¹¹⁶ . They include three types of silencing or repressive chromatin — one bound by HP1, another bound by Polycomb and a third with no apparent known repressive or active marks — which encompass more than 50% of the genome. The euchromatic regions are divided into two domains, one enriched with H3K36me3 and the other mostly bound by regulatory factors, and include most developmental genes. Studies such as this in mammalian cells will hopefully provide a more comprehensive picture of ‘open’ and ‘closed’ chromatin.

In addition, much remains to be learned about the mechanisms that regulate epigenetic reprogramming during the generation of iPS cells. We must remember that ES cells and iPS cells are cultured in vitro, and that the molecular mechanisms that underlie their biology evolved for processes in the context of the whole embryo that remain poorly understood and deserve further investigation. Finally, it will be important to assess the significance of the intriguing epigenetic similarities observed between pluripotent stem cells and undifferentiated cancer cells (BOX 4).

Open chromatin in pluripotency and reprogramming Alexandre Gaspar-Maia, Adi Alajem, Eran Meshorer and Miguel Ramalho-Santos ‡ NATURE REVIEWS | Molecular cell Biology VOLUME 12 | JANUARY 2011 | 36-47 | doi:10.1038/nrm3036

Open chromatin in pluripotency and reprogramming
Alexandre Gaspar-Maia, Adi Alajem, Eran Meshorer and Miguel Ramalho-Santos ‡
NATURE REVIEWS | Molecular cell Biology VOLUME 12 | JANUARY 2011 | 36-47 | doi:10.1038/nrm3036