HSPGs играют критические роли в регуляции передачи сигналов ростовых факторов посредством разнообразных механизмов, включая функции корецепторов, секвестрацию лигандов, регуляцию морфогенетических границ и детерминацию судеб стволовых клеток (Rapraeger et al" 1991; Lander, 1998; Munoz et al" 2006; Dombrowski et al" 2009). Syndecan-3, трансмембранный HSPG, экспрессируется в SCs взрослых, ранее был описан как участвующий в миогенезе взрослых (Fuentealba et al., 1999; Cornelison et al., 2001; Cornelison et al., 2004), но механизм оставался непонятным. Тщательная характеристика sdc3^-/- фенотипов in vitro и in vivo, в комбинации с объективным анализом экспрессии гена и передачи сигналов позволили нам прояснить механизмы, участвующие в обеспечиваемой Syndecan-3 регуляции миогенеза у взрослых.

Чтобы идентифицировать сигнальные пути, вносящие вклад в фенотип sdc3^-/-, мы предприняли анализ глобальной генной экспрессии мышц дикого типа и неповрежденных sdc3^-/- SCs и спустя 12 ч после повреждения. IPA анализ данных по экспрессии генов выявил неспособность индуцировать гены мишени для Notch в sdc3^-/- клетках после повреждения мышц и увеличение экспрессии Numb. Увеличение экспрессии Numb может быть объяснено потерей передачи сигналов Notch, т.к. Numb направляет Notch на деградацию с помощью протеосом (McGill and McGlade, 2003). В культурах при низком давлении кислорода наблюдалось снижение Numb белка в sdc3^-/- SCs, но это не останавливало передачи сигналов Notch, подтверждая, что увеличение уровня Numb вряд ли отвечает за нарушение передачи сигналов Notch в sdc3^-/- SCs. Вместо этого Numb может действовать в SCs независимым от Notch способом, соответственно недавно описанной роли Numb в эмбриональном миогенезе (Jory et al., 2009).

Протеогликаны участвуют в связывании и передаче сигналов, по крайней мере, 200 секретируемых факторов, часто взаимодействующих с proteoglycan GAG цепями (Bass et al., 2009). Несмотря на постулированную в предыдущих публикациях роль heparan sulfate 3-0-sulfotransferase в передаче сигналов Drosophila Notch (Kamimura et al., 2004), потребность в протеогликанах для передачи сигналов Notch не была исследована. Мы продемонстрировали взаимодействие между Syndecan-3 и Notch 1 с помощью PLA в SCs, и с помощью зависимой от дозы ко-иммунопреципитации обоих белков, что в дальнейшем подтверждено наблюдением, что величина ко-иммунопреципитации Notch с Syndecan-3 варьирует, когда процессинг Notch ингибируется или усиливается. Syndecan-3, по-видимому, облегчает TACE-обеспечиваемое расщепление Notch, ключевую ступень в передаче сигналов Notch после соединения с лигандом. Поскольку молекулярные механизмы, ответственные за heparan sulfate-обеспечиваемую регуляцию сигнальных путей, часто используют непосредственное взаимодействие HSPG GAG цепей или с ростовыми факторами или с соотв. им рецепторами (Bass et al., 2009), то мы задались вопросом, участвуют ли цепочки гликозаминогликанов или стержневой белок в Syndecan-3, или оба в регуляции передачи сигналов Notch. Устранение sulfation с помощью обработки chlorate снижает активность Notch репортера, это подтверждает участие HSPG GAG цепочек: , однако, активность Notch репортера в sdc3^-/- клетках не может быть восстановлена с помощью экзогенного heparin (unpublished data). Наши данные демонстрируют важную роль Syndecan-3 в регуляции судьбы SC, что частично обеспечивается посредством передачи сигналов Notch, при этом как GAG цепочки, так и стержневой белок, по-видимому, играют ключевые роли.

Syndecan-3 b Notch являются компонентами ниш SC. Находка, что Syndecan-3 способствует преобразованию и передаче сигналов Notch представляет собой дальнейший шаг в понимании механизмов, которые регулируют функцию ниши SC. В этом сценарии Syndecan-3-Notch взаимодействие, по-видимому, играет важную роль в регуляции пролиферации SC, детерминации терминальной дифференцировки и самообновлении. Мы тестировали эту возможность и нашли, что Syndecan-3 регулирует баланс между пролиферацией, дифференцировкой и самообновлением SC. В отсутствие Syndecan-3 клетки SCs проходят значительно медленнее через S фазу, это ведет к снижению экспансии клеток предшественников, задержке начала дифференцировки и увеличению клеточной гибели в дополнение к снижению само-обновления. Поскольку конституитивная активация передачи сигналов Notch в sdc3^-/- SCs восстанавливает ход поврежденного клеточного цикла и нарушенное самообновление, поэтому мы постулировали, что Syndecan-3 and Notch кооперируются при регуляции хода клеточного цикла и детерминации клеточной судьбы SCs.

Мало известно, кстати, относительно возможных механизмов, с помощью которых Notch непосредственно регулирует пролиферацию SC (Gustafsson et al., 2005; Carlson et al.. 2008). Передача сигналов Notch, как известно, ингибирует миогенную дифференцировку и поэтому было предположено, что она косвенно способствует экспансии недифференцированных предшественников (Luo et al., 2005). Однако недавняя работа описывает роль передачи сигналов Notch в противодействии TGF-β-зависимой активации циклин-зависимых киназных ингибиторов, включая p15, p16, p21 и p27 (Carlson et al., 2008). Поскольку p21 и p15 играют ключевую роль в регуляции intra-S phase checkpoints TGF-β-зависимым способом в др. клетках предшественниках (Zhu et al., 2004; Jirmanova et al., 2005; Kan et al., 2007; Petrov et al., 2008), то вполне возможно, что p15 и p21 регулируют intra-S phase checkpoints также в SCs. Мы полагаем, что ингибирование передачи сигналов Notch в SCs, или благодаря старению окружающей среды (Conboy et al., 2003; Carlson et al., 2008) или потери Syndecan-3, приводит к повышенной экспрессии ингибиторов intra-S phase checkpoint (включая p15 и p21), это ведет к задержке прохождения через S-фазу, увеличению времени удвоения клеток, снижению клеточной жизнеспособности

Figure 7. A model predicting SC behavior in sc/c3-/~ muscles. (A) In wild-type SCs, Syndecan-3 and Notch reside in a complex where Syndecan-3 facilitates Notch processing and NICD generation. Quiescent SCs (yellow cells) are activated and commit to myogenesis (green cells), where cooperation between Syndecan-3 and Notch promotes cell cycle progression and self-renewal, and inhibits terminal differentiation (red cells) and fusion to existing myofibers. Once muscle repair is completed, SCs cease proliferation and undifferentiated cells return to a quiescent state. Repaired myofibers appear indistinguishable from uninjured myofibers. (B) In sdc3'/' SCs, Notch processing is impaired and NICD generation is dramatically reduced. Once sc/c3"/_ SCs are activated and commit to myogenesis, the lack of Syndecan-3 and Notch signaling impairs cell cycle progression, delays onset of terminal differentiation, and reduces SC self-renewal. Activated sdc3 v ' SCs fail to return to quiescence but remain in an activated state that leads to myofiber hypertrophy. An increase in cell death and the lengthening of cell cycle progression contribute in maintaining constant the total number of nuclei per tissue area. However, the balance between terminal differentiation and self-renewal is disrupted in sdc3~/~ regenerating muscles, whereby more nuclei are found in hypertrophic myofibers and less in mononucleated sublaminar Pax7* cells (SCs). Notch-independent Syndecan-3-dependent signaling pathways are not depicted in this diagram.

и в конечном итоге к снижению пролиферации SC (Fig. 7; Carlson et al., 2008). Наши результаты расширили наше предыдущее исследование, предоставив дополнительную механистическую информацию о роли передачи сигналов Notch в регуляции пролиферации SC (Fig. 7). Более того, наши данные предоставили доказательства того, что регуляция клеточного цикла непосредственно влияет на регуляцию выбора судьбы SC, включая детерминацию терминальной дифференцировки и клеточной гибели. Как повышенная клеточная гибель, так и задержка начала дифференцировки наблюдаются как непосредственное следствие аберрантного прохождения через intra-S phase checkpoints, приводя к аресту клеточного цикла и гибели или к задержке выхода из клеточного цикла и, следовательно, начала терминальной дифференцировки (Fig. 7; Carlson et al., 2008).

Уменьшение передачи сигналов Notch у старых мышей приводит к аберрантной функции SC и тяжело нарушает регенерацию мышц спустя 5 дней после повреждения мышц, но эффекты редукции или потери передачи сигналов Notch на более поздних стадиях регенерации мышц не были проверены (Conboy et al., 2003; Brack et al.. 2008; Smythe et al., 2008; Carlson et al., 2009). Поэтому мы исследовали регенерацию мышц у sdc3^-/- мышей спустя 2 , 6 недели и 3 мес. после повреждения. Несмотря на нарушение функции SC , наблюдаемую на ранних стадиях регенерации мышц, которая сходна с теми, что наблюдаются у старых поврежденных мышц (Carlson et al., 2008), мышечная регенерация sdc3^-/- мышей не обнаруживала нарушений спустя 3 мес. после повреждения. Вместо предсказанных, исходя из клеточного цикла и клеточных судеб, фенотипов культивируемых sdc3 SCs, регенерировавшие sdc3^-/- мышцы имели фенотипы, согласующиеся с тяжелым дисбалансом принятия решений о клеточных судьбах. Sdc3^-/- клетки предпочитали дифференцироваться в противовес самообновлению, создавая дисбаланс, который приводил к образованию аномально крупных миофибрилл, что сопровождалось уменьшением количества Pax7⁺ SCs. Хотя гибель SC повышена, а самообновление снижено в sdc3^-/- поврежденных мышцах по сравнению с контролем, общее количество ядер на область ткани и общий вес мышц были неотличимы в sdc3^-/- и дикого типа поврежденных ТА мышцах (unpublished data). Эти данные согласуются с данными по культивируемым sdc3^-/- SCs, где мы предсказали, что sdc3^-/- SCs, активированные повреждениями in vivo д.сохранять своё состояние пролиферации дольше, счем клетки дикого типа из-за нарушений прохождения их через клеточный цикл. Дальнейшим подтверждением этой идеи является наблюдение, что гипертрофия мышечных волокон в регенерирующих мышцах увеличивается постепенно со временем при сравнении sdc3^-/- ТА мышц с мышцами дикого типа. Эти sdc3^-/- фенотипы, по-видимому, в основном Notch-зависимы, поскольку эктопическая экспрессия конституитивно активного NICD восстанавливала как прохождение sdc3^-/- SC через клеточный цикл, так и самообновление в культуре. Однако мы не может полностью исключить возможность вклада Syndecan-3 в др. сигнальные пути.

Генетическое устранение Syndecan-3, компонента клеточного glycocalix, как ожидалось, должно влиять на несколько сигнальных путей, поскольку glycocalix является сложным и интегрирует сигналы окружающей среды так что изменения или потеря одного из компонентов д. влиять на некоторые др. компоненты, умножая нижестоящие эффекты (Carey, 1996: Rapraeger. 2000; Tkachenko et al.. 2005). Действительно, ранее мы продемонстрировали, что передача сигналов FGF и HGF в sdc3^-/- клетках усиливается по сравнению с дикого типа SCs (Cornelison et al., 2004). Последующие исследования позволят лучше понять механизмы, участвующие во взаимодействиях Syndecan-3 с Notch и позволят прояснить, до какой степени др. сигнальные пути затрагиваются, когда этот важный компонент теряется нишами SC.