Посещений:
АВТОНОМНОЕ ОБРАЗОВАНИЕ ГЛАЗНОГО БОКАЛА

Эмбриональные Стволовые Клетки

Regenerative medicine:DIY eye
ROBIN R. ALI & JANE C. SOWDEN
NATURE VOL 472 I N 7341 | 2011

Generation of complex organs in vitro is a major challenge in regenerative medicine. But it is not an impossible one: an entire synthetic retina has now been generated from embryonic stem cells. See Article p.51 4 2

В данном номере, Eiraku et al. предоставии серию экстраординарных видео с записью формирования эмбрионального глаза мыши: впервые мы видим разворачивание в реальном времени замечательных событий, которые составляют ранние стадии развития глаза млекопитающих. Ещё более удивительно то, что это записи не живого животного, а самоорганизующейся трехмерной (3D) культуры эмбриональных стволовых клеток.
В своих наиболее важных экспериментах Ганс Шпеман, основатель биологии развития, показал, что разрушенный зрительный пузырек (структура, которая в конечном итоге превращается в зрительный бокал) неспособен обеспечивать образование хрусталика. Взаимодействие поверхностной эктодермы (из которой разивается хрусталик) с подлежащим зрительным пузырьком рассматривается как классический пример эмбриональной индукции — процесса, с помощью которого сигналы от одной группы клеток к соседней группе влияют на их будущее развитие. Идентифицирован ряд генов, многие из которых кодирую транскрипционные факторы или факторы роста, которые существенны для формироания зрительного бокала.
Вероятность выращивания сложных органов, таких как глаз, в чашках, однако, выглядит как далекое будущее, хотя эта удаленная граница регенеративной медицины становится всё ближе и ближе. В последнюю декаду вдохновляющая работа2 показала, что экспрессия транскрипционных факторов области галаз может вызывать образование глаз в необычных местах вдоль тела лягушки Xenopus. Более того, вследствие генерации эмбриональных стволовых (ES) клеток человека, стала возможной3'4 прямая их дифференцировка в направлении клона сетчатки и генерация как пигментного эпителия сетчатки (retinal pigmented epithelium (RPE)), так и ретинальных нейронов (Fig. 1). Подходы по культивированию клеток стали основным искомым по максимализации развития специфических типов клеток с потенциальной целью трансплантации таких клеток для терапевтических целей.
In vitro, клетки RPE, происходящие из ES клеток, самоорганизуются в характерный простой монослой. Напротив, репродукция более сложной и точной ламинарной организации нейральной сетчатки представлят собой трудную ткане-инжинерную задачу. Но появились сообщения, описывающие хрусталико-подобные структуры и розетки из ретинальных предшественников в ES-культивируемых клетках6, намекающие на некий потенциал организации глазной ткани in vitro.
Теперь, Eiraku et al. (page 51) показали с потрясающей красотой и удивительной ясностью, что сложный процесс эвагинации зрительного пузырька, а затем и, а затем его инвагинации, чтобы сформировать двухслойный бокал, может происходить спонтанно в культуре, начиная с популяции гомогенных плюрипотентных клеток — клеток, которые могут дифференцироваться в любой тип клеток (see Fig. 1 of the paper1 and the supplementary videos).
Ключ этих успехов, которых достигли Eiraku с коллегами, не просто упрощение их предыдущего протокола дифференцировки в ES культурах, был такж добавлен Matrigel, который включает компоненты внеклеточного матрикса. В этих условиях м с использованием репортерного гена green fluorescent protein (GFP), экспрессируемого в области глаза и нейральной сетчатки, они установили, что слой, подобный нейроэпителию, из GFP-позитивных клеток эвагинирует со стороны полого шара из ES клеток, в виде процесса, напоминающего образование зрительного пузырька. Со временем зрительный пузырек спонтанно подвергается динамическому морфогенезу и формирует двухслойный бокал. Видны рудименты бокалов зрелых глаз: двухслойные зрительные бокалы, частично энкапсулируют хрусталиковый пузырек, сформированный из области поля глаза передней нервной пластинки и покрывающей поверхностной эктодермы (Fig. 1). Из внутреннего слоя бокала развивается сложная ламинарная структура нейральной сетчатки со свет воспринимающими фоторецепторными клетками, соединяющимися посредством промежуточных нейронов с ретинальными ганглиолярными клетками, чьи аксональные отростки проецируются в высшие центры зрения в головном мозге.
Механизмы, лежащих в основе развития эмбрионального глаза, начинают экспрессировать всё более соответствующие определенные молекулярные маркеры как нейральной сетчатки, так и RPE, подтвержая их принадлежность; др. показателем стала видимая пигментация RPE.
Ещё более поразительным подтверждением, что они являются действительно сетчаткой, является то, что в культуре синтетические зрительные бокалы подвергаются дифференцировке. В самом деле, клетки предшественников сетчатки — мультипотентные клетки нейральной сетчатки — делятся и дифференцируются во все основные типы ретинальных нейрональных клеток, включая фоторецепторы. Эти события, по-видимому, следуют нормальной временной последовательности образования ткани сетчатки, а возникающие в результате клдетки правильно организуются в соответствующий клеточный слой.
Но даже если зрительные бокалы могут теперь выращиваться в культуре из ES клеток, мы всё ещё не в состоянии полностью понять принципы, лежащие в основе их развития. Напр., удивительно, что зрительные бокалы могут формироваться независимо от какого-либо взаимодействия нейроэпителиальных клеток с поверхностной эктодермой или мезенхимной тканью, которые обычно окружают из в развивающемся эмбрионе (Fig. 1). Eiraku et al. полагают, что происходящие из ES клеток летки сетчатки обладают латентной внутренне присущей упорядоченностью и что коллеции клеток могут сами формировать паттерн и подвергаться динамичному морфогенезу, повинуясь последовательной комбинации локальных правил и внутренних сил внутри эпителия.
Однако мощь системы Eiraku and colleagues' in vitro обладает большим потенциалом, т. к. она может манипулировать с опрпделенными молекулярными взаимодействиями, которые важны для развития глаз. Более того, если могут продуцироваться наружные функциональные палочковидные сегменты — где располагаются ответственные за фототрансдукцию белковые комплексы — в долговременных культурах, то такая трехмерная система будет бесценной для функциональных исследований реакции сетчатки на свет.
Более того, развитие эквивалентной трехмерной системы человека д открыть путь моделирования болезней и тестирования лекарств, используя индуцированные плюрипотентные клетки, сгенерированный из ткани пациентов. Большинство форм неизлечимой слепоты возникает в результате потери фоторецепторных клеток, оставляя остальные нейроны сетчатки интактными. У мышей трансплантации клеток предшественников фоторецепторов, выделенных из сетчатки развивающихся мышей могут репарировать сетчатку взрослых8. Основная задача в получении достаточных количеств предшественников фоторецепторов. Одной из возможностей является соразмерность с помощью соотв. стадии развития из возобновляемого источника клеток. Трехмерная система культвирования ES клеток может решить эту проблему путем создания синтетических сетчаток на опрпделенной стадии развития, из которой могут быть выделены предшественники, готовые к трансплантации.

  • 1. Eiraku, M. eta/. Nature472, 51-56(2011).
  • 2. Zuber, M. E„ Gestri, G„ Viczian, A. S„ Barsacchi, G. & Harris, W. A. Development 130, 5155-5167 (2003).
  • 3. Lamba, D. A., Karl, M. 0., Ware, C. B. & Reh, T. A Proc. Natl Acad. Sci. USA 103, 12769-12774 (2006).
  • 4. Osakada, F. etal. Nature Biotechnol. 26,215-224 (2008).
  • 5. Yang, C. ef a/. FASEB J. 24,3274-3283 (2010).
  • 6. Meyer, J. S .et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 106, 16698-16703 (2009).
  • 7. Ikeda, H. etal. Proc. Natl Acad. Sci. USA 102, 11331-11336(2005).
  • 8. MacLaren, R. E. et al. Nature 444,203-207 (2006).


    • Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture
    Mototsugu Eiraku, Nozomu Takata, Hiroki Ishibashi, Masako Kawada, Eriko Sakakura, Satoru Okuda, Kiyotoshi Sekigiichi, Taiji Adachi & Yoshiki Sasai
    NATURE VOL 472, N 7341, Р. 51, doi:10.1038/nature09941

    Balanced organogenesis requires the orchestration of multiple cellular interactions to create the collective cell behaviours that progressively shape developing tissues. It is currently unclear how individual, localized parts are able to coordinate with each other to develop a whole organ shape. Here we report the dynamic, autonomous formation of the optic cup (retinal primordium) structure from a three-dimensional culture of mouse embryonic stem cell aggregates. Embryonic-stem-cell-derived retinal epithelium spontaneously formed hemispherical epithelial vesicles that became patterned along their proximal-distal axis. Whereas the proximal portion differentiated into mechanically rigid pigment epithelium, the flexible distal portion progressively folded inward to form a shape reminiscent of the embryonic optic cup, exhibited interkinetic nuclear migration and generated stratified neural retinal tissue, as seen in vivo. We demonstrate that optic-cup morphogenesis in this simple cell culture depends on an intrinsic self-organizing program involving stepwise and domain-specific regulation of local epithelial properties.


    Рис.1.      |  Self-formation of an optic-cup-like structure in 3D culture of ES cell aggregates.


    Рис.2.      | Progressive morphogenetic changes of ES-cell-derived retinal epithelium


    Рис.3.      |  Stepwise acquisition of domain-specific epithelial properties.


    Рис.4.      |  Self-patterning into neural retina and RPE via interactions with neuroectodermal epithelium


    Рис.5.      |  Generation of stratified neural retina tissues from ES-cell-derived invaginated epithelia.

    Зачаток сетчатки, который демаркируемый с помощью Rx (также наз. Rax) экспрессии13,14, впервые появляется как зрительный пузырек, эпителиальный пузырек, эвагинирующий латерально от диэнцефалона. Затем его дистальная часть инвагинирует, чтобы сформировать двухстеночную бокал-подобную структуру, зрительный бокал (Supplementary Fig. la), который развивается в наружный (пигментированный) и снутренний (нейросенсорный) слои сетчатки. Развитие зрительного бокала происходит в сложных условиях, завивимых от многих соседних тканей. Поэтому его механистический анализ довольно непрост и такая сложность приводит к противоречивым результатам9,10, в особенности, относительно потребности в поверхностной эктодерме и хрусталике для инвагинации нейральной сетчатки15-18.
    Здесь обсуждается экспериментальный подход с использованием трехмерной (3D) культуральной системы эмбриональных стволовых (ES) клеток9,20 и успешное снижение сложности этого органогенетического процесса.

    Optic-cup self-formation in 3D ES cell culture


    Ранее мы продемонстрировали самообразование стратифицированной ткани коры головного мозга в культуре, в которой плавающие агрегаты ES клеток культивировали в условиях низкого уровня фактора роста (serum-free floating culture of embryoid-body-like aggregates with quick reaggregation or SFEBq)20,21. Мы смогли также индуцировать дифференцировку сетчатки в модифицированнаой SFEBq культуре с использованием временного воздействия activin22, но не наблюдалось образования четких ретианальных эпителиальных структур (data not shown). Поэтому мы модифицировали культуральную среду (see Methods) и добавили компоненты матрикса базальной мембраны (matrigel) , чтобы способствовать образованию ригидных непрерывных эпителиальных структур23 (Supplementary Fig. lb-d). Эти модификации существенно улучшили эффективность индукции сетчатки, давая в результате 30-70% Rx-GFP клеток от общего числа клеток (обычно, ~80% агрегатов оказывались строго позитивными по Rx-GFP; see Supplementary Fig. le в зависимости от сигналов integrin). Сходный высокий процент индукции Rx наблюдался при обработке агрегатов ES клеток определенными матричными белками (очищенные laminin и entactin) в присутствии белка из семейства активинов Nodal в течении 1-7 дня (Supplementary Fig. If).
    На 6-й день первоначально гомогенные агрегаты ES клеток формировали пустотелые шарики, состоящие из поляризованного по N-cadherin ' нейроэпителия с апикальной поверхностью внутрь (Supplementary Fig. lg-j), которые спонтанно подразделялись на Rx-GFP+ и Rx-GFP- части (Fig. la and Supplementary Movie 1). На 7-й день, Rx-GFP+ участки формировали полусферические эпителиальные пцзырьки, эвагинирующие от основного тела от одного до 4-х пузырьков на агрегат (73.7 ± 2.5% Rx+ сфер; Fig. lb, c). Сформированные из Rx-GFP+ ткани были Pax6+Sox- (Fig. Id, e), что согласуется с экспрессией ретинальных маркеров19,22, тогда как Rx-GFP- участки не были ретинальным нейроэктодермальным эпителием (Sox+4Fig. le).
    Важно, на 8-10-й день Rx-GFP+ подвергались динамическому изменению формы и давали двухстеночную бокал-подобную морфологию (57.0 ± 4.7% пузырьков, Fig. If, g and Supplementary Fig. Ik, 1; обычно 200-400 pm в диаметре; оптический бокал у мышей на ст. E10.5 составляет ~300 pm). Дистальная часть пузырька инвагинирует и экспрессирует маркеры сетчатки13.14,24 такие как ChxlO (также наз. Vsx2) и Six3 в дополнение к Rx и Pax6 (Fig. lh, i and not shown). Напротив, проксимальный эпителий, теперь формирующий наружную стенку, экспрессирует Pax6, Mitf, Coup-TF2 (также наз. Nr2f2), Otx2 и connexin 43 и низкий уровень Rx (Fig. li, j and Supplementary Fig. lm-p), это напоминает профиль маркеров предщественников ретинального пигментного эпителия (RPE)4,25. Эта наружная часть постепенно становится пигментированной (Fig. Ik). Подобно in vivo, из ES клеток происходящий глазной бокал имеет четкую апикально (aPKC)-бахальную (laiminin) полярность (Fig. 11), а внутренняя инвагинированная часть вогнута своей апикальной стороной.
    Важно, что формирование глазного бокала в культуре из ES клеток происходит в отсутствие хрусталика (no crystalline ' tissue; n = 50 aggregates) или поверхносной эктодермальной ткани (см. in vivo ситуацию на Fig. lm and Supplementary Fig. lq; сравни с Fig. lh), показывая, что инвагинация не вызывается внешними структурами, а происходит самоуправляемым способом (Fig. In). Гидростатическое давление, по-видимому, не играет существенной роли, поскольку открытая небольшая полость, проходящая насквозь нейроэктодермальны эпителий не влияет существенно на образование глазного бокала.

    Four phases of 3D eye-cup morphogenesis


    Мы продолжили анализ морфогенетического процесса в 3D, используя специально приготовленную мультифотоновую прижизненную систему в комбинации с полноразмерным C02/02 инкубатором (Fig. 2a and Supplementary Fig. 2a, b), который делает возможной постоянные, здоровые для культивирования условия в течение недели или более (see Fig. 2b and Supplementary Movie 2, part a, for an example of the time-lapse deep imaging). Процесс инвагинации заключается в 4-х последовательных фазах (Fig. 2c, d and Supplementary Movie 2, parts b, c), согласующихся с развитием in vivo26. На 6-й день эвагинирующий был полусферическим по форме (фаза 1). В фазе 2, происходящей приблизительно на 7-й день, дистальная часть пузырька становилась уплощенной (Supplementary Fig. 2c). Затем в фазе 3, угол в месте соединения (шарнира) между доменами нейральной сетчатки и RPE становился уже или даже острым (Fig. 2e). Затем, на 8-й день, эпителий нейральной сетчатки начинал расширяться как в апикально выпуклой структуре, формируя бокал за счет прогрессирующей инвагинации (phase 4).
    Система микрофиламент была использована в качестве ключевого внутреннего регулятора различных аспектов эпителиального морфогенеза и часто регулируемая с помощью Rho-ROCK системы27. Инвагинационный морфогенез (включая уплощение и образование шарниров) блокируется, когда культура обрабатывается ингибитором для ROCK, Y-27632 (ref. 28) (который, как известно, ослабляет активность миозина) в фазе 1 или 2 (Fig. 2f and data

    В фазе 4, инвагинирующий эпителий нейральной сетчатки существенно расширяется как в тангенциальном, так и вертикальном направлении, тогда как домен RPE (особенно в его дистальной части) расширяется исключительно тангенциально (Supplementary Fig. 2e-g). Обработка ингибитором митозов aphidicolin29 начиная с позней фазы 3 и далее эффективно блокирует процесс инвагинации во время фазы 4 (Fig. 2h, i and Supplementary Movie 3), а также экспансию ткани и пролиферацию клеток (Supplementary Fig. 2h-j), указывая, что расширение ткани играет существенную роль в фазе 4 морфогенеза.

    Stepwise acquisition of domain-specific properties


    Детальный 3D анализ показал, что в то время как в фазе 1 пузырек состоит из простого столбчатого эпителия, эпителиальные клетки RPE, нейральной сетчатки и домены шарниров в фазе 4 обладают отличающейся морфологией, напоминающей их форму in vivo26: столбчатые эпителиальные клетки, псевдо-стратифицированные клетки и апикально суженные клиновидные клетки, соотв. (Fig. 3a, Supplementary Fig. 2d, bottom, and Supplementary Movie 2, part d; клиновидные клетки не возникают в шарнирах в культуре, предварительно обработанной или Y-27632 или blebbistatin; data not shown).
    Как in vitro, так и in vivo, инвагинация нейральной сетчатки происходит за счет уникальной апикально выпуклой инвагинации в противоположность апикально вогнутой инвагинации, наблюдаемой при образовании нервной трубки у позвоночных и во время гаструляции у мух, где существенна активация ROCK-myosin27,28,30-34, принимая это во внимание, мы исследовали уровни фосфорилированной легкой цепи миозина 2 (pMLC2; MLC2 также наз. Myl2), это отражает локальную активацию actomyosin30, в разных доменах и в разных фазах. Проксимальный и дистальный эпителий в пузырьках фазы 1 обнаруживают сравнимые уровни pMLC2 (Fig. 3b and Supplementary Fig. 3a). Такое накопление pMLC2, по-видимому, зависит от Rho-ROCK системы, поскольку Y-27632 снижал уровни pMLC2 (data not shown; в согласии с этим внутреннее пространство пузырька в фазе 1 постепенно уменьшается, тогда как Y-27632 обращает это снижение и расширяет равномерно весь пузырек; Supplementary Fig. 3b). В противовес равномерному накоплению в фазе 1 pMLC2 его уровни в фазе 2-3 оказываются снижены в нейральной сетчатке, но остаются высокими в эпителии RPE и шарниров (Fig. 3c and Supplementary Fig. 3c). Уровни pMLC2 в нейральной сетчатке становятся особенно низкими в фазе 4 (Fig. 3d and Supplementary Fig. 3d). Пониженный уровень pMLC2 также наблюдается в нейральной сетчатке эмбрионов мыши (Supplementary Fig. 3e, f). В согласии с пониженным уровнем pMLC, механическая ригидность RPE ткани в фазе 4 глазного бокала существенно выше, чем таковая в нейральной сетчатке, которая была измерена с помощью силового воздействия с использованием atomic force microscope (AFM) консоли3536, тогда как подобное различие исчезало после воздействия ингибиторов ROCK или actomyosin (Fig. 3e and Supplementary Fig. 3g). Напротив, существенный уровень зависимой от актомиозина ригидности ткани наблюдался в дистальном и проксимальном эпителии во время фазы 1 (Supplementary Fig. 3h and not shown).
    Мы также наблюдали дифференциальные домен- и фазо-специфические механические свойства в ответ на устранение клеток. Если удалялись немногие клетки37 с помощью 3D-нацеленного мультифотонового лазерного пучка (Supplementary Fig. 3i-l), то пространство после удаления в фазе 4 в RPE и нейральной сетатке, но не в шарнирной области, вскоре исчезало в результате давления от соседних клеток внутри эпителия (Supplementary Movie 4, parts a-c). Обработка ингибитором митозов подавляла это поведение по устранению пробела (Supplementary Movie 4, part d), указывая на важную роль клеточной пролиферации в генерации толкающих сил. Напротив, в фазе 1-2, вызыванные устранением клеток пробелы независимо в дистальной или проксимальной части эпителия не закрываются после удаления клеток, а начинают увеличиваться,, по-видимому, за счет локального растягивающего натяжения (part e and not shown), как в шарнирной области во время фазы 4.
    Что касается экспрессии маркеров, экспрессия ChxlO начинается с фазы 2 в дистальной части эпителия сетчатки, тогда как проксимальная часть остается ChxlO-Pax6- и обнаруживает снижение экспрессии Rx (Fig. 3f-h; see in vivo expression in Supplementary Fig. 3m). Итак, эти находки демонстрируют, что самоформирующийся эпителий сетчатки постепенно приобретает количественно отличные морфологические, биохимические, механические и ген-экспрессирующие свойства домен-зависимым образом во время раннего морфогенеза глазного бокала.

    Self-patterning into neural retina and RPE domains


    Затем мы задались вопросом, судьбы нейральной сетчатки и RPE детерминированы необратимо, когда завершается эвагинация. Мы вырезали Rx+ пузырьки в фазе 1 с или без соседней нейроэктодермальной эпителиальной ткани (Rx-) из 7 дн. агрегатов ES клеток (Fig. 4a-k). Несколько дней позднее, the Rx+ пузырьки, вырезанные с небольшим количеством не ретинального нейроэктодермального эпителия, развивались в простраственно упорядоченный RPE и эпителий нейральной сетчтки и даже формировали структуру глазного бокала (Fig. 4a-c, j, k). Напротив, Rx+ эпителий, изолированный без не-ретинальной ткани оказался неспособен инвагинировать и преимущественно экспрессировал ChxlO на 10-й день (Fig. 4d-f; bracket), и лишь небольшое количество клеток было ChxlO Pax6+ (arrowheads).
    Каноническая передача сигналов Wnt участвует в спецификации и поддержании судьбы RPE38-41. Когда в фазе 1 изолированные пузырьки без нейроэктодермального эпителия совместно культивировали с агрегатами, экспрессирующих Wnt3a L клеток (Fig. 4g and Supplementary Fig. 4a, b), то как дифференцировка RPE, так и инвагинация нейральной сетчатки восстанавливались в значительной степени (Fig. 4h-k; Supplementary Movie 5, using a disc-confocal incubation microscope in Supplementary Fig. 2k), тогда как такого восстановлание не наблюдалось с контрольными L клетками (not shown). Сходное восстановление наблюдалось в культуре изолированных пузырьков, к которой добавлялся белок Wnt3a (Fig. 4j, k and Supplementary Fig. 4c, d). Соотв. обработка целых агрегатов ингибитором секреции Wnt, IWP2, мешала инвагинации, уменьшала RPE ткань и увеличивала процент ChxlO" ткани (Fig. 41, m and Supplementary Fig. 4e-h; эффекты IWP2 на дифференцировку были обратными добавлению Wnt3a, в то же время не обнаружено существенных эффектов на пролиферацию или апоптоз; Supplementary Fig. 4i, j). Напротив Wnt агонист BIO (6-bromoindirubin-3'oxime; GSK3-(3 inhibitor) строго способствует дифференцировке RPE и супрессирует генерацию нейральной сетчатки (Fig. 41, m and Supplementary Fig. 4k, 1).
    Итак, эти находки указывают на то, что дифференцировка RPE нуждается в тканевых взаимодействиях с участием диффундибельных факторов индукции42 от нейроэктодермального эпителия. Напротив, судьба нейральной сетчатки детерминируется автономно от др. тканей; это может быть частично результатом влияния Rx и Six3, которые ослабляют активацию пути Wnt40, и также результатом действия антагонистов Wnt таких как Dkkl (ref. 43), который экспрессируется строго в тканях сетчатки (Supplementary Fig. 4m-q). Известно, что даже в фазе 1 экспрессия Dkkl в пузырьке уже обнаруживает склонность к более высоким уровням экспрессии в дистальных частях (Supplementary Fig. 4r), это может частично объяснить, почему добавление растворимого Wnt3a белка в культуру экспланта может также пространственно восстанавливать паттерн RPE-нейральной сетчатки (Supplementary Fig. 4d).

    Self-directed stratification of neural retina tissue


    В нейральной сетчатки фазы 4 предшественники испытывают частые клеточные деления, связанные с интеркинетической ядерной миграцией (Fig. 5a, Supplementary Fig. 5a and Supplementary Movie 6, parts a, b), как видно in vivo44. Это заставило нас исследовать образование тканевой архитектцры в изолированном эпителии нейральной сетчатки в долговременной культуре. Когда в фазе 4 глазные бокалы вручную вырезались целиком по RPE домену от агрегатов, то порции RPE поворачивались на 180 градусов подобно листовой рессоре по шарниру и выворачивались навыворот (Fig. 5b, c, Supplementary Fig. 5a and Supplementary Movie 7; такая эверсия не наблюдалась ввыборках, показанных на Fig. 4g , по-видимому, потому, что концы их разреза спонтанно становились запечатанными после этого). В противоположность RPE, форма нейральной сетчатки не менялась существенно, демонстрируя пластичность ткани; фактически это механическое свойство оказалось пригодным для поддержания изолированного в фазе 4 эпителия нейральной сетчатки, чтобы далее поддерживать суспензионную культуру в среде для созревания сетчатки45 (Supplementary Fig. 5b).
    Отметим, что 10-14 дней спустя эти изолированные ткани спонтанно формировали крупные, непрерывные эпителиальные структуры с четкой стратификацией (Fig. 5d; typically 800-2,000 pm in diameter), напоминая раннюю постнатальную сетчатку, состоящую из множественых слоёв из разных клеточных компонентов (Supplementary Fig. 5c). Происходящая из ES клеток стратифицированная ткань сетчатки содержит все основные компоненты нейральной сетчатки (Fig. 5e-k), т.е., фоторецепторы (rhodopsin ', recoverin '; Fig. 5e, h, i and Supplementary Fig. 5d), ганглиолярные клетки (Brn3 ' Pax6+calretinin '; Fig. 5g, h, k and Supplementary Fig. 5e), биполярные клетки (Chxl0+Pax6).
    В качестве минорных различий ганглиолярные клетки в этой культуре стермились скорее в рассыпную, чем в сплошную выстилку как in vivo, возможно поэтому не возникало ригидной пограничной структуры, такой как та, что предоставляется внутренней лимитирующей мембраной in vivo. Кроме того, в отличие от палочковидных, колбочковидные фоторецепторы (экспрессирующие цветовые опсины) присутствовали в относительно низком проценте (<0.1%; Supplementary Fig. 51, m and data not shown).
    Профили экспрессии маркеров стадиоспецифической дифференцировки в компонентах нейральной сетчатки, суммированы на Fig. 5m, показывая, что временная последовательность в культуре ES клеток следует тковой in vivo. Анализ данных генераций20, выход из клеточного цикла ганглиолярных клеток (Brn3+), фоторецепторов (rhodopsin+) и биполярных клеток (Chxl0+Pax6-) достигает пика приблизительно на 10, 16 и 18 день, соотв., это согласуется с последовательностью их генерации in vivo13 (Fig. 5n-p and Supplementary Fig. 5n, o). В соответствии с этими наблюдениями, обработка Notch ингибитором DAPT (на 16-й день), который способствует осуществлению дифференцировки и ингибирует пролиферацию, увеличивает количество Crx' фоторецепторов на 18-й день, в то же время он заметно редуцирует количество Chxl (T cells (митотических предшественников нейральной сетчатки и постмитотических биполярных клеток) и Ptfla+ GABAergic предшественников (Fig. 5q-s and Supplementary Fig. 5p-s, and data not shown).
    Итак, эти находки демонстрируют, что архитектура ткани полностью стратифицированной нейральной сетчатки в такой культуре ES клеток самообразуется пространственно-временным образом, регулируемым способом, воспроизводящим развитие in vivo.

    DISCUSSION


    Само-управляемая организация сложного глазного бокала и морфологии нейральной сетчатки, продемонстрированная здесь, стала довольно неожиданной, т.к. культура из ES клеток стартовала в виде агрегатов без определенного паттерна из гомогенных плюрипотентных клеток и проддолжана находиться при униформных культуральных условиях. Т.о., эта система представляет пример возникновения коллективного клеточного поведения в виде неуравновешенного биологического процесса, осуществляемого в пространстве и времени. Инвагинация нейральной сетчатки может происходить даже в отсутствии сил от внешних структур, по крайней мере, в этом in vitro контексте. Хотя полное выяснение механики этой автономной инвагинации нуждается в дальнейших обширных исследованиях, данное исследования показывает, морфогенез включает множественные ступени, контролируемые зависимым от истории способом.
    После формирования шарнира, нейральная сетчатка фазы 3 стремится иметь легкий апикальный изгиб. Рабочей моделью для будущих исследований в соответствии с нашими находками по перемещени ткани и механическим свойствам во время фазы 4, заключается в том, что окруженная менее продуктивной RPE оболочкой (pMLC2-high) и в ограниченном пространстве флексибельная в фазе 4 нейральная сетчатка продвигается к дальнейшему изгибу (изгибается апикально) за счет своей тангенциальной экспансии. В самом деле, такой морфогенетический процесс может быть также воспроизведен с помощью компьютерного моделирования исходя из следующих трех правил, согласующихся с нашим наблюдением: (1) реляксация презумптивной нейральной сетчатки начинается в фазе 2; (2) апикальное сужение в эпителии шарнира в фазе 3; и (3) быстрый тангенциальный рост нейральной сетчатки и дистальной части ткани RPE в фазе 4. В этой модели используется локальный контроль апикальных, базальных и трансмуральных смещений (springs), нейральная сетчатка спонтанно заворачиватся внутрь оболочки RPE, это сопровождается уплощением и образованием шарнира, в принципе подтверждается возможность спонтанного морфогенеза бокала независимо от сил от внушних структур (Fig. 5t, Supplementary Fig. 6a, b and Supplementary Movie 8; see also Supplementary Fig. 6c-e for response to perturbations).
    Данное исследование выявило, что сложный морфогенез зачатка сетчатки, по крайней мере, в контексте in vitro, обладает 'latent intrinsic order', использующей динамическое самообразование паттерна и самообразование, управляемое последовательной комбинацией локальных правил и внутренних сил внутри эпителия. Ситуация in vivo определенно д. быть более сложной и внешние сигналы от внешних структур (напр., от поверхностной эктодермы, хрусталика и окологлазной мезенхимы)9'10,42,48'49 , также как и пространственные ограничения, по-видимому, работают вместе с этой прирожденной последовательностю событий, чтобы подкрепить надежность морфогенеза сетчатки.

    METHODS SUMMARY


    The SFEBq culture was performed as described previously20, and matrigel (final 2%) was added to the 1.5% KSR-containing differentiation medium on day 1. Multi-photon imaging and ablation were performed using 900-nm femtosecond laser pulses (80 MHz) from a MaiTai eHP (Spectra-Physics) using a X25 water-immersion objective lens (NA 1.05; Olympus).

    Full Methods and any associated references are available in the online version of the paper at www.nature.com/nature.
    Сайт создан в системе uCoz