Посещений:
СОН

Генетические Аспекты

Genetic analysis of sleep
Amanda Crocker and Amita Sehgal
doi: 10.1101/gad.1913110 Genes & Dev. 2010. 24: 1220-1235

Almost 20 years ago, the gene underlying fatal familial insomnia was discovered, and first suggested the concept that a single gene can regulate sleep. In the two decades since, there have been many advances in the field of behavioral genetics, but it is only in the past 10 years that the genetic analysis of sleep has emerged as an important discipline. Major findings include the discovery of a single gene underlying the sleep disorder narcolepsy, and identification of loci that make quantitative contributions to sleep characteristics. The sleep field has also expanded its focus from mammalian model organisms to Drosophila, zebrafish, and worms, which is allowing the application of novel genetic approaches. Researchers have undertaken large-scale screens to identify new genes that regulate sleep, and are also probing questions of sleep circuitry and sleep function on a molecular level. As genetic tools continue to be refined in each model organism, the genes that support a specific function in sleep will become more apparent. Thus, while our understanding of sleep still remains rudimentary, rapid progress is expected from these recently initiated studies.

Сон одна из величайших мистерий науки. Это фундаментальный феномен с неизвестной молекулярной функцией, несмотря на тот факт, что он захватывает генетически отличающихся эукариот от высшего порядка филетических групп, таких как млекопитающие до низших групп, таких как членистоногие (Tobler 2005). Внутри индивидуальных видов многие характеристики сна тонко регулируются. Сюда входят, но не ограничиваются, время начала сна, глубина сна и средняя продолжительность. Поскольку все эти организмы обнаруживают регуляцию одних и тех же связанных со сном процессов, то полагают, что существуют законсервированные генетические механизмы, лежащие в основе сна среди видов (Allada and Siegel 2008).
Понятие, что сон может регулироваться консервативными генетическими механизмами, не привело ещё к унифицированному его пониманию. Близко родственные процессы-генерация циркадных ритмов-сегодня объясняется на базе универсальной модели, в основном благодаря механистическим исследованиям, проделанным на филогенетически очень разных организмах. Исследования сна в основном описательны, согласуются с исследованиями повреждений, которые были идентифицированы в соотв. анатомических областях млекопитающих и с фармакологическими данными, которые связаны с целенаправленными эффектами разных нейрохим. соединений. Однако даже это не открывает специфических локусов/фокусов в такой же степени, как это известно, для регуляции циркадных ритмов, вообще-то из-за того, что они не существуют для сна. Напр., всё ещё не известна специфическая анатомическая область, которая может быть повреждена, чтобы полностью лишить сна. Сходным образом, если существует специфический нейротрансмиттер сна, то он всё ещё гипотетический. Т.о., сон, по-видимому, не контролируется одиночным локусом или специальными генами. Его лучше рассматривать как широкий системный феномен.
Гипотезы сна включают соматические теории (оздоровление тела и др. эндокринных функций), клеточные метаболические теории (удаление реактивных оксидативных видов и восполнение энергии), специфичные для головного мозга функции, такие как синаптическая пластичность (у взрослых это д. лежать в основе консолидации памяти), синаптическое снижение размаха (downscaling). Необходимо поподробнее ознакомиться с некоторыми из этих гипотез, т.к. они часто базируются на вредных эффектах лишения сна, что является как клеточным, так и организменным стрессом, обусловленным фактически тем, что оно превышает наше обычное время бодрствования. Принимая во внимание, что пути, способствующие бодрствованию, используются в др. биологических функциях, избыточная активность этих путей д. вызывать эффекты независимо от сна. Также область сна различается у тех, кто желает ассоциировать функцию сна со специфическими аспектами электрической активности головного мозга, измеряемой с помощью electroencephalogram (EEG) (described below), и у тех, кто желает понять. что происходит в головном мозге, когда он выключен независимо от EEG.
Генетики предоставили новый способ исследования регуляции и функции сна. Поскольку в последние 20 лет генетика прежде всего использовалась преимущественно для верификации повреждений и фармакологических исследований с помощью целенаправленных на гены подходов, она может теперь использовать зонды для более запутанных вопросов сна. Т.о., могут быть использованы генетический скрининг, индуцибельные и анатомически специфические генетические мутации, генетические альтерации в передаче сигналов синапсами и возбудимости, генетические повреждения клеток, микромассивы и др. генетические манипуляции для идентификации новых механизмов, лежащих в основе сна, а также для проверки специфический гипотез функции сна.


The definition of sleep


В наиболее широком смысле сон определяется как период неактивности. Этот период сопровождается увеличением порога возбуждения (arousal) ЦНС, часто при стереотипическом положении тела и если он нарушен, то сопровождается периодом отхождения от сна (Hendricks et al. 2000 Huber et al. 2004). Это определение применительно к организмам как генетически простым, таким как Caenorhabditis elegans, так и к более сложным организмам, таким как мыши и человек.
Чтобы понять сон, необходимо обратиться к двум разным аспектам. Это время сна и продолжительность/качество сна (Borbely 1982). Оба поддерживаются приблизительно одинаково изо дня в день. Время сна хорошо известно как функция циркадной системы головного мозга. Система циркадного ритма важна для управления многими аспектами поведения и физиологии с приблизительно 24-часовым периодом с помощью набора молекулярных осцилляторов. Как наше тело узнает, как долго мы должны спать, менее понятно. Исходя из отхождения от сна или компенсаторного сна, которые сопровождают лишение сна, считается важным процесс, с помощью которого контролируется продолжительность сна с помощью гомеостатической системы (Dauvilliers et al. 2005).
У млекопитающих сон идентифицируется эмпирически по физиологическим маркерам. У человека, как у обезьян, крыс и мышей, изменения в активности головного мозга во время сна и бодрствования может быть отслежено с помощью EEG, и были идентифицированы разные стадии этих поведенческих состояний с помощью характерных паттернов EEG (форм волн) (Table 1; Allada and Siegel 2008; Ambrosius et al. 2008).
Эти паттерны хорошо определимы у человека, у которого типичная сонная EEG состоит из одной из трех nonrapid eye movement (NREM) стадий и REM стадии (Table 1). Стадия 1N характеризуется переходом от быстрых осцилляций в пределах 8-13-Hz во время бодрствования к осцилляциям в пределах 4-7-Hz . Стадия 2N характеризуется сонными веретенами (sleep spindles) (быстрыми осцилляциями в пределах 12-14-Hz) на верхушках более медленных осцилляций. Стадия 3N является самой глубокой стадией сна и она представлена примерно на 20% медленными, в высокой амплитудой осцилляциями в пределах 0- 4-Hz, известных как delta волны; эти из самых глубоких точек этой стадии сна д. состоять из более 50% delta волн. (Dumermuth et al. 1983; Aeschbach and Borbely 1993). Глубина сна часто характеризуется термином "delta power," что отражает частоту и амплтуду продуцируемых дельта волн. Дельта величина является предположительно отражением (readout) гомеостатического управления (drive), так что чем выше дельта сила, тем сильнее давление сна у животного (Webb and Agnew 1971; Tobler and Borbely 1986). У др. млекопитающих стадии сна менее выражены и целом попадают в категории NREM, REM или полное бодрствование (Tobler and Borbely 1986).

Table 1

Terms commonly used to describe sleep


Genetic approaches to the study of sleep


Первые указания, что сон человека может регулироваться генетически, получены в исследованиях близнецов в 1930s (rev. Dauvilliers et al. 2005). Эти исследования показали, что монозиготные близнецы наиболее вероятно имеют сходные величины сна и время начала сна, чем дизиготные близнецы. После открытия EEG, было установлено, что монозиготные близнецы также обнаруживают сходство в спектре EEG. Несмотря на тот факт, что имеется значительная вариабельность в спектре EEG от индивида к индивиду у монозиготных близнецов. он высоко скоррелирован (Anokhin et al. 1992; Steinlein et al. 1992; van Beijsterveldt and Boomsma 1994; Ambrosius et al. 2008). Как быдет рассмотрено ниже, более недавние исследования оценили генетическую основу паттерна EEG и даже идентифицировали генетические локусы, лежащие в основе этого признака.
Мыши обнаруживают примерно 85% генетическое сходство с людьми и поэтому представляют собой прекрасную модель для генетического анализа сна (Church et al. 2009). Они также обладают характерными EEG признаками и периодами сна, которые регулируются с помощью тех же самых гомеостатических и циркадных механизмов, что и у людей (Allada and Siegel 2008). Однако имеются определенные недостатки в использовании мышиной модели: они имеют продолжительное время генерации (generation time). Они, скорее всего, обнаруживают компенсацию или избыточность (redundancy) генов, критических для жизнеспособности мыши, многие из которых могут быть важными для сна. Также вплоть до недавнего времени генетические инструменты были недоступны для изменения экспрессии генов во времени или в пространстве в головном мозге мышей (Rossant and McMahon 1999).
Более простые организмы, такие как C. elegans, Drosophila melanogaster и Danio rerio (zebrafish) также являются прекрасными моделями сна (Allada and Siegel 2008; Cirelli 2009). Они обладают преимуществом в том, что все они генетически пригодны и имеют относительно простые геномы (черви и мухи имеют очень короткое время генерации). Кроме того, все они обладают способностью генерировать как простое, так и сложное поведение (Sokolowski 2001). Низкая избыточность в геноме у этих организмов делает их более пригодными для идентификации генов, важных для сна. Исследования этих модельных организмов также дали зачатки разработки генетических инструментов, которые могут быть использованы для исследований сна, от технологии, которая позволяет точный временной и пространственный контроль генов с помощью реагентов, которые обходят необходимость в электрофизиологии.
Важно отметить. что генетика сна не ограничена этими организмами. Исследования семейных сцеплений и геномные исследования точно определяют местонахождение генов сна у людей (Winkelmann et al. 2007; Hallmayer et al. 2009). Кроме того, успехи в генетике сна получаются иногда от неожиданных систем. Напр., собаки, моделирующие нарколепсию привели к идентификации гена, лежащего в основе этого нарушения, а мутация циркадного ритма, tau, была обнаружена случайно у хомячка (Ralph and Menaker 1988; Lin et al. 1999).

Genetic analysis of sleep traits


Natural variations in sleep traits


Начиная с ранних работ, основное внимание уделялось EEGs при бодрствовании, более недавние исследования исследовали EEGs во время сна (Ambrosius et al. 2008; De Gennaro et al. 2008). De Gennaro et al. (2008) показали, что частоты в 8-16 Hz во время NREM сна обнаруживают высокую степень расследования, независимо от потребности или интенсивности сна. Несмотря на эти исследования очень мало работ по семейному сцеплению с характеристиками EEG при сне.
Исследования по крупномасштабному картированию генетических отличий в архитектуре сна между инбредными линиями мышей (QTL картирование) позволили исследователям выделить гены, которые лежат в основе едва уловимых различий между линями (O'Hara et al. 2007). Одно исследование было сфокусировано на theta осцилляциях, которые варьировали по частоте между инбредными линиями, но были очень незначительны внутри линий. Tafti et al. (2003) выискивали специфические различия между Balb/cByJ мышами, которые имеют "медленные" theta частоты на EEG и c57Bl/6J мышами, которые имеют "быстрые" theta ритмы. У мышей, происходящие из гиппокампа theta ритмы в пределах 6-10-Hz обнаруживаются во время REM сна и исследовательской активности, включая бег в колесе (wheel running). Это отличается от кортикальных theta ритмов, наблюдаемых у людей на стадии N1 сна, которые находятся в пределах4-7-Hz. Tafti et al. (2003) оказались способны сузить область интереса до одиночного гена на хромосоме 5, известного как Acads (short-chain acyl-coenzyme A dehydrogenase). Они установили, что Balb/cByJ мыши имеют дефицит в Acads, который и лежит в основе замедления theta ритма.
Др. успешное исследование QTL идентифицировало ген на хромосоме 14, Rarb, который вносит вклад в 1-4-Hz delta частоту у мышей (Maret et al. 2005). Применив подход reverse генетики, чтобы специфически найти Rarb ген, Maret et al. (2005) показали, что передача сигналов ретиноевой кислоты (the pathway Rarb functions in) важна для модуляции синхронности коры во время NREM сна.
Ниже мы коснемся некоторых ионных каналов, которые будучи мутантными меняют паттерн EEG. Поскольку каналы вероятно объясняют более непосредственно осцилляторные взрывы EEG во время сна, они могут регулироваться с помощью некоторых из генов, упомянутых выше. Однако поскольку эти исследования важны для информации, которую они предоставляют относительно генетического контроля EEG спящих, они не выявляют значения этих волн. К тому же они не не дают ассоциаций EEG паттернов с функцией сна.

Circadian influences on sleep


Как упоминалось выше циркадная регуляция сна значительно лучше определена, чем гомеостатическая регуляция. Кроме того, молекулярная основа циркадного контроля довольно хорошо известна, как результат перекрёстно-дисциплинарных подходов, которые включают организмы столь простые , как сине-зеленые водоросли и Neurospora (Sehgal 2004). Молекулярные механизмы циркадных часов в самом деле законсервированы от сине-зеленых водорослей до человека. От дрозофилы до человека молекулы в основном консервативны и даже участвуют в нарушениях циркадного ритма у людей. Механизм молекулярных часов млекопитающих, описанный ниже, не отражает современного состояния знания в этой области; это может быть приписано тому факту, что он описан во многих др. обзорах , а сфокусироваться необходимо на описании гомеостатической регуляции сна.
Циркадная система у млекопитающих и беспозвоночных связана с молекулярными петлями обратной связи внутри клеток, которые могут поддерживать ~24-ч ритм (Siepka et al. 2007). У всех этих организмов стержневые компоненты часов делятся на позитивные и негативные регуляторы. У млекопитающих BMAL1 и NPAS2/CLOCK являются позитивными регуляторами, которые управляют транскрипцией Per (Period) и Cry (Cryptochrome), которые образуют обратную связь и ингибируют транскрипцию BMAL1 и CLOCK/NPAS2, оказываясь тем самым негативными регуляторами. Вследствие деградации негативных регуляторов новый цикл начинается. Мыши, мутантные по любому из этих генов или комбинации из этих генов, обычно обнаруживают аберрантные покой:активность (rest:activity) паттерны, хотя из-за избыточности фенотипы часто слабее, чем предсказывалось.
Как и ожидалось циркадная система важна для детерминации выбора времени сна. Это хорошо демонстрируется при нарушениях, известных как familial advanced sleep-phase syndrome (FASPS), который ведет к раннему времени засыпания и пробуждения. Генетические исследования идентифицировали мутации в гене Casein kinase 1δ в одной семье, страдающей от FASPS и мутацию в гене period, которая затрагивает взаимодействие белка period с Casein kinase 1, в др. семье (Toh et al. 2001; Xu et al. 2005). Удивительно, оба эти гена впервые были идентифицированы у Drosophila как часть циркадных часов, тем самым свидетельствуя о консервации молекулярных механизмов (Konopka and Benzer 1971; Kloss et al. 1998). Интересно, что мутация Tau у хомячка, которая вызывает очень короткий период, является аллелем Casein Kinase 1ε (Lowrey et al. 2000).
FASPS мутации не меняют общей продолжительности сна, но изменяют (advance) время начала сна. Тот же самый фенотип возникает, если мутирован или Per2 или Casein kinase 1δ у мышей, но у мух эквивалентная мутация в Casein kinase 1δ вызывает фазу задержки (Xu et al. 2005). Т.о., эта специфическая аминокислота также важна у мух, хотя регуляция может быть несколько иной.
Естественно возникшие полиморфизмы в генах циркадных часов не вызывают крайних фенотипов, подобных FASPS, но могут оказывать эффекты временные рамки сна. В самом деле, некоторые исследования предприняли попытку скоррелировать такие полиморфизмы с предпочтениями к времени раннего пробуждения ( "morning" тип или "жаворонки") или к позднему засыпанию ("evening" тип или "совы") (Archer et al. 2003; Carpen et al. 2005, 2006; Viola et al. 2007). Полиморфизм по аллелю C из T2434C в Per1 ассоциирует с morningness (жаворонками) и нарушениями временных рамок сна (Carpen et al. 2006).
Очевидно, что циркадные гены затрагивают временные рамки сна. По-прежнему остается спорным, играют ли они роль в гомеостатической регуляции сна; т.e., в детерминации продолжительности сна. Имеются некоторые доказательства этому. Мыши с мутациями в некоторых циркадных генах, таких как CLOCK, BMAL и Cry, также как и др. циркадных регуляторах, обнаруживают изменения в продолжительности сна. Clock мутантные мыши спят в среднем на 2 ч меньше, чем их собратья дикого типа (Naylor et al. 2000). BMAL нокаутные мыши и CRY1/CRY2 двойные нокаутные мыши обнаруживают увеличение общего времени сна (Wisor et al. 2002b; Laposky et al. 2005). Нокаут Prokineticin 2, который возможно является выходным сигналом из SCN (suprachiasmatic nucleus, центра циркадного ритма у млекопитающих), вызывает снижение общего времени сна и ослабляет восстановление ото сна после лишения сна (Hu et al. 2007). Сходным образом, мутации в некоторых циркадных генах у плодовых мушек обнаруживают нарушения homeostat сна (Shaw et al. 2002; Hendricks et al. 2003; Chung et al. 2009; Donlea et al. 2009).
Недавнее исследование выявило ещё один циркадный ген, участвующий в регуляции продолжительности сна. Dec2, basic helix-loop-helix (bHLH) белок, как полагают, действует в часах как репрессор Clock/Bmal1 (Honma et al. 2002). Недавнее исследование установило точковую мутацию гена Dec2 в семье мало спящих (He et al. 2009). Эти люди впадали в сон в обычное время в отличие от людей с advanced-phase syndrome, рассмотренным выше, но пробуждались рано, так что из средняя продолжительность сна составляла около 6 ч (He et al. 2009). У мышей нокаут Dec2 не вызывал снижения продолжительности сна, как это делала точковая мутация у людей. Но когда специфическая точковая мутация была внесена мышам, то у них снижалась продолжительность сна без нарушения циркадного периода, указывая тем самым, что она оказывает доминантный эффект. Интересно, что роль Dec2 законсервирована у мух (Lim et al. 2007). Мухи. понуждаемые к экспрессии мышиного гена Dec2, несущего мутацию P385R обнаруживали фенотип сна, сходный с тем, что наблюдается у млекопитающих (He et al. 2009).
Даже учитывая эти эффекты циркадных генов на продолжительность сна, остается неясным, влияют ли циркадные часы на гомеостаз сна. Напр., эффекты очень малы. Затем, они не описаны для всех генов часов. Наконец, для генов, которые были вовлечены, фенотипы сна могли отражать плейотропные или не циркадные эффекты этих генов.

The genetics of sleep neurochemistry


Первая книга по анатомии сна была опубликована в 1840s (Edelson 1992). С тех пор наше понимание нейрохимии сна стало базироваться на физиологических и фармакологических исследованиях. Но последние 10-20 лет генетика стала основным инструментом исследования нейрохимии сна, а также схем (circuitry), ассоциированных с ней. В самом деле большинство более ранних работ по физиологии и фармакологии у млекопитающих сегодня подтверждены с помощью генетических подходов и суммированы во многих обзорах и анатомических картах (Saper et al. 2005; Andretic et al. 2008a). Недавно прошла волна генетических исследований, идентифицирующих области, регулирующие сон и нейрохим. соединения в головном мозге мух (see Fig. 1).

Figure 1.

Brain regions in the fly important for sleep-wake regulation. Many of the major neurotransmitter systems within the fly have been analyzed for their role in sleep. In the biogenic amine category, only octopamine has been localized to a specific cell group relevant for its role in sleep-wake behavior (purple). Dopamine and serotonin play a role in the regulation of sleep, but the specific subgroups of cells have not been mapped, and thus the major cell groups that produce these transmitters are shown in this figure (black and yellow). PDF-producing large ventral lateral neurons (LNv) are important for promoting arousal in response to light and are shown in blue. Despite not knowing where the neurotransmitter signals originate, areas that receive these signals have been identified (PI neurons or mushroom body). Manipulation of intracellular signaling pathways has also implicated these areas (PI neurons and mushroom body).

Нейрохимический анализ сна связан с характеристикой и манипуляциями с основными системами нейротрансмиттеров, а также их рецепторами. Генетические подходы создали и/или охарактеризовали целенаправленные нокауты молекул кандидатов и идентифицировали новые роли или подтвердили старые роли многих из них для сна. Список нейротрансмиттеров - также как и др. генов-которые влияют на сон представлен в Table 2.

Table 2

Genes implicated in homeostatic regulation of sleep through genetic studies across species

Hypocretin/orexin


Открытие гена orexin, также известного как hypocretin, один из наиболее важных успехов в исследовании сна за последние 20 лет. Его роль в нарколепсии была открыта независимо в двух лаб. : в одном исследовании нарколепсии у собак и в др. пищевого поведения. Внимание группы Dr. Mignot's из Stanford University (Lin et al. 1999) было сосредоточено на клонировании гена narcolepsy. Используя разведение собак, страдающих нарколепсией, они оказались способны картировать имеющую отношение к делу мутацию в гене, кодирующем hypocretin рецептор (hcrtrt2). Группа Dr. Yanagisawa's из University of Texas Southwestern (Chemelli et al. 1999), со своей стороны, идентифицировала лиганды для orphan G-protein-coupled рецепторов, и изучая фенотипы нокаутных мышей, лишенных этих лигандов, было установлено, что orexin вызывает нарколептическое поведение. Стало ясно, что orexin играет критическую роль в циклах стабильного сна и пробуждения, путем воздействия как на способствующие пробуждению. так и способствующие засыпанию области головного мозга (Mochizuki et al. 2004; Saper et al. 2005). Его основной ролью является действие в качестве сигнала, способствующего пробуждению; в его отсутствие животные имеют проблемы с поддержанием бодрствования и быстро впадают в REM сон. Люди с нарколепсией обычно лишены нейронов, продуцирующих orexin, причиной этого может быть измененная иммунная функция (Hallmayer et al. 2009).
Orexin был также изучен у рыбок данио, но его роль здесь более спорна в связи с противоречивыми результатами, описывающими бессоница-подобные фенотипы моделей избыточной экспрессии и нокаута (Prober et al. 2006; Yokogawa et al. 2007). Имеется также противоречия относительно паттерна проекций orexin нейронами и локализации рецепторов orexin рыб (Kaslin et al. 2004; Yokogawa et al. 2007). Дальнейшие исследования у рыбок данио необходимы для выяснения роли orexin.
Мухи не имеют orexin, но предполагается, что pigment-dispersing factor (PDF), который высвобождается центральными clock нейронами, является у мух эквивалентом orexin. Некоторые из этих нейронов (крупные клетки) играют важную роль в поддержке бодрствования у мух ранним утром и это осуществляется посредством PDF (Fig. 1; Parisky et al. 2008; Shang et al. 2008; Sheeba et al. 2008a; Donlea et al. 2009). Предполагается, что PDF действует также как orexin у млекопитающих-как стабилизатор сна и пробуждения. Мухи, которые лишены передачи сигналов PDF или разрушением PDF гена, устранением PDF нейронов или отсутствием PDF рецептора, обнаруживают дефекты в своей способности отвечать на "lights on" переход и поэтому обладают пониженными уровнями активности в начале каждого дня (Shang et al. 2008; Chung et al. 2009). Они также обнаруживают увеличение общей продолжительности сна с усиленными переходами от бодрствования ко сну. Некоторое из таких действий, по-видимому, поддерживается посредством GABAergic вводных импульсов на PDF нейроны (Parisky et al. 2008; Chung et al. 2009). Кроме того, мухи с гипервозбудимыми PDF нейронами обнаруживают более низкие уровни сна (Shang et al. 2008; Sheeba et al. 2008a,b). Т.о., эффект PDF на уровни и консолидацию сна и сходен с таковым orexin у млекопитающих.

Acetylcholine


Генетический анализ acetycholine затруднителен у большинства организмов из-за множества биологически важных функций этого нейротрансмиттера. Кроме того, имеется очень большое количество nicotinic и muscarinic ацетилхолиновых рецепторов и субтипов рецепторов. Т.о., роль ацетилхолина для сна, кстати, лучше всего изучена с использованием фармакологических подходов, это указывает, что ацетилхолин является частью системы arousal (пробуждения), критической для EEG бодрствования и REM сна (Saper et al. 2005). Для немногих мутантов никотиновых рецепторов сделан анализ сна, были описаны лишь минорные изменения архитектуры сна (Lena et al. 2004; Fonck et al. 2005). С др. стороны, мутации в мускариновых ацетилхолиновых рецепторах M3 приводили к снижению REM сна (Goutagny et al. 2005). Целенаправленное генетическое нарушение субтипов ацетилхолиновых рецепторов внутри небольших популяций нейронов, с помощью RNAi технологии или генетически преобразованных вирусов, может оказаться информативным. Возможно также, что ацетилхолин в действительности не регулирует сон, а стадии сна регулируют ацетилхолин, как было предположено Gais and Born (2004).

The biogenic amines


Роль norepinephrine, dopamine, serotonin и histamine для сна была исследована исчерпывающе (Saper et al. 2005; Dzirasa et al. 2006; Monti and Monti 2007; Berridge 2008; Monti et al. 2008; Cirelli 2009). По этой причине мы ограничим наше обсуждение этих нейротрансмиттеров. Короче, целенаправленные генетические разрушения биогенных аминов-в частности, norepinephrine, dopamine и histamine-подтвердили способствующее пробуждению действие этих нейротрансмиттеров (Wisor et al. 2001; Vallone et al. 2002; Hunsley and Palmiter 2003; Ouyang et al. 2004; Popa et al. 2005; Waddington et al. 2005; Hunsley et al. 2006; Monti and Monti 2007; Qu et al. 2008). Serotonin, с др. стороны, имеет более ложную историю, т.к. он может оказывать разные эффектына REM в противовес NREM сну. Из генетических и фармакологических исследований становится ясно, что он ингибирует REM сон (Boutrel et al. 1999, 2002), но он может действительно способствовать NREM сну (Jouvet 1968).
Одна область, в которой генетические исследования предоставили новую информацию это роль гистамина в нарколепсии. Мыши, несущие мутацию в histamine decarboxylase (HDC), обнаруживают измененные уровни сна- hypersomnolence-и неспособны поддерживать состояние бодрствования во время обычного активного внимания, такое как световые переходы и изменения в клетке (cage changes) (Parmentier et al. 2002). Этот фенотип сходен с фенотипом нарколепсии и фактически роль гистамина и была исследована при этой болезни. Как нокаутные по orexin мыши, так и HDC нокаутные мыши обнаруживают фрагментированный сон и повышение REM, но HDC нокаутные мыши обнаруживают и повышение REM во время светлой фазы, когда мыши обычно спят (Anaclet et al. 2009), тогда как orexin мутанты обладают REM в часы бодрствования. В подтверждение роли гистамина в нарколепсии, пациенты с нарколепсией имеют пониженные уровни гистамина в своей спинномозговой жидкости (Nishino et al. 2009). Эти данные подчеркивают большую сложность аспектов регуляции сна-бодрствования.
Многие средовые сигналы и вводимые данные могут способствовать бодрствованию и сходным образом имеется множество систем нейротрансмиттеров, важных для реакции на каждый такой сигнал. Мыши имеют периоды бодрствования после внесения в новые условия среды, такие как новая клетка или новое освещение, а также увеличение пробуждаемости во время и вследствие двигательных задач. Гистамин может играть критическую роль в EEG спектре сна во время дня, когда мыши спят, а также при пробуждении, вызываемом новыми условиями (Anaclet et al. 2009). Orexin, с др. стороны, связан с бодрствованием, наблюдаемым во время ночи (период активности мышей) и необходим для поддержания тонуса ЦНС (arousal) во время и после локомоторных задач (Anaclet et al. 2009).
К сожалению как фармакологические, так и генетические исследования не лишены потенциальных недостатков. Напр., фармакологические исследования, базирующиеся на инъекциях, которые не могут быть специфически нацеленными. Кроме того, агонисты или антагонисты могут часто иметь побочные эффекты. С др. стороны, генетические делеции, особенно те, которые возникают во время развития, часто компенсируются у животных. Также поскольку молекулы могут обладать разными функциями в разных регионах, то анализ глобальных нокаутов обычно не дает четких результатов. По этой причине фенотипы сна генетических нокаутов часто усложнены и иногда противоречивы (Boutrel et al. 1999, 2002; Frank et al. 2002; Wisor et al. 2003; Hedlund et al. 2005; Waddington et al. 2005; Alexandre et al. 2006; Monti and Monti 2007). Чтобы выяснить роль каждого рецептора для сна, необходимо получение индуцибельных и анатомически специфичных нокаутов. Более того, чтобы контролировать избыточность, необходимо получение животных, лишенных множественных рецепторов.
Интересно, что практически все из этих нейротрансмиттеров-напр., dopamine, serotonin и octopamine (аналог norepinephrine у беспозвоночных)-регулируют сон и у др. модельных организмов, таких как мухи (Fig. 1; Kume et al. 2005; Chang et al. 2006; Yuan et al. 2006; Andretic et al. 2008b; Crocker and Sehgal 2008; MN Wu et al. 2008; Lebestky et al. 2009; Crocker et al. 2010). Поскольку работы с dopamine и octopamine подтвердили, что они представляют собой способствующие пробуждению (wake-promoting) сигналы так, как они действуют у млекопитающих, то serotonin у мух представляет собой способствующий засыпанию (sleep-promoting) сигнал (Yuan et al. 2006). В целом анализ у мух проще, поскольку до сих пор у них известно только одно состояние сна, существует меньше рецепторов для каждого нейротрансмиттера и имеется также меньше компенсации и избыточности. Возможно картировать сон-регулирующие эффекты молекул для специфических наборов нейронов с помощью беспристрастных генетических подходов. Это предоставляет не только анатомическую информацию, но и также позволяет делать видимыми фенотипы, продуцируемые в результате манипуляций, характерных для данных клеток. Используя такой подход, мы недавно показали, что только субнабор octopamine-продуцирующих клеток ответственен за сигнал, способствующий пробуждению (Crocker et al. 2010).
Хотя способствующие пробуждению (wake-promoting) нейротрансмиттеры безусловно важны для детерминации продолжительности сна, существуют значительно более интересные молекулы, способствующие сну, т.к. они могут напрямую участвовать в гомеостате сна. По меньшей мере, они необходимы для осуществления управления сном.

GABA


GABA является основным способствующим сну нейротрансмиттером, который, когда высвобождается из ventral preoptic area (VLPO) у млекопитающих, то ингибирует области, способствующие бодрствованию (Gong et al. 2004). Кроме того, высвобождение GABA из nucleus reticularis талямуса и его действие на др. ядра талямуса, способствует переходу от EEG бодрстования к EEG сна (Cope et al. 2005). В то время как фармакологические исследования показали участие GABA-A рецептора в генерации сна, генетические мутанты этого пути обнаруживали минимальные фенотипы. Мыши, несущие точковую мутацию в GABA-A рецепторах a1-a3, не обнаруживали изменений сна (Tobler et al. 2001; Kopp et al. 2003, 2004). Нокаутные по GABA-A рецепторной субъединице a3 мыши имеют нормальную продолжительность сна, но имеют пониженную spindle активность (в пределах 10-15-Hz во время NREM-REM переходов) (Winsky-Sommerer et al. 2008). Нокаут GABA-A рецепторной d субъединицы был исследован только после воздействия лекарства и характеризовался нормальными EEG паттернами (Winsky-Sommerer et al. 2007). Роль GABA-A рецепторной b3 субъединицы противоречива, из-за конфликтующих результатов в отношении её эффекта на сон и delta power (Laposky et al. 2001; Wisor et al. 2002a). Избыточность в сигнальном GABA пути, скорее всего, и объясняет эти сомнительные фенотипы.
Итак, генетический анализ нейротрансмиттеров, которые широко распространены и необходимы для жизни, такие как GABA и glutamate, очень труден для осуществления у млекопитающих. Однако Drosophila, C. elegans, и рыбки данио в качестве моделей используются для выяснения, как они участвуют в сне и лежащих в его основе circuitry. Напр., GABA основной способствующий сну сигнал у мух. Недавнее исследование показало, что способствующие пробуждению крупные центральные clock клетки, упомянутые выше, являются первичными реципиентами GABA сигнала, относящегося ко сну (Agosto et al. 2008; Parisky et al. 2008; Chung et al. 2009). Это создает систему, сходную с той, что наблюдается у млекопитающих, у которых способствующие сну нейроны становятся активными и выключают способствующие бодрствованию центры головного мозга.

Somnogens


Многие ранние исследования сна показали, что спинномозговая жидкость от животных, которым не позволяют спать, может индуцировать сон у отдохнувших животных (Legendre and Peiron 1913). После этих ранних экспериментов была открыта охота на специфический циркулирующий somnogen, который приказывает нашему телу отправляться спать. Многие нашли, что идея, что это adenosine, очень интригующая. Размышления привели к тому, что одни используют больше энергии во время дня, так что всё больше и больше АТФ тела превращается в adenosine, передача сигналов необходимости сна, который затем восстановит уровни энергии (Benington and Heller 1995).
Данные о роли adenosine усложнены. Мыши, несущие мутации или в A2A или в A1 adenosine рецепторе не обнаруживают выраженных изменений сна (Stenberg et al. 2003; Urade et al. 2003; Huang et al. 2005; Bjorness et al. 2009). Это стало проблематичным для этой области, поскольку коффеин, как полагают, способствует бодрствованию, блокируя A2A рецептор (Huang et al. 2005). Кстати, наилучшим доказательством эффекта способствующему сну аденозина получены в фармакологических исследованиях. Однако мыши, экспрессирующие доминантно-негативный белок SNARE (блокирует высвобождение нейроактивных молекул) в астроцитах, как было установлено, имеют пониженные осцилляции кортикальных медленных волн, характерных для NREM,и также снижают давление сна после периода бессоницы (Fellin et al. 2009; Halassa et al. 2009). Это снижение сна, как полагают, обусловлено снижением высвобождения АТФ астроцитами и таем самым ослаблением наращивания внеклеточного аденозина. Идея, что обычно аденозин должен действовать посредством A1 рецептора, чтобы супрессировать синаптическую трансмиссию и способствовать активности медленных волн, подтверждается (Fellin et al. 2009). Эти исследования не смогли картировать место действия аденозина, но они предоставили базу для дальнейших исследований функции аденозина для сна.
Действие кофеина также изучалось на плодовых мушках, где он действует посредством цАМФ пути скорее, чем рецептора аденозина, чтобы способствовать бодрствованию. Кроме того, используя цАМФ репортер, экспрессирующийся во время нейрональных тканях у мух, Wu et al. (2009) установили, что эффект кофеина довольно глобальный и не ограничен специфической областью. Т.о., в то время как фармакологическая обработка мух агонистом аденозина, как было установлено, способствует сну (Hendricks et al. 2000), пока нет генетических данных, подтверждающих роль аденозина для сна у мух.
Интересно, что цАМФ phosphodiesterase (PDE) является известной мишенью кофеина, но была исключена в качестве возможного механизма для объяснения эффектов кофеина на сон у млекопитающих, поскольку очень низкое сродство кофеина к PDE. Однако в свете сообщения, показавшего, что эффекты кофеина на иммунную функцию у млекопитающих обеспечиваются с помощью ингибирования PDE, вместе с недавними данными по мухам, это стоит повторного исследования роли PDE (Horrigan et al. 2006; Wu et al. 2009). Это особенно важно, учитывая, что нокауты аденозинового рецептора оказывают малое влияние на фенотип сна, а передача сигналов цАМФ безусловно участвует в регуляции сна млекопитающих (see below). Необходимы эксперименты на мухах с использованием хронического воздействия кофеина, поскольку исследования на млекопитающих подчеркивают его актуальность. Могут существовать различия в механизмах с использованием этих разных условий.

Identification of genes required for sleep homeostasis


Остается большой вопрос: почему мы спим? растет понимание того, что функция сна может быть понята благодаря молекулярному анализу. Поскольку известны немногие регулирующие сон молекулы, то необходимы исследования по идентификации новых генов, необходимых для сна. Эти исследования включают forward генетический скрининг, а также генетические манипуляции с генами кандидатами, путем наблюдения за изменениями в продолжительности сна, как отражение гомеостаза сна. В некоторых случаях гены кандидаты базируются на предположении об их функции для сна, так что необходима оценка как потеря и избыточность специфической функции влияет на продолжительность сна (see also Table 3).

Table 3.

Theories for sleep function

Genes based on somatic theories of sleep function


Sleep and the immune response


Необходим ли сон для нормальных функций тела, таких как иммунная реакция и сбалансированная метаболическая активность (Van Cauter et al. 1997)? Идея, что иммунные модуляторы, подобные цитокинам, способствуют сну имеет анекдотическое подтверждение, т.к. осуществление иммунной реакции телом обычно приводит к усталости и сонливости. Исследователи сфокусировались в основном на двух цитокинах, interleukin-1B (IL-1B) и tumor necrosis factor-α (TNF-α)-как молекулах, способствующих сну. Мыши, лишенные IL-1B обнаруживают уменьшение NREM сна во время активного периода, тогда как мыши. лишенные TNF-α обнаруживают уменьшение NREM во время своего периода сна sleep time (Fang et al. 1998; Krueger et al. 1998). Кроме того, двойные нокауты, лишенные как IL-1B, так и TNF-α, обнаруживают более высокие величины медленных волн delta power после лишения их сна (Baracchi and Opp 2008). Из этих данных можно заключить, что существует причинная взаимосвязь между иммунной системой и управлением сном. Мутантные животные спокойно спят, а уменьшение NREM может отражать перекрывание между схемами иммунитета и сна.
Исследуются профили экспрессии, чтобы идентифицировать гены, изменение экспрессии которых меняет состояние сна в пути иммунной реакции (Cirelli et al. 2005b; Williams et al. 2007). У Drosophila, NFκB (Relish) и др. гены иммунного ответа были идентифицированы при таком скрининге и они активированы во время бодрствования и продолжительной бессоницы. Кроме того, мухи с пониженными уровнями Relish обнаруживают укорочение сна в ночное время (Williams et al. 2007). В кортексе крыс экспрессия генов пути иммунной реакции также активируется во время бодрствования, как показывают исследования микромассивов. Сюда входят, COX-2 и I-κBα (Cirelli et al. 2005b). Однако хотя исследования микромассивов подтверждают генетические мутантные данные, но они также мало говорят о причинах. Они тем не менее пригодны для идентификации ассоциаций между профилями генной экспрессии и поведенческими состояниями.

Sleep and metabolism


Давно существуют теории, что сон важен для метаболизма (Benington and Heller 1995). Это подтверждается потенциальной ролью аденозина и сообщениями, показывающими ассоциации между уровнями гликогена и сном. Кроме того, существует, по-видимому, анатомическое перекрывание в регуляции сна и метаболизма. Напр., гипоталямус млекопитающих важен для контроля структуры обоих процессов. Недавнее исследование мух также показало, что их главный гормональный и метаболический центр является важным местом регуляции сна (Fig. 1; Foltenyi et al. 2007; Crocker et al. 2010).
Epidermal growth factor receptor (EGFR), рецептор важный для пролиферации и роста клеток в разных сигнальных путях, участвует в регуляции сна Drosophila и C. elegans (Foltenyi et al. 2007; Van Buskirk and Sternberg 2007). Foltenyi et al. (2007) нашли, что усиление пути передачи сигналов EGFR ведет к увеличению продолжительности сна. Передача сигналов увеличивалась посредством мутаций избыточности функции EGFR лигандов в областях головного мозга мух, гомологичных гипоталямусу, известному как pars intercerbralis (PI) (Fig. 1), и это коррелировало с изменениями в нижестоящей передаче сигналов ERK. Наша собственная недавняя работа показала, что способствующие бодрствованию эффекты octopamine обеспечиваются с помощью инсулин-продуцирующих клеток в головном мозге мух, которые также располагаются в PI (Crocker et al. 2010).
Путь EGFR также участвует в сне C. elegans. Модель сна C. elegans сфокусирована на онтогенетически регулируемом состоянии неподвижности, наз. летаргией, которое появляется в связи с личиночными линьками. Интересно, что летаргия регулируется у червя гомологом циркадного гена per и ассоциирует в синаптогенезом (предполагаемая функция сна), подтверждая, что она представляет собой примордиальное сон-подобное состояние (Van Buskirk and Sternberg 2007; Raizen et al. 2008). Избыточная экспрессия lin-3 (лиганда для EGFR) вызывает летаргия-подобное поведение у червей (Van Buskirk and Sternberg 2007). Рецептор Let-23 (EGFR) обнаруживается только в горстке нейронов, среди которых ALA нейроны ответственны за эффект lin-3 на летаргию (Van Buskirk and Sternberg 2007). Эти нейроны являются нейроэндокринными по своей природе, сходны с нейронами, посредством которых EGF влияет на сон мух. Т.о., у мышей, мух и червей метаболические и эндокринные функции, по-видимому, связаны со сном. Существует ли подобное анатомическое или функциональное перекрывание всё ещё нуждается в доказательствах.
Многие мутантные мыши с измененной метаболической функцией также обнаруживают изменения сна. Напр., мышиные нокауты по гену ghrelin обнаруживают легкое увеличение продолжительности сна (Laposky et al. 2008). Соотв., leptin-дефицитные мыши обнаруживают укорочение NREM сна и повышенную фрагментацию сна (Szentirmai et al. 2007). Мыши, которые не продуцируют growth hormone-releasing hormone (GHRH) и его рецептора обнаруживают достоверно меньший NREM сон, тогда как мыши с избыточной экспрессией гормона роста спят больше (Obal et al. 2001, 2003). К сожалению, эти исследования не решают фундаментального вопроса, может ли повышенный голод у этих животных преодолевать сигналы сна.
Сравнительно недавно было установлено участие генов, важных для осуществления клеточных стрессов, в регуляции сна. Посредством как профилей дифференциальной экспрессии, так и целенаправленных генных подходов, ген Bip был определен как фактор, способствующий сну. Bip важен для реакции на неупакованные белки в endoplasmic reticulum (ER), и активируется после периода лишения сна мышей (Cirelli et al. 2005b). Кроме того, мухи с измененными уровнями Bip обнаруживают изменения в их гомеостатической реакции на лишение сна (Naidoo et al. 2007).

Genes important for synaptic modulation


Одной из современных гипотез, почему мы спим является то, что сон позволяет или даже способствует снижению размаха синапсов (synaptic downscaling) (Tononi and Cirelli 2006). Эта гипотеза базируется на предположении, что во время бодрствования взаимодействия животных с внешним окружением ведет к усилению некоторых синапсов, тогда как др. остаются теми же самыми. Постулируется, что снижение размаха синапсов во время сна способствует эффективности в терминах энергии и пространства, поскольку поддерживает относительное соотношение силы синапсов. Эта гипотеза подтверждена в последние годы разными исследованиями экспрессии генов, изменение экспрессии которых сопровождается изменениями состояния сна и бодрствования. Многие немедленные ранние гены и гены, которые регулируют силу синапсов, были идентифицированы в этих исследованиях. Сюда входят NARP и Homer1a в бодрствующей коре крыс (Cirelli et al. 2005b). Кроме того, нокауты c-Fos (др. непосредственно раннего гена, маркирующего нервную активность) и Gria3 (AMPA рецептора GluR3 субъединица) у мышей обнаруживают альтерации сна (Shiromani et al. 2000; Steenland et al. 2008). c-Fos-нулевые животные обнаруживают большую продолжительность бодрствования и снижение медленных волн сна, а Gria3 животные обнаруживают затухание силы EEG во время бодрствования и NREM сна, но не сказываются на общей продолжительности сна (Shiromani et al. 2000; Steenland et al. 2008). Ген Homer1a был также идентифицирован при QTL анализе как наиболее вероятный кандидат на роль гена, лежащего в основе гомеостаза сна и величины delta power (Maret et al. 2007; Mackiewicz et al. 2008). Недавнее исследование Gilestro et al. (2009) отслеживающее синаптические гены в ходе нормального цикла сон: бодрствование, а также вследствие периодов подавления сна у Drosophila. Они открыли, что экспрессия синаптических белков снижается зависимым от сна способом (Gilestro et al. 2009).
Поскольку эти результаты вымучены, то преждевременно делать заключение, что снижение размаха синапсов является функцией сна. Чтобы с определенностью решить этот вопрос, необходимы генетические инструменты, которые бы позволили лучше визуализовать circuitry и синапсы, необходимые для исследования. Рыбки данио являются идеальным модельным организмом для таких подходов, т.к. они прозрачны и это позволяет визуализовать изменения в синапсах.

Ion channels and channel-regulating molecules


Передовой генетический скрининг у плодовых мушек идентифицировал сон-регулирующие гены, которые важны для активности K+ канала. Линия мух minisleep (mns), выделенная при генетическом скрининге, несет мутацию в Shaker K+ канале (Cirelli et al. 2005a). Исходя из фенотипа mns была протестирована мутация в β subunit of Shaker, hyperkinetic, и была также выявлена уменьшенная продолжительность сна (Bushey et al. 2007). Независимый генетический скрининг выявил мало спящих мутантов, известных как sleepless, у которых также была нарушена активность Shaker K+ канала (Wu et al. 2010; Koh et al. 2008). И sleepless и Shaker мутанты спят очень мало ночью. Интересно, что ни одна из этих мутаций не была спасена в специфической области головного мозга мух, это указывает на глобальные изменения синаптических свойств, лежащих в основе сна.
Эти мутанты имеют др. фенотипы также, такие как более короткая продолжительность жизни, чувствительность к эфиру и в случае Shaker, сниженная способность обучения и памяти (Bushey et al. 2007; Koh et al. 2008). В случае sleepless, было установлено, что чувствительность к эфиру может быть устранена независимо от фенотипа сна (Koh et al. 2008). Было бы интересно узнать, восстанавливается ли продолжительность жизни также независимо.
У мышей большое количество ионных каналов, субъединиц и распределение их делают затруднительным идентификацию роли их для сна. В самом деле, базируясь на перекрываемости K+ каналов у млекопитающих, маловероятно, что мутации их будут найдены с помощью современного генетического скрининга, т.к. такие скрины обычно требуют строгого фенотипа. Однако reverse генетические подходы делают возможной детекцию легких фенотипических отклонений сна у мутантных мышей по Shaker-подобным каналам (Vyazovskiy et al. 2002; Espinosa et al. 2004, 2008; Douglas et al. 2007). Кроме того, мыши, лишенные N-type calcium channel a; 1β субъединицы имеют фенотипические отклонения сна. Эта субъединица важна для многих основных анатомических областей, важных для arousal, включая локус coeruleus и дорсальный raphe (Beuckmann et al. 2003). Соотв., мыши, лишенные этой субъединицы, обнаруживают гиперактивность (повышенную consolidation of REM и повышенные NREM-to-wake переходы). Эти мыши также обнаруживают пониженную силу во время NREM сна, указывая на снижение управления сна. Когда α1G субъединица T-type Ca++ канала подвергается глобальному нокауту у мышей, то они обнаруживают пониженные NREM cortical EEG осцилляции, обусловленные неспособностью замены нейронов в талямусе, чтобы происходить взрывообразным способом и повышение фрагментация сна (Lee et al. 2004; Anderson et al. 2005). Такой же фенотип наблюдается, когда эта субъединица подвергается нокауту специфически в талямусе, тем самым подтверждается верификация повреждений талямуса в arousal и в генерации EEG сна (Anderson et al. 2005). Сходным образом, мыши, лишенные SK2 канала (K+ канал. специфичный для дендритов ретикулярного ядра талямуса) обнаруживают ослабленные delta волны и spindles на EEG, это приводит к очень фрагментированному сну (Cueni et al. 2008). Этот K+ канал связан с T-type Ca+ каналов. описанных выше. Эти животные являются идеальной моделью для выяснения, как специфические электрические атрибуты кортикальных нейронов коррелируют с EEGs сна.

Genes involved in learning and memory


У мышей и мух многие гены, важные для обучения и памяти, целенаправленно изучались в отношении сна. Сюда входили, но не ограничивались, CREB, protein kinase A (PKA), cAMP, ERK, cGMP и некоторые из ионных каналов, представленных выше.
Манипуляции с CREB, регулятором транскрипции, влияют на сон в целом и NREM у мышей (Graves et al. 2003b). Так. мыши, лишенные любой из двух CREB изоформ по всему головному мозгу обнаруживали нарушения сна. Эти животные проводили меньше времени в бодрствовании и имели более продолжительные периоды NREM сна. Они также обнаруживали нарушения памяти и снижение long-term potentiation (LTP) (Graves et al. 2002). Эффект на LTP и формирование зависимой от гиппокампа памяти сходен с таковым, наблюдаемым после периода лишения сна (Graves et al. 2003a). Недавно эффекты лишения сна на LTP удалось устранить с помощью ингибитора специфической PDE, это подтверждает идею, что эффекты сна на пластичность гиппокампа обеспечиваются с помощью передачи сигналов цАМФ (Vecsey et al. 2009). Др. молекула, участвующая в обучении и памяти, а также в сне это brain-derived neurotrophic factor (BDNF) (Monteggia et al. 2004). Уровни BDNF увеличиваются с повышением исследовательского поведения, это также увеличивает глубину delta power во время сна (Huber et al. 2007). Роль BDNF может быть независимой от CREB, поскольку BDNF является главной мишенью для CREB.
Исследования млекопитающих, связывающие сон с генами обучения и памяти в основном ограничены анализом BDNF и CREB. У мух это не имеет места. Но существует множество инструментов, пригодных для изучения мух, которые позволяют исследователям мух исследовать очень специфические части этих путей. Два важных внутриклеточных пути участвуют в сне это cAMP-PKA путь и ERK путь (Hendricks et al. 2001; Joiner et al. 2006; Foltenyi et al. 2007). Считается, что путь цАМФ предоставляет путь передачи сигналов, способствующих бодрствованию, тогда как путь ERK, по крайней мере, в субнаборе нейронов, способствует сну. Мутанты и трансгенные мухи, испытавшие манипуляции с этими различающимися сигнальными путями помогают также локализовать анатомические регионы, важные для регуляции сна. В случае cAMP и PKA, область, известная как mushroom body, оказывается важной (Fig. 1; Joiner et al. 2006; Pitman et al. 2006). Грбовидное тело сходно с гиппокампом млекопитающих тем. что вовлекается в формирование памяти (Heisenberg 2003).
Bushey et al. (2007) обнаружили корреляцию короткого сна с дефицитом кратковременной памяти у мух. Они специально наблюдали гиперкинетических мух и вариации у Shaker мутантов и установили, что независимо от др. поведенческих реакций, фенотипические отклонения сна (кратковременный сон) и снижение памяти были ассоциированы. Сегодня неизвестно, вызывает ли короткий сон дефицит памяти или vice versa. После периода лишения сна обучение ухудшается, но обратное также аргументировано (Cirelli 2009). Генетические манипуляции с грибовидным телом мух, как описывалось выше, могут давать особей или с коротким или с длинным сном в зависимости от затрагиваемой области. Кроме того, мыши, подвергшиеся действию обогащенной среды спят больше (Ganguly-Fitzgerald et al. 2006; Donlea et al. 2009). Это увеличение сна зависит от цАМФ, по-видимому, из-за того, что он участвует в консолидации памяти, и может быть устранено в клетках центральных часов мух (Fig. 1; Donlea et al. 2009).
Как у мух, так и млекопитающих пути циклических нуклеотидов влияют на летаргию червей. Черви, дефицитные по egl-4 (cGMP-зависимая киназа) имеют уменьшенные периоды неподвижности, тогда как мутантны с избыточной функцией egl-4 обнаруживают увеличение периода покоя (Raizen et al. 2008). Сходные фенотипы сна наблюдаются у мух, которые имеют альтерации в cGMP-dependent kinase (Raizen et al. 2008). Также у мышей условный brain нокаут cGMP-dependent protein kinase type 1 вызывает увеличение фрагментации сна, преувеличенные delta рикошеты после бессоницы и уменьшение REM сна (Langmesser et al. 2009). Т.о., роль cGMP в сне законсервирована в ходе эволюции. Мутанты по cGMP protein kinase также обнаруживают дефекты обучения и памяти, как у мышей, так и мух (Feil et al. 2009).
Поскольку анализ генетических мутантов не дает существенного прорыва в нашем понимании сна, он важен во многих отношениях. Во-первых, даже когда исследования были только подтверждающими, они служили без сомнения установлению определенного механизма или роли специфических молекул для сна. Это распространяется также на гены, лежащие в основе болезней, ассоциированных с проблемами сна: нарушения сна описываются у людей с синдромом Angelman и Fragile X syndrome, и в обоих случаях нокаут соотв. генов у мышей и/или мух давал circadian/sleep фенотип (Dockendorff et al. 2002; Y Wu et al. 2008; Zhang et al. 2008). Во многих случаях генетические мутанты помогают устранить расхождения. Более того, прямой генетический скрининг модельных организмов уже идентифицировал новые молекулы и в будущем приведет к paradigm-shifting находкам. Такие скрининги непосредственно ассоциированных генов с функцией и, что важно, они дают полностью беспристрастный подход, который без сомнения является лучшим подходом к процессу, о котором мало известно. Наконец, анатомические исследования, проведенные на беспозвоночных, уже показали перекрывание между сном и др. аспектами физиологии, напр., метаболизмом. Эти находки могут быть неоценимы для подтверждения функции сна. Важно, что они легко согласуются с экспериментами, предназначенными для решения специфических гипотез.
Будущий потенциал генетических подходов также громаден, учитывая быстрое развитие новых генетических инструментов и технологий. Напр., использование оптогенных инструментов tуже предоставило информацию о пути orexin (Adamantidis et al. 2007; Zhang et al. 2007). Кроме того, индуцибельная и тканеспецифическая экспрессия генов, которая делает возможной точную направленность генетических манипуляций, сможет без сомнения прояснить функции сна генов, чья роль сегодня противоречива. При слиянии фармакологических методов и генетических инструментов, будут разработаны вирусы, которые могут быть внесены в специфические анатомические области (Adachi et al. 2008; Fuller et al. 2008). Мухи предоставят много уникальных генетических техник, некоторые из которых были уже обсуждены. Разработаны инструменты, которые позволят ученым изменять активность/передачу сигналов в субнаборах нейронов; включая, но не ограничиваясь экспрессией Na+ и K+ каналов, Ca++ каналов и везикулярной доставки блокаторов (for review, see Hodge 2009). Мониторинг цАМФ также будет разработан, который может специфически экспрессироваться в определенных клетках (Shafer et al. 2008). Наконец, у мух и млекопитающих будут разработаны техники специфического мечения субнаборов нейронов в головном мозге и будут определены профили их экспрессии (Zong et al. 2005; Miller et al. 2009).

Conclusion


Genetics can tell us a lot about what sleep does for organisms, but the potential of this approach has only just started to be recognized in the sleep field. With the generation of conditional and anatomically restricted knockouts (or knock-ins) in mice, we are on the verge of answering many questions. These include determining the roles of adenosine and BDNF in sleep and memory. In flies, anatomically and/or temporally restricted expression of sleep-regulating transgenes has already been performed. These approaches have provided great insight into the role of specific signaling pathways in sleep. In the future, this technology will be used to rescue sleep mutants in a region-specific manner, although some of these mutations, such as in ion channels, may turn out to have global effects that cannot be rescued in specific areas. However, the real power of the fly, worm, and fish models lies in their amenability to unbiased genetic screens. With a process like sleep, about which little is known, we suggest that the best approach is one that is not associated with any preconceived assumptions, since it allows the identification of completely novel mechanisms and pathways. Thus far, it appears that redundancy and/or compensation in mammals will make it difficult to detect strong phenotypes through genetic screens. The fly work, on the other hand, has already demonstrated that mutants with strong phenotypes can be identified.
While forward genetic screens in mice may not be realistic (or cost-effective), QTL analysis and microarray approaches are yielding potential sleep-regulating genes. The use of the new genetic tools described above will allow researchers to investigate whether or not these genes specifically affect sleep. An example of this is provided by the Rarb story, where the gene was identified through QTL mapping, and then specific targeted disruptions of this gene were undertaken.
At this point, there is no evidence that a single gene, or subset of genes, acting in a specific subset of neurons is responsible for sleep. It is more likely that sleep is a network phenomenon. It is also likely that there will be many hypotheses for why we sleep and strong evidence for each, since many of the neurotransmitters and signaling pathways that keep us awake serve other functions. For instance, orexin is apparently involved in both feeding behavior and maintaining wakefulness. Sleep deprivation results in several impaired processes, some of which may turn out to reflect consequences of increased wakefulness rather than indicating an actual function of sleep. With the advancement of new genetic tools, it is likely that we will soon see experiments directly testing some of these hypotheses, such as cellular metabolic function and synaptic scaling. From the data discussed in this review, it is likely that sleep is important for overall homeostatic regulation of the entire organism, possibly down to within-the-cell homeostasis. It is clear that sleep is a very basic process, and that studying it in model organisms will provide significant insight into why we sleep. In general, advances in genetics in all model organisms will provide a wealth of knowledge for the sleep field in the coming years.
Сайт создан в системе uCoz