Формирование сомитов происходит периодически путем сегментации и созревания групп клеток передней пресомитной мезодермы presomitic mesoderm (PSM) (Dequeant and Pourquie 2008). Считается, что место сегментации зависит от часов, контролируемых циклическими генами, такими как сигнальные молекулы Notch, тогда как время созревания зависит от фронта волны, устанавливаемого морфогенами, такими как Fgf8 (Dubrulle et al. 2001; Sawada et al. 2001; Lewis et al. 2009). Однако осцилляции передачи сигналов Notch становятся медленнее, чем темп сегментации, т.к. осцилляции распространяются кпереди (Palmeirim et al. 1997; Giudicelli et al. 2007), возникает вопрос, может ли такой медленный осциллятор регулировать темп сегментации. Более того, передача сигналов Fgf, по-видимому, непрестанно возвращается назад к устойчивой скорости по мере роста PSM (Dubrulle and Pourquie 2004; Aulehla and Pourquie 2010). Возникает ещё вопрос, происходит ли очистка от передачи сигналов Fgf в разное время между передними и задними клетками даже в одних и тех же проспективных сомитах.

В PSM мыши Hes7 экспрессируется колебательным способом и индуцирует осцилляторную экспрессию Lunatic fringe (Lfng), модулятора передачи сигналов Notch (Bessho et al. 2001; Dale et al. 2003; Serth et al. 2003). Осцилляции Lfng в свою очередь ведут к циклическому образованию Notch intracellular domain (NICD) (Huppert et al. 2005; Morimoto et al. 2005), активной формы Notch, которая затем периодически индуцирует экспрессию Mesp2, гена, важного для сегментации и формирования ростро-каудального паттерна в каждом сомите (Saga et al. 1997). Экспрессия Mesp2 зависит от NICD и Tbx6 и происходит после устранения передачи сигналов Fgf и Wnt во всей S-1 области, группе клеток, которая формирует проспективный сомит (Evrard et al. 1998; Zhang and Gridley 1998; Aulehla et al. 2008; Oginuma et al. 2008, 2010). Высокого разрешения гибридизация in situ демонстрирует, что S-1 клетки синхронно демонстрируют ядерные точки сигналов Mesp2, указывая на синхронную инициацию транскрипции Mesp2 во всей S-1 области (Oginuma et al. 2008, 2010). У Lfng-нулевых мышей с дефектами сегментации (Evrard et al. 1998; Zhang and Gridley 1998), экспрессия Mesp2 становится рандомизированной в S-1 клетках, обнаруживая паттерн типа соль-и-перец (Oginuma et al. 2010). Эти результаты указывают на то, что синхронная экспрессия Mesp2 в S-1 клетках важна для образования сомитов. Однако, как замедление осцилляторов передачи сигналов Notch и устойчивая регрессия передачи сигналов Fgf и Wnt регулирует периодичность и синхронность экспрессии Mesp2 в S-1 клетках неизвестно.

Мы установили, что эффекторы передачи сигналов Notch и Fgf осциллируют с разной динамикой и что осцилляции передачи сигналов Notch периодически выделяют группу синхронизированных клеток, в то время как осцилляции передачи сигналов Fgf высвобождают эти синхронизированные клетки для сомитогенеза в то же самое время. Эти результаты указывают на то, что осцилляторы Notch предопределяют область проспективного сомита, тогда как осцилляторы Fgf регулируют темп сегментации, тем самым увязывая часы и фронт волны.

Oscillations in Notch and Fgf pathways show different dynamics

NICD и Hes7 белок экспрессируются взаимоисключающим образом, за исключением заднего конца PSM. Кроме того, домены экспрессии Hes7 и NICD сужались по мере их продвижения кпереди и формировались две области с перемежающимися сдвигами по фазе: Hes7⁺NICD^- (S-1) и Hes7^-NICD⁺ (S-2) (Fig. 1M-O). У Hes7-нулевых мышей, NICD экспрессируется усточиво в PSM (Fig. 1S-U), указывая тем самым, что динамика экспрессии NICD зависит от Hes7.

Затем мы исследовали пространственно-временные профили сигнальных молекул Fgf. Hes7 индуцирует осциллирующую экспрессию Dusp4, ингибитора передачи сигналов Fgf (Niwa et al. 2007), это, в свою очередь, ведет к циклическому образованию Fgf эффектора, фосфорилированной ERK (pERK) (Sawada et al. 2001; Delfini et al. 2005; Niwa et al. 2007). Во время фазы I, Dusp4 экспрессируется в задней до средней части PSM, в то время, когда экспрессия pERK была низкой (Fig. 1D-F). Во время фазы II, экспрессия Dusp4 подавляется, тогда как экспрессия, pERK усиливается в задней до средней части PSM (Fig. 1J-L). Во время фазы III, экспрессия Dusp4 несколько усиливается, тогда как, экспрессия pERK продолжает усиливаться сзади по отношению к S-2 региону и также начинает обнаруживаться в S0 (Fig. 1P-R). Т.о., экспрессия pERK осуществляется колебательным способом позади S-2 региона. Hes7-нулевые мыши обнаруживают один паттерн экспрессии pERK и Dusp4 (Fig. 1V-X), указывая тем самым, что осцилляции pERK и Dusp4 зависят от Hes7. Следовательно, Hes7-зависимые осцилляции NICD и pERK обнаруживают разную динамику относительно др. др.: осцилляция NICD обнаруживает паттерн распространения в виде полосы от места позади S0, в то время как осцилляции pERK обнаруживают паттерны вкл-выкл позади S-2.

Notch signaling is required for segregation of synchronized regions

Экспрессия белков NICD и Hes7 была четко разделена от средины кпереди PSM (Fig. 2A,B,B?,D,E,E?,G,H,H?). Напротив, на заднем конце PSM, NICD⁺ клетки и Hes7⁺ клетки были перемешаны и некоторые клетки даже ко-экспрессировали NICD и Hes7 во всех трех фазах (Fig. 2A,C,D,F,G,I). Т.о., синхронизация и сегрегация осцилляций Hes7 и NICD была неполной в задней, но становилась очевидной в средней и передней областях.

Известно, что передача сигналов Notch участвует в синхронизации осцилляций у рыбок данио (Jiang et al. 2000; Horikawa et al. 2006; Riedel-Kruse et al. 2007). Мы исследовали Lfng-нулевых мышей, у которых осцилляции передачи сигналов Notch нарушены (Morimoto et al. 2005). На заднем конце PSM у Lfng-нулевых мышей, Hes7- и NICD-экспрессирующие клетки были перемешаны и некоторые клетки ко-экспрессируют Hes7 и NICD (Fig. 2J,L). Т.е. паттерн экспрессии не был существенно затронут по сравнению с диким типом на заднем конце PSM (Fig. 2C,F,I,L). Однако домены экспрессии Hes7 и NICD не обнаруживали четкой сегрегации даже в S0 или S-1 регионе Lfng-нулевых мышей (Fig. 2J,K,K?): Hes7⁺ и NICD⁺ клетки были разбросаны по всей PSM и были перемешаны др. с др. (Fig. 2J,K). Некоторые клетки даже коэкспрессировали Hes7 и NICD, как это происходит на заднем конце PSM (Fig. 2J-L). Следовательно, Lfng регулирует синхронизацию и сегрегацию осцилляций Hes7 и NICD, формируя тем самым регионы альтернативного фазового сдвига: S-1 и S-2. У Lfng-нулевых мышей экспрессия NICD не обнаруживает осцилляций (Morimoto et al. 2005), тогда как в др. исследовании показано, что она осциллирует (Ferjentsik et al. 2009). Наши результаты указывают, что синхронизированные осцилляции NICD сильно нарушены у Lfng-нулевых мышей (Fig. 2J-L).

Мы анализировали динамику осцилляций у Hes7 промотором-управляемого UbLuc репортера мыши (Masamizu et al. 2006; Takashima et al. 2011). В норме экспрессия репортера обнаруживала высокую амплитуду осцилляций (Supplemental Movie S1) и характерные пространственно-временные профили (Supplemental Figs. S1, S2A,G). У Hes7-нулевых мышей экспрессия репортера не осциллировала, приводя к тяжелым дефектам сегментации (Supplemental Fig. S2C,F,G; Supplemental Movie S3). У Lfng-нулевых мышей экспрессия репортера осциллировала с той же самой периодичностью, что и в контроле, но обнаруживала нечеткие и более широкие паттерны (Supplemental Fig. S2B,G; Supplemental Movie S2). Экспрессия Uncx4.1 также оказывалась сегментированной нечетко у этих мышей по сравнению с контролем (Supplemental Fig. S2D,E). Ясно, что белок Lfng необходим для сужения и более четкой сегрегации Hes7⁺ и NICD⁺ доменов, что ведет к более сильной осциллирующей экспрессии Hes7 и NICD. pERK осцилляции высвобождают всю S-1 область для дифференцировки в то же самое время.

Во время фазы II и III экспрессия NICD в задней части перемещается от средины к S-2 области, тогда как pERK экспрессируется в области сзади от S-2 региона (Fig. 3A-D), указывая, что задний NICD домен перекрывается pERK доменом. Однако, во время фазы I, когда S-2 становится S-1 после сегментации, экспрессия pERK подавляется и весь NICD домен в S-1 освобождается от pERK (Fig. 3E,F). Экспрессия Mesp2 синхронно инициируется в S-1 клетках во время этого периода(Oginuma et al. 2008, 2010). Поскольку экспрессия Mesp2, как известно, репрессируется с помощью передачи сигналов Fgf (Oginuma et al. 2008), то время, когда NICD домен в S-1 освобождается от pERK, скорее всего, совпадает с началом экспрессии Mesp2.

Исследовали экспрессию Mesp2 и сигнальную активность Fgf-ERK с использованием красного (SLR) и зеленого (ELuc) репортеров luciferase (Nakajima et al. 2004, 2010). Эти белки слишком стабильны, чтобы отслеживать осциллирующую экспрессию, поэтому они дестабилизировались с помощью убиквитинирования (UbSLR и UbELuc). Транскрипция Mesp2 отслеживалась с Mesp2 промотором-управляемого UbELuc (Mesp2-UbEluc), тогда как сигнальная активность Fgf-ERK отслеживалась с помощью Dusp4 промотора-управляемого UbSLR (Dusp4-UbSLR). Экспрессия репортера Dusp4-UbSLR в точности воспроизводит экспрессию pERK в PSM (Supplemental Fig. S3A-E). Трансгенные мыши, несущие репортеры Mesp2-UbEluc и Dusp4-UbSLR были получены и культуры эксплантов задних половин эмбрионов на ст. E10.5 были обработаны для наблюдения красной и зеленой биолюминисценции (Fig. 3G; Supplemental Movie S4). Во время фазы II и III, передача сигналов Fgf-ERK (Fig. 3G, red) была активной от задней до S-2 области (Fig. 3G, frames 1-3), хотя активность постепенно снижалась. После сегментации передача сигналов Fgf-ERK оказывалась в основном отрицательной, а экспрессия Mesp2 (Fig. 3G, green) инициировалась в S-1 области (Fig. 3G, frame 4, bottom arrow indicates a newly formed boundary, while a broken line shows a prospective boundary). Во время фазы I, экспрессия Mesp2 появлялась во всей S-1 области(Fig. 3G, frames 4-6). Во время фазы II, экспрессия Mesp2 снижалась к ростральной области S-1, тогда как передача сигналов Fgf-ERK постепенно увеличивалась (Fig. 3G, frames 7,8). Эти результаты показывают, что экспрессия Mesp2 инициируется во всей S-1 области сразу, как только она освобождается от передачи сигналов Fgf-ERK.

Fgf signaling is required for periodic expression of Mesp2

Осцилляции передачи сигналов Notch создают группу клеток, синхронно экспрессирующих NICD, тогда как осцилляции передачи сигналов Fgf-ERK освобождают NICD⁺ клетки от ингибирования, тем самым позволяя всем S-1 клеткам экспрессировать Mesp2 в одно и то же время. Time-lapse imaging анализ показал, что в норме экспрессия Mesp2 появляется периодически в S-1 (Fig. 4A,A?,E; Supplemental Fig. S4A), как было показано ранее (Saga et al. 1997). У Hes7-нулевых мышей домен экспрессии pERK не осциллирует, но регрессирует с постоянной скоростью (Fig. 1V-X), что также было подтверждено с помощью time-lapse imaging экспрессии репортера Dusp4-UbSLR (Supplemental Fig. S3F). У этих мышей экспрессия Mesp2 также происходила не периодически, а регрессировала с постоянной скоростью (Fig. 4B,B?; Supplemental Fig. S4B). Т.о., у Hes7-нулевых мышей начало экспрессии Mesp2 происходило в разное время в передних и задних клетках даже в одном и том же проспективном сомите, открывая возможность, начало десинхронизированной экспрессии Mesp2 ведет к дефектам сегментации и формирования паттерна. Следовательно, осцилляции передачи сигналов Fgf-ERK необходимы для периодической экспрессии Mesp2 во всей S-1 области.

Мы предприняли попытку постоянной инактивации передачи сигналов Fgf. Однако у Fgfr1-нулевых мышей осцилляции Hes7 и Lfng терялись (Niwa et al. 2007), и поэтому наблюдаемые дефекты могли быть обусловлены потерей осцилляций передачи сигналов Notch и Fgf. Известно, что обработка ингибиторами передачи сигналов Fgf быстро блокирует передачу сигналов Fgf, но очень медленно затрагивает передачу сигналов Notch (Niwa et al. 2007; Wahl et al. 2007). Поэтому мы проверяли ранний эффект SU5402, ингибитора передачи сигналов Fgf, на экспрессию Mesp2. Обработка SU5402 полностью устраняла экспрессию репортера Dusp4-UbSLR (Supplemental Fig. S3G), указывая, что теряются активности Fgf-ERK. Time-lapse imaging анализ показал, что без действия Fgf-ERK, экспрессия Mesp2 происходит непрерывно и преждевременно (Fig. 4C,C?, the third signal appeared prematurely and was fused with the second), по сравнению с нормой (Fig. 4A,A?). В диком типе экспрессия Mesp2 инициируется в S-1 сразу после сегментации (Fig. 4E, control, frames 43,61), тогда как в обработанной SU5402 PSM, новая экспрессия Mesp2 происходит преждевременно в S-2 и далее в задней области до сегментации (Fig. 4F, +SU5402, frame 28, white arrow, note that the next segmentation is indicated by the lowest black arrow in frame 37). Осуществляли непрерывную активацию передачи сигналов Fgf путем воздействия Dusp ингибитора BCI (Molina et al. 2009). Обработка BCI ведет к устойчивой экспрессии репортера Dusp4-UbSLR (Supplemental Fig. S3H), указывая, что действие Fgf-ERK устойчиво активно. Time-lapse imaging анализ показал, что экспрессия Mesp2 не периодическая, но регрессирует неуклонно в присутствии BCI (Fig. 4D,D?,G), указывая, что экспрессия Mesp2 происходит в передней части PSM после устойчивой регрессии активности Fgf-ERK. Очевидно, что Fgf-ERK-зависимые осцилляции регулируют периодичность начала экспрессии Mesp2 в S-1.

Было показано, что передача сигналов Notch необходима для синхронизации осцилляций между клетками PSM у рыбок данио (Jiang et al. 2000; Horikawa et al. 2006; Riedel-Kruse et al. 2007), и наше исследование согласуется с этой идеей, но показывает, что Lfng необходим для синхронизации у мышей. Осцилляции Hes7 и NICD становятся ~1.5-раза медленнее в передней части PSM, чем в задней и, скорее всего, это замедление осцилляций ведет к сужению и сегрегации синхронизированных регионов (mathematical modeling; Supplemental Figs. S5-S8). Если эти осцилляции не замедленны в передней части PSM, то размеры сомитов, скорее всего, будут сильно нарушены (mathematical modeling; Supplemental Fig. S9). Т.о., замедление осцилляций передачи сигналов Notch важно для установления проспективной области сомита. Осцилляции передачи сигналов Fgf затем периодически освобождают NICD домен от ингибирования, тем самым индуцируя экспрессию Mesp2 вол всей S-1 области в то же самое время (Fig. 5). Эти особенности хорошо согласуются с традиционной концепцией "clock and wave front model" (Cooke and Zeeman 1976): Notch осцилляции представляют часы, тогда как осцилляции Fgf составляют зыбкий фронт волны. Важно, что эти осцилляции, купированны с помощью Hes7 в задней части PSM, но сдвинуты по фазе в передней части PSM. Наши результаты показывают, что осцилляторы Notch и Fgf регулируют периодичность в пространстве и во времени, соотв., и что Hes7 интегрирует эти осцилляторы, связывая тем самым часы и фронт волны.

Different types of oscillations in Notch and Fgf signaling regulate the spatiotemporal periodicity of somitogenesis Yasutaka Niwa, Hiromi Shimojo, Akihiro Isomura, Aitor Gonzalez, Hitoshi Miyachi and Ryoichiro ??? Журнал и т.п.

Different types of oscillations in Notch and Fgf signaling regulate the spatiotemporal periodicity of somitogenesis
Yasutaka Niwa, Hiromi Shimojo, Akihiro Isomura, Aitor Gonzalez, Hitoshi Miyachi and Ryoichiro ???
Журнал и т.п.