tRNA biology charges to the front | |
|
tRNA biology has come of age, revealing an unprecedented level of understanding and many unexpected discoveries along the way. This review highlights new findings on the diverse pathways of tRNA maturation, and on the formation and function of a number of modifications. Topics of special focus include the regulation of tRNA biosynthesis, quality control tRNA turnover mechanisms, widespread tRNA cleavage pathways activated in response to stress and other growth conditions, emerging evidence of signaling pathways involving tRNA and cleavage fragments, and the sophisticated intracellular tRNA trafficking that occurs during and after biosynthesis.
|
Биогенез tRNA использует синтез инициального транскрипта, сопровождаемый процессингом, чтобы удалить 5' leader, отделать 3' trailer, добавить CCA, вырезать интроны, которые могут присутствовать, модифицировать множественные остатки нуклеозидов (Fig. 1), а у эукариот экспортировать tRNA в цитоплазму, прежде чем она будет использована для трансляции (Hopper and Phizicky 2003). Хотя на первый взгляд простой процесс, однако в последнее время неожиданно были выявлены сложности и широкий размах процессинга tRNA и путей переноса и скрытые множественные уровни регуляции биосинтеза и функции tRNA. Впервые выявлен почти полный набор генов, необходимых для биогенеза tRNA у дрожжей Saccharomyces cerevisiae (Table 1).
Figure 1.
A schematic of modifications found in cytoplasmic tRNA in S. cerevisiae. tRNA is shown in its usual secondary structure form, with circles representing nucleotides and lines representing base pairs. (Green circles) Residues that are unmodified in all yeast tRNA species; (pink circles) residues that are modified in some or all tRNA species; (white circles) additional residues (20a and 20b) that are present in some, but not all, tRNAs and are sometimes modified; (red circles) anticodon residues, which are modified in some tRNAs; (light-blue circles) the CCA end. Conventional abbreviations are used; see the Modomics database (http://modomics.genesilico.pl). (Ψ) Pseudouridine; (Am) 2'-O-methyladenosine; (Cm) 2'-O-methylcytidine; (m1G) 1-methylguanosine; (m2G) 2-methylguanosine; (ac4C) 4-acetylcytidine; (D) dihydrouridine; (Gm) 2'-O-methylguanosine; (m2,2G) N2,N2-dimethylguanosine; (m3C) 3-methylcytidine; (I) inosine; (m5C) 5-methylcytidine; (mcm5U) 5-methoxycarbonylmethyluridine; (mcm5s2U) 5-methoxycarbonylmethyl-2-thiouridine; (ncm5U) 5-carbamoylmethyluridine; (ncm5Um) 5-carbamoylmethyl-2'-O-methyluridine; (m1I) 1-methylinosine; (i6A) N6-isopentenyl adenosine; (yW) wybutosine; (t6A) N6-threonylcarbamoyladenosine; (Um) 2'-O-methyluridine; (m7G) 7-methylguanosine; (rT) ribothymidine; [Ar(p)] 2'-O-ribosyladenosine (phosphate). The pictured molecule starts at position ?1 and is numbered consecutively from the next base (+1) to 76 (with the insertion of two residues [20a and 20b]). Several tRNA species have a longer variable arm starting after residue 44, and some tRNAs have different numbers of residues in the D-loop and the variable arm, but the anticodon is always numbered residues 34, 35, and 36, and the CCA end is always numbered residues 74, 75, and 76.
Table 1
S. cerevisiae genes implicated in tRNA processing and tRNA trafficking Multiple layers of regulation of tRNA transcription Гены tRNA и rRNA транскрибируются на высоком уровне, производя у дрожжей ~3 миллионов tRNAs на поколение и 300,000 рибосом (Waldron and Lacroute 1975), по сравнению с примерно 60,000 мРНК (Ares et al. 1999). Поскольку энергия, затрачиваемая на транскрипцию tRNA и rRNA, и поскольку необходима координация функции tRNA и рибосом, то транскрипция tRNA посредством RNA polymerase III (Pol III) и транскрипция rRNA посредством Pol I д. быть скоординирована и регулироваться в ответ на доступность клеточных питательных веществ и др. средовую информацию. Вследствие несоотв. регуляции транскрипции tRNA была занижена оценка в результатах Marshall et al. (2008), показавших, что повышенная транскрипция tRNAiMet может способствовать клеточной пролиферации и иммортализации, а также туморогенезу у мышей. В последнюю декаду достигнут прогресс в расшифровке механизмов транскрипции с помощью Pol III, регулируемой и координируемой с внешними сигналами (rev. Willis and Moir 2007; Ciesla and Boguta 2008).
Pol III негативно регулируется с помощью одиночного белка, Maf1, впервые открытого у дрожжей благодаря его эффектам на tRNA-обусловленную супрессию nonsense (Murawski et al. 1994; Moir et al. 2006). Maf1 законсервирован у эукариот, хотя Maf1 млекопитающих негативно регулирует транскрипцию Pol I и Pol II в дополнение к транскрипции Pol III (Pluta et al. 2001; Reina et al. 2006; Johnson et al. 2007). Maf1 у дрожжей и млекопитающих взаимодействует непосредственно с субъединицами Pol III (Pluta et al. 2001; Gavin et al. 2006; Oficjalska-Pham et al. 2006; Reina et al. 2006) и компонентами TFIIIB транскрипционного фактора (Upadhya et al. 2002; Desai et al. 2005; Reina et al. 2006; Rollins et al. 2007; for review, see Ciesla and Boguta 2008).
Существенные доказательства указывают на то, что PKA и TOR пути регулируют Maf1. При благоприятных условиях роста, Maf1 фосфорилируется как с помощью PKA, так и TOR-зависимой киназы Sch9 (Huber et al. 2009; J Lee et al. 2009; Wei et al. 2009; rev. Boguta 2009). Активность Maf1 также регулируется с помощью TOR посредством Sch9-независимого механизма (J Lee et al. 2009; Wei and Zheng 2009). Фосфорилирование Maf1 предупреждает его негативную регуляцию транскрипции Pol III.
Maf1 дефосфорилируется в ответ на условия, которые замедляют рост-голодание, сдвиг с ферментации на углеродистые источники дыхания, повреждения ДНК и различные др. внешнесредовые стрессы (Boisnard et al. 2009; for review, see Willis and Moir 2007; Ciesla and Boguta 2008)-а нефосфорилированный Maf1 способен негативно регулировать транскрипцию Pol III. Более ранние исследования выявили участие Tpd3, регуляторной субъединицы TOR-зависимой протеин фосфатазы PP2A, в транскрипции tRNA (van Zyl et al. 1992), и с тех пор стало ясно, что Maf1 остается фосфорилированным у PP2A мутантов (Boisnard et al. 2009), указывая тем самым, что PP2A является фосфатазой, действующей на Maf1.
В некоторых видах дрожжей фосфорилированный Maf1 располагается в цитоплазме и, , следовательно, неспособен находить и репрессировать транскрипцию Pol III. Цитоплазматическая локализация Maf1 обеспечивается двумя механизмами: зависимой от фосфорилирования инактивацией Maf1 nuclear location signals (NLSs) (Moir et al. 2006) и ядерным экспортом фосфорилированного Maf1 с помощью exportin Msn5 (Towpik et al. 2008). Напротив, при ограничении пищи и стрессовых условиях, дефосфорилированный Maf1 локализуется в ядре и поэтому способен достичь Pol III и подавить транскрипцию tRNA.
Хотя разное распределение Maf1 между ядром и цитоплазмой может , в принципе, объяснить регуляцию с помощью Maf1 транскрипции Poll III, однако, две линии доказательств указывают, что ядерно-цитоплазматическая динамика Maf1 вместо этого может быть механизмом тонкой регуляции. Во-первых, Maf1 остается способным соотв. образом регулировать транскрипцию Pol III в клетках, лишенных Msn5, который необходим для экспорта фосфорилированного Maf1 из ядра (Towpik et al. 2008). Во-вторых, хотя Maf1 постоянно локализуется в ядре на распространенном W303 фоне дрожжевых линий, регуляция с помощью Maf1 Pol III, тем не менее, чувствительна к внешнесредовым сигналам (Wei et al. 2009). Поскольку фосфорилирование Maf1 предупреждает также взаимодействие Maf1 с Pol III (Oficjalska-Pham et al. 2006), то вполне возможно, что это взаимодействие может быть первичным уровнем негативной регуляции транскрипции Pol III с помощью Maf1. tRNA end-processing and splicing reveal new insights in biology and evolution Surprises in 5' processing Изучение RNase P катализа выявило серию удивительных открытий о природе катализа и универсальной потребности для осуществления реакции. Общепринятая догма процессинга tRNA всегда связывала синтез предшественника tRNA, содержащего 5' leader последовательность, которая впоследствии удаляется с помощью эндонуклеазы RNase P (Walker and Engelke 2006). Общепринятой догмой было с начала 1980s то, что RNase P является ribonucleoprotein (RNP) и что РНК является каталитическим компонентом у бактерий (Guerrier-Takada et al. 1983; Torres-Larios et al. 2005), который обладает одним белковым компонентом, а у archaea (Pannucci et al. 1999) имеется 5 белковых компонентов (Cho et al. 2010). Однако источник катализа RNase P оставался неизвестен у эукариот, таких как дрожжи или человек, которые имеют 9 (Table 1) или 10 белковых субъединиц, соотв., в дополнение к их РНК компонентам (Walker and Engelke 2006), в частности, поскольку их РНК компоненты обнаруживают существенные различия в регионах, важных для стабильности и катализа (Marquez et al. 2005, 2006). Несмотря на это результаты Kirsebom and coworkers (Kikovska et al. 2007) продемонстрировали, что РНК компонент эукариотической RNase P человека или Giardia lamblia является фактически каталитическим, хотя и с очень слабой кинетикой, скорее всего, обусловленной частично отсутствием у эукариот спиралей P15-P17 (Marquez et al. 2005, 2006). Этот низкий уровень каталитической активности подтверждает идею выдающейся роли одного или нескольких белковых компонентов эукариот для стимуляции катализа с помощью РНК компонента (Marquez et al. 2006). В самом деле, Gopalan с сотр. (Tsai et al. 2006) продемонстрировали с помощью реконструированного archaeal RNase P голоэнзима, что белковые субъединицы оказывают 4000-кратный стимулирующий эффект на эффективность катализа.
В свете этих доказательств, что РНК компонент RNase P всегда является каталитическим компонентом, стала совершенно неожиданной находка, что митохондриальная RNase P человека не содержит РНК компонента вовсе (Holzmann et al. 2008). Хотя уже в ранних сообщениях появлялись намеки, что активность RNase P в хлоропластах (Wang et al. 1988) и в митохондриях человека (Rossmanith and Karwan 1998) не нуждается в РНК компоненте, данные на хлоропластах не были подтверждены более 20 лет, а данные на митохондриях человека оспаривались (Puranam and Attardi 2001), это привело многих к убеждению, что активная RNase P обязательно нуждается в РНК. Однако, Rossmanith с коллегами (Holzmann et al. 2008) убедительно показали, что RNase P из митохондрий человека на самом деле представлена только тремя на вид неродственными полипептидами: белком, родственным tRNA m1G9 methyltransferase, членом комплекса коротоцепочечных dehydrogenase/reductase и неохарактеризованным ORF. Поскольку активная RNase P была реконструирована после экспрессии и очистки этих трех белковых субъединиц у Escherichia coli, то определенно этот энзим не нуждается в РНК.
Новые результаты выявили исключение в кажущейся универсальной потребности для активности RNase P во время биогенеза tRNA. Компьютерный анализ подтвердил, что в RNase P РНК отсутствует у Nanoarchaeum equitans, Pyrobaculum aerophylum и Aquifex aeolicus (Li and Altman 2004). Затем, Soll с коллегами (Randau et al. 2008) предоставили экспериментальные доказательства, что N. equitans содержит гены tRNA, которые транскрибируются без лидерной последовательности и что, скорее всего, функциональны без дальнейшего процессинга. Эти tRNAs имели triphosphorylated 5' концы, а в некоторых случаях также имели дополнительные пуриновые основания в позиции -1 и были функциональны in vitro в отношении зарядки с этих необычных 5' концов (Randau et al. 2008).
RNase P, как теперь известно, обладает разными субстратами у бактерий, дрожжей, в клетках растений и позвоночных (rev. Kirsebom 2007). У дрожжей геномные исследования по идентификации аутентичных физиологически значимых RNase P субстратов выявили роль RNase P в процессинге box C/D small nucleolar RNAs (snoRNAs) (Coughlin et al. 2008) и в процессинге HRA1 noncoding RNA (ncRNA) (Samanta et al. 2006; Yang and Altman 2007), тогда как у позвоночных RNase P, как было установлено, преобразует как MALAT РНК, так и Men β транскрипты (Wilusz et al. 2008; Sunwoo et al. 2009). Остается определить, какие ещё РНК преобразуются с помощью RNase P, и если да, то до какой степени, имеется биологическая связь, соединяющая эти активности с процессингом tRNA. 3' Processing and the rise of RNase Z Новые данные последних лет существенно улучшили наше понимание процессов, с помощью которых 3' конец tRNAs преобразуется у разных организмов. Созревание 3' конца tRNA всегда нуждается в удалении 3' trailer из исходного транскрипта и также часто нуждается в последующем добавлении CCA после N73, хотя, у некоторых бактерий и archaea, некоторые, но не все tRNA гены кодируют CCA (Vogel et al. 2005; Hartmann et al. 2009). Более ранние биохимические и in vivo работы на E. coli установили важную роль эндонуклеазы RNase E в инициальном отщеплении большей части 3' trailers (Li and Deutscher 2002; Ow and Kushner 2002) и для последующего урезания (trimming) с помощью 3' экзонуклеаз, прежде всего с помощью RNase PH и RNase T, но также с помощью RNase II, PNPase, и RNase BN (Li and Deutscher 1994, 1996). Сходным образом, до биохим. работ на эукариотах, была установлена активность эндонуклеаз (Castano et al. 1985; Furter et al. 1992) и экзонуклеаз (Garber and Altman 1979; Engelke et al. 1985), а фракционирование у дрожжей показало существование более чем одного источника для каждой активности (Papadimitriou and Gross 1996). Затем, Wolin с коллегами (Yoo and Wolin 1997) продемонстрировали, что 3' эндонуклеазная активность у дрожжей нуждается в дрожжевом La protein (Lhp1), и предоставили доказательства, что в отсутствие La белка ряд tRNAs подвергался процессингу с помощью альтернативного пути с использованием экзонуклеазной активности.
Появляющиеся данные демонстрируют, что эндонуклеаза RNase Z (также наз. tRNase Z) (Schiffer et al. 2002) играет основную роль в удалении 3' trailer с tRNAs у нескольких организмов (for rev. Vogel et al. 2005). Большинство RNase Z энзимов специфически расщепляют tRNAs непосредственно после основания discriminator (N73), чтобы удалить 3' trailer, перед добавлением CCA, и имеются доказательства, подтверждающие, что RNase Z выполняет ту же саму роль in vivo. Т.о., линии Bacillus subtilis , истощенные по RNase Z, накапливают большие количества tRNAs, содержащих 3' расширения, среди них ряд tRNAs, лишенных закодированной CCA последовательности (Pellegrini et al. 2003), а RNAi воздействие на Drosophila S2 клетки, чтобы послеть в нокдаун экспрессию RNase Z , приводило к накоплению как ядерных, так и митохондриалных tRNAs, которые сохраняли свои 3' trailers (Dubrovsky et al. 2004).
Одним из удивительных биохим. свойств многих RNase Z энзимов является неспособность расщеплять виды tRNA со зрелым CCA концом (Mohan et al. 1999). Так, для B. subtilis RNase Z субстраты с CCA последовательностью в начале 3' trailer имеют KM, которая в 2.5-раза выше, а Vmax, которая составляет 0.4 % от субстратов с последовательностью UAA в этой позиции, наибольший эффект обеспечивается первым C в позиции N74 (Pellegrini et al. 2003). Это драматическое anti-determinant свойство CCA конца предохраняет зрелые tRNA от того, чтобы стать предметом расщепления, и запускать бесполезный цикл. Это anti-determinant свойство также служит указанием на существование др. механизмов для формирования 3' конца tRNAs, которые кодируют CCA последовательность у организмов, таких как B. subtilis, которые обладают tRNAs как с, так и без закодированных CCAs. У этого организма, RNase PH и др. RNase T-подобная экзонуклеаза участвуют в созревании tRNAs с закодированной CCA последовательностью (Wen et al. 2005; Redko et al. 2007).
Понимание молекулярных основ связывания и активности RNase Z и CCA ингибирования помогло получить обширные структурные данные (de la Sierra-Gallay et al. 2005; Ishii et al. 2005, 2007; Kostelecky et al. 2006; Li de la Sierra-Gallay et al. 2006), а также биохим. данные. Из структуры ко-кристаллов (Li de la Sierra-Gallay et al. 2006), доказано, что tRNA субстрат связывает одну субъединицу и расщепляется с помощью др. субъединицы, белок которых связывает tRNA посредством многочисленных контактов в остове tRNA и что D-stem и anticodon stem в основном лишены контактов, это согласуется с биохим. данными, что эти регионы не важны для активности (Nashimoto et al. 1999a). Из моделирования и биохим. данных становится ясно, что 3' trailer связывается посредством выходного туннеля, который предотвращает спаривание оснований (Nashimoto et al. 1999b; de la Sierra-Gallay et al. 2005; Redko et al. 2007) и что anti-determinant функция CCA конца RNase Z обеспечивается петлей между нитями β1 и β2 и гибким плечом, также наз. exosite (de la Sierra-Gallay et al. 2005; Redko et al. 2007; Minagawa et al. 2008).
CCA конец не ведет себя универсально как anti-determinant (Schiffer et al. 2003; Minagawa et al. 2004). Напр., энзим RNase Z у Thermotoga maritima выбирает свой сайт расщепления, исходя из присутствия или отсутствия CCA последовательности; 45 tRNAs с закодированной CCA последовательностью расщепляются после A76, тогда как одинокие tRNA без закодированной CCA последовательности расщепляются по N75 (Minagawa et al. 2004).
Имеется несколько дополнительных интересных аспектов функции RNase Z in vivo. Несмотря на хорошо известную выдающуюся роль созревания tRNA 3' конца, всё ещё неясно, как ген оказывается сцеплен с повышенным риском рака простаты (Tavtigian et al. 2001). Также неясно, какой из субстратов RNase Z имеется in vivo, т.к. энзим может участвовать в процессинге 5' 5S HYR in vitro у Halferax volcanii (Holzle et al. 2008) и участвует в обороте некоторых мРНК in vivo у E. coli (Perwez and Kushner 2006), это согласуется с известной биохим. активностью E. coli RNase Z энзима на неструктуированных РНК (HS Shibata et al. 2006). Многочисленные различающиеся субстраты могут частично объяснить присутствие 4-х Arabidopsis RNase Z гомологов-включая один, обнаруженный как в ядре, так и митохондриях, один, обнаруженный только в митохондриях, один обнаруженный в цитоплазме-и важный гомолог, обнаруженный в хлоропласте (Canino et al. 2009). Splicing endonuclease structure and connection to disease Некоторые результаты последних лет пролили свет на компоненты и механизмы сплайсинга tRNA, на медицинское значение сплайсинга tRNA и на др. использование и взаимодействия компонентов сплайсинга tRNA. Становится ясным из анализа многих секвенированных геномов, что хотя интроны появляются лишь в меньшинстве генов tRNA, они обнаруживаются у всех секвенированных эукариот и archaea, а сплайсинг является существенным (или почти необходимым) у всех этих организмов, исходя из присутствия, по крайней мере, одного семейства генов tRNA у каждого организма, в котором все или почти все гены tRNA имеют интроны (Genomic tRNA Database, http://gtrnadb.ucsc.edu). Поскольку эукариотические интроны tRNA постоянно обнаруживаются между нуклеотидами 37 и 38 tRNAs и большинство часто обнаруживается в этом положении у archaea, но archaeal tRNA интроны обнаруживаются также в 14 др. позициях вдоль молекулы tRNA (Marck and Grosjean 2003), все они обладают версиями свойств мотива bulge-helix-bulge, идентифицированного несколько лет тому назад, представленного 4-base-pair (bp) спиралью, окруженной с каждой из сторон 3-nucleotide (nt) вздутиями и сопровождающие спираль (Thompson and Daniels 1990; Marck and Grosjean 2003).
Сплайсинг tRNA на первый взгляд проще, чем более распространенный spliceosome-обусловленный сплайсинг мРНК, поскольку он использует только ограниченное количество белков, каждый выполняет определенную реакцию (Fig. 2). У всех организмов сплайсинг tRNA инициируется с помощью эндонуклеазы, которая вырезает интрон, удаляет 5' половинку молекулы tRNA, заканчивающуюся 2'-3' циклическим фосфатом и 3' tRNA пол-молекулы, начинающуюся с 5'-OH группы (Peebles et al. 1983). У дрожжей эндонуклеаза имеет 4 различных субъединицы (Table 1), включая две родственные субъединицы (Sen2 и Sen34) с каталитической активностью (Trotta et al. 1997), тогда как у archaea эндонуклеаза часто представлена меньшим числом субъединиц с α2, α2β2, или α4 конфигурациями (see Xue et al. 2006).
Figure 2. tRNA splicing and ligation pathways. tRNA is shown in its usual secondary structure, with the antidocodon indicated by red circles, and the intron after residue 37 indicated by blue circles. The endonuclease (comprised of Sen2, Sen15, Sen34, and Sen54 in yeast) excises the intron by cleaving the pre-tRNA at each exon/intron border, leaving tRNA half-molecules with a 2'-3' cyclic phosphate (indicated by a triangle with a white circle containing the phosphate) and a 5'-OH group at their ends. In yeast and plants, the ligase (Trl1 in yeast) RNA 5' kinase activity phosphorylates the 5'-OH end of the 3' half-molecule (black circle), and the ligase cyclic phosphodiesterase activity opens the 2'-3' cyclic phosphate to a 2' phosphate. Then ligase joins the half-molecules (after activation of the 5' phosphate, which is not shown), using the 5' phosphate (black circle) as the junction phosphate, and leaving the 2' phosphate at the splice junction (white circle). This 2' phosphate is subsequently transferred to NAD by the 2' phosphotransferase (Tpt1 in yeast). The yeast-like ligation pathway is also found in vertebrates, but, in vertebrates and some archaea, the predominant vertebrate ligase directly joins the phosphate of the 2'-3' cyclic phosphate (white circle) to the 3' half-molecule. Новая структурная информация представила четкую картину гомодимерной эндонуклеазы и её активного сайта. Структура эндонуклеазы в комплексе с модельным субстратом (Xue et al. 2006) демонстрирует, что все 3 nt каждого выпячивания из РНК субстрата вспучиваются (flipped out) из своих stacking позиций. Более того, каждое выпячивание РНК связывается с помощью аминокислотных остатков соседней субъединицы эндонуклеазы, а также с помощью R280 и R302 из др. субъединицы, как часть сложного активного сайта (Xue et al. 2006). Составня природа актинового сайта была четко задокументирована биохимически с дрожжевым энзимом (Trotta et al. 2006). Структура также чётко показывает каталитическую триаду с Y246, позиционируемую для атаки 2'-OH, с H257, доступным для protonate 5'-O- leaving группы, и с K287, стабилизирующим негативный заряд переходного состояния, хотя ни один из этих остатков, по-видимому, не является абсолютно необходим для активности (Calvin et al. 2008).
Интересно, что недавние результаты продемонстрировали, что мутации в специфических субъединицах tRNA splicing эндонуклеаз ассоциируют с двумя субтипами нейродегенеративной болезни pontocerebellar гипоплазии. У большинства страдающих индивидов субъединица Sen54 эндонуклеазы мутантна в регионе, который законсервирован у млекопитающих (но не у низших эукариот). У двух др. индивидов имеются отклонения в их строго законсервированной аминокислоте субъединицы Sen2 или в позиции субъединицы Sen34, которая высоко консервативна у млекопитающих (Budde et al. 2008). Несмотря на находки, что pontocerebellar гипоплазия ассоциирована с мутациями в любой из трех разных субъединиц эндонуклеазы действительно прямо указывают на связь между эндонуклеазным комплексом и болезнью, остается определить в точности, как эти мутации осуществляют свой эффект на эндонуклеазную функцию. Partial resolution of the ligation pathway in vertebrates Давно стоящая нерешенная проблема сплайсинга tRNA связана с природой и качественными особенностями лигазы, которая катализирует вторую ступень сплайсинга tRNA у позвоночных (Fig. 2). У дрожжей и растений лигация нуждается в циклической phosphodiesterase, чтобы гидролизовать 2'-3' циклический фосфат на 5' половинке молекулы и генерировать 2' фосфат, в РНК киназе, чтобы фосфорилировать 5'-OH 3' половинки молекулы и в лигазе, чтобы соединить половинки молекулы после аденилирования 5'-P конца (Greer et al. 1983). Единственный дрожжевой белок, Trl1 (Phizicky et al. 1986), который важен для сплайсинга tRNA in vivo (Phizicky et al. 1992), катализирует все 4 эти активности. Trl1 также катализирует ступень лигации неконвенционного tRNA-подобного сплайсинга дрожжевой HAC1 мРНК, который необходим для реакции неупакованного белка и инициируется с помощью эксцизии HAC1 интрона с помощью эндонуклеазы Ire1 (Sidrauski et al. 1996; Sidrauski and Walter 1997). Возникающая в результате соединенная РНК или в результате сплайсинга tRNA или HAC1 мРНК обнаруживают в splice соединении 2' фосфат, который, в случае tRNA, постепенно переносится на NAD с помощью 2' phosphotransferase Tpt1, чтобы сформировать ADP-ribose 1?-2' циклический фосфат (Culver et al. 1993; Spinelli et al. 1997).
В противоположность дрожжам и растениям позвончные, по-видимому, обладают двумя путями лигации tRNA. Классический путь лигации у позвоночных связан с "vertebrate" лигазной активностью, которая непосредственно соединяет половинки молекулы tRNA in vitro, используя фосфат из 2'-3' циклического фосфата, как фосфат соединения (Nishikura and De Robertis 1981; Filipowicz and Shatkin 1983; Laski et al. 1983). Кроме того, позвоночные имеют второй, подобный дрожжевому ligase/2' phosphotransferase пути, т.к. обе эти активности обнаруживаются в экстрактах HeLa (Zillmann et al. 1991, 1992), а 2' phosphotransferase млекопитающих, как известно, функциональна у дрожжей (Spinelli et al. 1998). Более того, млекопитающие обладают неконвенциональным tRNA-подобным сплайсингом их HAC1 мРНК ортолога (XBP1) во время реакции неупакованного белка (Yoshida et al. 2001; Calfon et al. 2002). Поэтому неясно, какой путь лигации используется в какой реакции.
Некоторые недавние результаты говорят в пользу вовлечения пути лигации, подобного для сплайсинга tRNA позвоночных. Так, Clp1 белок человека, как было установлено, обладает РНК 5' киназной активностью, а siRNA эксперименты в клетках млекопитающих выявили участие Clp1 в сплайсинге tRNA (Weitzer and Martinez 2007). Эта находка согласуется с дрожже-подобным путем ligase/2' phosphotransferase, поскольку этот путь нуждается в RNA 5' киназной активности. Кроме того, предыдущие результаты показали, что Clp1 очищается совместно с tRNA сплайсинг эндонуклеазой человека (Paushkin et al. 2004), хотя, как известно, участвует в расщеплении и полиаденилировании мРНК. Т.о., вполне возможно, что сплайсинг в клетках позвоночных нуждается в пути лигации, сходном с таковым у дрожжей.
Однако сегодня кажется наиболее вероятным, что путь лигации подобный дрожжевому не нужен мышам для слайсинга tRNA или реакции на отсутствие упаковки, т.к. линия мышей, лишенная гена 2' phosphotransferase, полностью функциональна в отношении трансляции мРНК, нуждающейся для декодирования в сплайсинге tRNA, и нормальна в отношении unfolded protein реакции (Harding et al. 2008). Т.о., вполне возможно, что классический путь лигации у позвоночных используется для сплайсинга tRNA и XBP1 мРНК у позвоночных, подобно пути, используемому для сплайсинга tRNA у archaea (Zofallova et al. 2000; Salia et al. 2003). Идентификация лигазы далека от завершения. Baroque tRNA gene organization and tRNA processing Дополнительным сюрпризом явилось открытие двух очень необычно расположенных генов tRNA, которые, по-видимому, используют энзимы процессинга tRNA неожиданным образом. В первом случае, Soll с сотр. (Randau et al. 2005b) установили, что N. equitans генерирует функциональные tRNAs за счет комбинирования отдельных половинок tRNA, которые локализуются в разных частях хромосомы и транскрибируются отдельно (Fig. 3). 5' tRNA транскрипты половинок молекул заканчиваются антикодоновой петлей и затем к ним присоединяется дополнительная последовательность из ~12 nt, которая в точности спаривается с соот. дополнительной последовательностью на 5' конце транскрипта 3' tRNA половинки молекулы (Randau et al. 2005b). Эти спаренные половники затем подвергаются процессингу с помощью N. equitans сплайс-эндонуклеазы и возможно с помощью лигазы (Randau et al. 2005a). Во втором случае, Sekine с сотр. (Soma et al. 2007) установили, что красная водоросль Cyanidioschyzon merolae имеет кругообразно переставленные tRNA гены, в которых 5' конец транскрипта начинается в D-loop, антикодоновой петле, T-stem или T-петле. Возникающие в результате транскрипты последовательно преобразуются, чтобы удалить связывающие последовательности, преимущественно за счет комбинации аппарата сплайсинга, RNase P и RNase Z (Soma et al. 2007).
Figure 3. Formation of mature tRNA from split tRNA genes. In N. equitans, split tRNA genes are transcribed from distant chromsomal loci (indicated by filled and open circles) as half-molecules, each containing additional nucleotides at their 5' or 3' end (blue circles). The additional sequences at the 3' end of the 5' half-molecule occur after nucleotide 37, the usual position of an intron, and pair with the additional 5' sequences of the 3' half-molecule, forming a hybrid intron. Splicing by the endonuclease, followed by ligation and CCA addition, results in formation of the mature tRNA. Эти неожиданные механизмы для получения функциональных РНК за счет необычного использования энзимов преобразования tRNA интригующие, как и законсервированное использование аппарата лигации tRNA для сплайсинга HAC1 (XBP1) мРНК в реакции неупакованного белка (Sidrauski et al. 1996; Sidrauski and Walter 1997; Yoshida et al. 2001; Calfon et al. 2002) и использование RNase P для генерации 3' конца MALAT1 РНК человека (Wilusz et al. 2008). Др. недавним примером гибкости аппарата процессинга tRNA является демонстрация у дрожжей, что соотв. STE2 мРНК, содержащая внедренную интрон-содержащую пре-tRNA, может подвергаться сплайсингу с помощью аппарата сплайсинга tRNA и RNase P, чтобы давать как функциональный Ste2 белок, так и функциональную tRNA (Di Segni et al. 2008). Modification biology takes its place at the translation table Одним из поразительных свойств tRNA у всех организмов является большое количество у них посттранскрипционных модификаций. Всего 92 различные модификации tRNA описаны в RNA Modification Database (http://biochem.ncsu.edu/RNAmods), и касаются 561 секвенированных tRNAs от нескольких отличающихся организмов (Sprinzl and Vassilenko 2005), показывают тем самым, что модификации обнаруживаются в 11.9% остатков, с медианой в 8 модификаций на тип tRNA (Phizicky and Alfonzo 2010). У дрожжей S. cerevisiae, найдено 25 различных модификаций среди 34 секвенированных цитоплазматических типов tRNA (Fig. 1). Эти модификации происходят в 36 различных позициях, в среднем 12.6 модификаций на тип.
В последней декаде засвидетельствован огромный прогресс в идентификации генов и соотв. энзимов, которые необходимы для модификаций, а также для нашего понимания их биохим. и биологической роли. так, у S. cerevisiae, идентифицировано огромное количество генов, которые ответственны за модификации, (Table 1) и огромное количество модификационных генови энзимов идентифицировано у др. организмов (см Modomics database, http://modomics.genesilico.pl).
Большинство из функций этих модификаций только начинает раскрываться и подтверждает три основных правила. Во-первых, многие модификации в или около антикодоновой петли влияют на трансляцию или рост. Напр., линии дрожжей, лишенные I34 нежизнеспособны (Gerber and Keller 1999); линии, лишенные m1G37 или t6A, чрезвычайно болезненны (Bjork et al. 2001; El Yacoubi et al. 2009); линии, лишенные Nm32 и Nm34 или Ψ38 и Ψ39, плохо растут (Lecointe et al. 1998; Pintard et al. 2002); и линии, лишенные i6A37, слегка дефектны по трансляции (Laten et al. 1978; Dihanich et al. 1987). Др. специфические примеры эффектов модификаций вокруг антикодонной петли обсуждаются ниже. Во-вторых, многие модификации в основном теле tRNA затрагивают упаковку и стабильность tRNA. Так, устранение T54 ниже Tm в tRNA с помощью 2°C-6°C в tRNAPhe и tRNAfMet (Davanloo et al. 1979; Sengupta et al. 2000), отсутствие m1A9 в tRNALys человека ведет к образованию альтернативной структуры (Helm et al. 1999), отсутствие 2'-O-метилированных нуклеотидов может дестабилизировать 3' endo форму РНК (Kawai et al. 1992), а отсутствие Ψ может дестабилизировать спирали (Durant and Davis 1999; Newby and Greenbaum 2001). Хотя специфические биологические следствия отсутствия таких модификаций тела tRNA неочевидны, появляются доказательства, будут рассмотрены позднее, указывающие на то, что отсутствие ряда различных модификаций тела может приводить к деградации tRNA с помощью двух разных путей оборота tRNA. В-третьих, некоторые из различных модификаций специфически меняют характеристики tRNA. Так, G-1 из tRNAHis является позитивным детерминантом для HisRS (Rudinger et al. 1994; Nameki et al. 1995), а Ar(p) в позиции 64 является характерным элементом tRNAiMet у дрожжей (Astrom and Bystrom 1994), тогда как m1G37 из tRNAAsp предупреждает неправильное ацилирование с помощью ArgRS у E. coli (Putz et al. 1994), а lysidine в позиции 34 предупреждает неправильное ацилирование tRNAIle с помощью E. coli MetRS (Muramatsu et al. 1988). The Elp complex is revealed as a modification enzyme Очень важным стало открытие центральной роль комплекса Elp в функционировании клеток, связанной с его активностью в модификации tRNA. Комплекс Elp был охарактеризован ранее как комплекс, который совместно очищается с активно удлиняющейся гиперфосфорилированной Pol II (Otero et al. 1999), ацетилирует гистоны H3 и H4 (Wittschieben et al. 1999; Winkler et al. 2002) и взаимодействует с Sec2, чтобы регулировать экзоцитоз (Rahl et al. 2005). Этот комплекс сравним с субкомплексом, содержащим Elp1, Elp2 и Elp3, и др. субкомплексом, содержащим Elp4, Elp5 и Elp6 (Krogan and Greenblatt 2001; Winkler et al. 2001), и ассоциирует с Kti11 и Kti12 (Fichtner et al. 2002, 2003).
Удивительно, имеющиеся доказательства указывают на то. что все фенотипы. ассоциированные с отсутствием Elp комплекса, возникают в результате отсутствия образования mcm5s2U в позиции 34 определенных tRNAs субстратах. Во-первых, было установлено, что все 6 субъединиц комплекса Elp, также как Kti11, Kti12 и Kti13, необходимы для образования mcm5U, mcm5s2U и ncm5U в позиции 34 (Huang et al. 2005). Затем было показано, что Kluyveromyces lactis γ-toxin действует, расщепляя tRNAGlu(UUC), tRNALys(UUU) и tRNAGln(UUG) после U34 (Lu et al. 2005), и что γ-toxin находит эти tRNAs благодаря их mcm5s2U модификации, поскольку резистентность к γ-toxin обеспечивается мутациями в комплексе Elp, KTI11, KTI12 или KTI13 (Jablonowski et al. 2001; Lu et al. 2005). Наконец, было показано, что избыточная продукция tRNAGln(UUG) и tRNALys(UUU) супрессирует все известные фенотипы Elp комплекса, ассоциированные с транскрипцией или экзоцитозом, и что мутация в NCS2, которая приводит к отсутствию модификации s2U тех же самых tRNAs, дает те же самые фенотипы, описанные при отсутствии комплекса Elp (Esberg et al. 2006). Т.о., очеви дно, что эти эффекты на транскрипцию и эндоцитоз являются вторичными следствиями отсутствия mcm5s2U модификаций в этих tRNAs (Esberg et al. 2006). Остается определить, важная потребность в комплексе Elp для передачи сигналов филаментозного роста, также непосредственно обусловлена эффектами на модифицированные tRNAs (Abdullah and Cullen 2009). Также предстоит определить, почему активность комплекса Elp дефектна у мутантов, лишенных Sit4 фосфатазы (критической для хода клеточного цикла и модификации функции Pkc1) (Sutton et al. 1991; Torres et al. 2002), у мутантов, лишенных как Sit4-ассоциированных белков (Sap185 and Sap190),так и у мутантов, лишенных Kti14 протеин киназы (Mehlgarten and Schaffrath 2003; Jablonowski et al. 2004; Huang et al. 2008).
Функция Elp комплекса в модификации tRNA и значение mcm5s2U модификации законсервированы у метазоа. Напр., у Caenorhabditis elegans, ортолог ELP1 также необходим для формирования mcm5 доли mcm5s2U и ncm5U (Chen et al. 2009), а TUC1 ортолог (Bjork et al. 2007) необходим для формирования s2U доли в mcm5s2U (Chen et al. 2009). Более того, Elp комплекс метазоа основательно ассоциирован с дефектами нейрологической функции. Мутации ортолога ELP1 человека ассоциированы с нейродегенеративной болезнь человека семейной dysautonomia (Anderson et al. 2001; Slaugenhaupt et al. 2001). Сходным образом мутации ортологов C. elegans ELP1 или ELP3 ассоциированы с дефектами salt chemotaxis обучения, а мутации как ELP1 (или ELP3) и TUC1 ортологов приводят к онтогенетическим дефектам (Chen et al. 2009).
Функция декодирования mcm5s2U, mcm5U и ncm5U модификаций недавно была изучена детально в серии множественных делеционных видов, лишенных специфических tRNA генов и/или генов, ответственных за синтез доли mcm5 или s2 (Johansson et al. 2008). Эти исследования установили, что модификация mcm5U важна для считывания G в wobble позиции (wobble G) как для tRNAs с этой модификацией tRNAArg(UCU), так и для tRNAGly(UCC), исходя из роста соотв. линии, лишенной tRNA с C34. Они также установили, что модификация mcm5s2U важна для считывания wobble A и в контексте tRNAGln(UUG), также помогает считыванию wobble G (но недостаточна, чтобы позволить расти нокаутам по соот. tRNA с C34). Сходные эксперименты показали, что ncm5 доля важна для считывания wobble G остатка для tRNAVal(UAC), tRNASer(UGA)и tRNAThr(UGU), и что tRNAPro(UGG) может декодировать кодоны, заканчивающиеся всеми 4 остатками с или без дольки ncm5U (Johansson et al. 2008), четкое указание на то, что это свойство не нуждается в немодифицированном U. A connection between TRM9 or its mcm5U product and translation of DNA repair genes Недавние эксперименты также выявили важную роль в трансляции Trm9 (Begley et al. 2007), который катализирует превращение cm5U в mcm5U в позиции 34 субстратных tRNAs (Kalhor and Clarke 2003). Мутанты trm9-Δ чувствительны к paromomycin, указывают не некоторый дефект трансляции, который связан с местом функционирования рибосомы A (Kalhor and Clarke 2003). Анализ экспрессии (Begley et al. 2007) указывает на то, что trm9 мутанты дефектны по считыванию arginine AGA кодонов, а также glutamate GAA кодонов, которые считываются с помощью tRNAs с mcm5 долей, а также arginine AGG кодонов, которые считываются как с помощью tRNA с точно совпадающим антикодоном, так и tRNA с mcm5 долей (Johansson et al. 2008). Т.к. trm9 мутанты обнаруживают пониженные количества Rnr1, Rnr3 и Yef3 белков, каждый из которых обеспечивает избыточную презентацию GAA и AGA кодонов, а чувствительность trm9 мутантов к ДНК-повреждающим воздействиям может быть преодолена за счет избыточной экспрессии RNR1 или RNR3, эти результаты указывают на то, что отсутствие Trm9 и/или его mcm5U продукта вызывает эти фенотипы (Begley et al. 2007). В соответствии с этим объяснением, недавние результаты показали, что истощение человеческого гомолога Trm9 ABH8 уменьшает количество mcm5U в tRNA, и ведет к усилению чувствительности к ДНК-повреждающим воздействиям (Fu et al. 2010). Поскольку Trm9, , по-видимому, не оказывает существенного эффекта на рост линий, нуждщающихся в tRNAArg(UCU), чтобы считывать AGG кодоны, или в tRNAGly(UCC), чтобы считывать GGG кодоны, то каждая из этих tRNAs имеет mcm5U долю (Johansson et al. 2008), точные эффекты Trm9 на трансляцию могут быть специфическими для определенных кодонов или tRNAs. Интересно отметить также, что замалчивание ABH8 человека также ведет к апоптозу линий urothelial carcinoma и к подавлению NOX-1-зависимых реактивных видов кислорода, а также к супрессии ангиогенеза и инвазии (Shimada et al. 2009). Поскольку ABH8 не обладает активностью деметилазы (Fu et al. 2010), то эти эффекты могут быть также обусловлены отсутствием mcm5U доли в tRNAs. Formation and function of s2U revealed Др. критической модификацией антикодона является s2U, которая универсально обнаруживается в U34 tRNA видов. которые также имеют U35 (Bjork et al. 2007). Ранние эксперименты на E. coli продемонстрировали, что thiolation необходима IscS , чтобы перенести серу с цистеина, чтобы сформировать persulfide, который переносится на MnmA, чтобы катализировать 2-thiouridylation субстратных tRNAs (Kambampati and Lauhon 2003). Затем анализ рибонуклеома E. coli Suzuki с сотр. (Ikeuchi et al. 2006) привел к идентификации 5 др. генов, участвующих в этом пути, обозначенных с tusA по tusE, а эксперименты по реконструкции с очищенными белками показали, что включение всех компонентов стимулирует биохимическую реакцию в 100 крат. Thiolation сопровождается переносом серы с IscS на TusA, это сопровождается переносом серы на TusD из TusB-TusC-TusD комплекса и возможно на TusE, который образует комплекс с MnmA и tRNA (Ikeuchi et al. 2006). У дрожжей путь модификации s2U, по-видимому, необходим для приобретения нескольких сходных компонентов и сходного набора реакций с использованием Urm1 и Uba4, которые также участвуют в urmylation белков (Nakai et al. 2004, 2007, 2008; Huang et al. 2008; Schlieker et al. 2008; Leidel et al. 2009; Noma et al. 2009). Критическая роль s2U доли очевидна, т.к. мутанты, лишенные генов конца пути, растут плохо, это согласуется с почти универсальной консервацией этой модификации в tRNAs с U34 и U35 (Bjork et al. 2007).
Функция s2U заключается в декодировании скорее, чем в предупреждении неправильного считывания, поскольку избыточная продукция немодифицированных генов, кодирующих tRNAs с s2U может преодолевать летальность, вызываемую тотальным отсутствием mcm5s2U у elp3 tuc1 двойных мутантов (Bjork et al. 2007). Удивительно, хотя tRNALys(UUU), tRNAGln(UUG) и tRNAGlu(UUC) все имеют mcm5s2U, только избыточная экспрессия tRNALys(UUU) необходима для супрессии летального фенотипа elp3 tuc1 линии (Bjork et al. 2007). Модификация s2U также, по-видимому, имеет целью декодирование wobble G кодонов (Johansson et al. 2008). Это верно и для митохондрий, поскольку Tarassov с сотр. (Kamenski et al. 2007) показали, что пониженное образование s2U доли из cmnm5s2U34 у tRNALys(UUU) нарушает трансляцию двух митохондриальных белков с AAG кодонами в линии, неспособной импортировать tRNALys(CUU), это предоставляет строгое доказательство того, что давно известный импорт tRNALys(CUU) (Martin et al. 1979) необходим при высокой температуре для трансляции этих кодонов. Formation and function of wybutosine revealed В конце концов, многие из деталей мистической модификации wybutosine (Wye base, yW) были установлены. Wybutosine (или его hydroxy производное, peroxywybutosine) является сложной модификацией основания guanosine, которая обнаруживается исключительно в основании 37 tRNAPhe у большинства, если не у всех, эукариот, а др. сходное семейство производных wyosine широко распространено в archaeal tRNAPhe видах (Waas et al. 2005; de Crecy-Lagard et al. 2010). Wybutosine интересен, поскольку его необычная структура (которая содержит дополнительное imidazole кольцо, которое слито с guanosine кольцом, к которому присоединена α-amino-α-carboxy-propyl группа methionine, а также некоторые добавочные группы), и из-за сообщений, что редуцированные уровни Wye основания ассоциированы с tRNAPhe в разных опухолевых клетках (Grunberger et al. 1975; Kuchino et al. 1982). Известно, что первая ступень образования основания Wye катализируется с помощью m1G methyltransferase Trm5 (Droogmans and Grosjean 1987; Bjork et al. 2001). Недавняя работа показала, что последующий биосинтез wybutosine использует образование methyl imidazole кольца с помощью Tyw1 (Waas et al. 2005; Noma et al. 2006), это сопровождается добавлением α-amino-α-carboxy-propyl группы methionine с помощью Tyw2 (Kalhor et al. 2005; Noma et al. 2006), и метилированием guanosine N3 с помощью Tyw3 (Noma et al. 2006). Интересно, что последняя ступень образования основания Wye использует как метилирование α-carboxy концевой группы, так и methoxycarboxylation α-amino концевой группы, с включением carbon dioxide, всё это, по-видимому, катализируется с помощью Tyw4 (Noma et al. 2006; Suzuki et al. 2009).
Анализ трансляции показал, что функция основания Wye предупреждается сдвигом рамки считывания -1 (Waas et al. 2007). Это исследование было проведено с использованием производных скользкой последовательности, используемой двунитчатым вирусом SCV-LA (GGGUUUA) , в котором A сайта кодон был изменен с UUA га UUU или UUC. Сдвиг рамки считывания оказывался наиболее выраженным, когда последний кодон был UUU скорее, чем UUC, и прогрессивно снижался по мере всё увеличивающегося образования основания Wye, поскольку сдвиг рамки оказывался в два раза более высоким, чем в норме у мутанта tyw1 , который имеет tRNAPhe с m1G37, и в потора раза выше по сравнению с диким типом у мутанта tyw2, у которого Wye основание имеет промежуточное состояние, в котором только присоединено imidazole кольцо. Эта находка дает очень удовлетворительное объяснение цене и вообще эволюции увеличения модификации в Wye основании, и согласуется с предыдущим анализом по сдвигу рамки in vitro (Carlson et al. 2001). Эти результаты хорошо дополняют раннюю работу Bjork с сотр. (Urbonavicius et al. 2001, 2003), показавшую, что некоторые модификации в антикодонной петле tRNAs у E. coli, Salmonella typhimurium или S. cerevisiae затрагивают +1 сдвиг рамки, но не -1 сдвиг рамки. The conserved G-1 of tRNAHis and novel activities of Thg1, the tRNAHis guanylyltransferase Недавние эксперименты выявили ряд интригующих результатов о дополнительном остатке G-1 tRNAHis. Было показано, что этот дополнительный G-1 обнаруживается только в tRNAHis, так что нет др. типов tRNA (за одним исключением) имеющих какой-либо нуклеотид в этой позиции и что дополнительный G-1 остаток законсервирован с помощью двух очень разных механизмов: у бактерий и некоторых archaea, G-1 кодирует (оппозитный C73) и сохраняется во время процессинга (Orellana et al. 1986), тогда как у эукариот и др. archaea остаток G-1 добавляется после транскрипции (across from A73 and C73, соотв.) с помощью tRNAHis guanylyltransferase (Cooley et al. 1982; Jahn and Pande 1991), кодируемой с помощью важного THG1 гена у дрожжей (Gu et al. 2003). Истощение Thg1 ведет к накоплению незаряженных tRNAHis, лишенных остатка G-1, это согласуется с биохимическими данными, что остаток G-1 и его 5' фосфат важны для активности HisRS (Rudinger et al. 1994; Nameki et al. 1995; Rosen et al. 2006), а также для активации GCN4 пути в результате накопления незаряженных tRNAHis (Gu et al. 2005). Однако неожиданно потеря Thg1 оказалась также ассоциированной с задержкой накопления m5C в C48 и C50, и с локализацией в ядре существенной фракции tRNAHis (Gu et al. 2005).
Недавние результаты продемонстрировали 4 дополнительных неожиданных результата относительно остатка G-1 в tRNAHis и Thg1. Во-первых, Thg1 от дрожжей и человека каким-то образом ассоциирован с ходом клеточного цикла. У дрожжей мутации thg1 вызывают дефекты клеточного цикла в G2/M и Thg1 взаимодействует с Orc2 источником комплекса распознавания (Rice et al. 2005), тогда как Thg1 человека регулируется в заисимости от клеточного цикла и его нокдаун ассоциирован с дефектом клеточной пролиферации и с началом polynucleate клеток (Guo et al. 2004).
Во-вторых, tRNAHis из clade α-proteobacteria, включая Sinorhizobium meliloti, как было установлено, лишена G-1 остатка, и обладает HisRS видами с вариациями, согласующимися с изменениями tRNAHis распознавания, показывая тем самым, что G-1 остаток tRNAHis не может быть необходимым универсально (Wang et al. 2007). Теперь известно, что несмотря на его почти универсальную консервацию у эукариот остаток G-1 в tRNAHis также не абсолютно необходим для роста у эукариот, поскольку линии дрожжей, лишенные Thg1 выживают, хотя и плохо, без остатка G-1, показывая, что tRNAHis и его synthetase продуцированы избыточно (Preston and Phizicky 2010).
В-третьих, показано, что Thg1 обладает некоторым заметным механистическим сходством, но с незначительной явной гомологией с aminoacyl tRNA synthetases, поскольку подобно многим tRNA synthetases, распознавание антикодона необходимо и достаточно для реакции на акцепторном конце и поскольку химические ступени аденилирования 5' фосфата в tRNA и последующий перенос guanylyl во время добавления G-1 механистически сходны с образованием aminoacyl adenylate и последующим tRNA acyltransfer во время зарядки с помощью tRNA synthetases (Jackman and Phizicky 2006a).
В-четвертых, показано, что Thg1 обладает самостоятельной 3'-5' template-зависимой полимеразной активностью, с помощью которой добавляются множественные нуклеотиды guanine или cytidine (or deoxynucleotides) к 5' концам соотв. видов tRNA, формируя тем самым множественные phosphodiester мостики в направлении, противоположном тому, что для всех известных полимераз (Jackman and Phizicky 2006b). Хотя функция этой необычной 3'-5' template-зависимой полимеразной активности пока неизвестна, она может выполнять функцию репарации, сходную с той, что механистически сходна, но неопознана, с активностью редактирования, которая репарирует несоответствия (mismatches) на 5' конце видов tRNA в митохондриях Acanthamoeba castellani (Price and Gray 1999). Недавние результаты Jackman с сотр. (Abad et al. 2010) показали, что archaeal Thg1 гомологи обладают template-зависимой активностью добавлять uridine и guanidine нуклеотиды с A73 и C73, соотв., но не активностью добавления G-1 across from A73. Этот результат вместе с наблюдением, что некоторые archaea имеют как закодированный G-1 остаток в своих tRNAHis генах, так и Thg1 гомолог, указывает на то, что template-зависимая активность добавлять 3'-5' нуклеотиды является исходной функцией белков семейства Thg1 и что известная роль Thg1 в добавлении G-1 across from A73 оказалась более новой функцией (Abad et al. 2010). Несмотря на это существенная роль Thg1 у дрожжей в её активности добавлять в tRNAHis G-1, хотя 3'-5' template-зависимая полимеризация наблюдается in vivo с субстратными tRNAHis видами, несущими C73 (Preston and Phizicky 2010). Unexpected deamination promiscuity in editing of tRNA Две др. находки подтверждают расширение роли и функции РНК-редактирующих белков в функции tRNA. Во-первых, недавние доказательства подтвердили, что Trypanosoma brucei adenosine deaminase комплекс ADAT2/ADAT3 может катализировать как A-to-I редактирование wobble аденозина из tRNAThr(AGU), так и C-to-U редактирование ssDNA (Rubio et al. 2007). Т.к. мутации активного сайта ADAT2 устраняют как A-to-I редактирование tRNA, так и C-to-U редактирование ДНК, поскольку не предупреждают образование комплекса, то кажется высоко вероятным, что одиночный активный сайт содержит обе активности. Более того, по крайней мере in vivo, этот же самый белок, по-видимому, ответственен как за C-to-U редактирование, которое касается остатка 32 в tRNAThr так и A-to-I редактирование, которое происходит в остатке 34 (Rubio et al. 2006). Эти находки подчеркивают общее эволюционное происхождение обоих классов этих активностей редактирования и подтверждают возможность, что обе активности редактирования при процессинге tRNA происходят из одной активности (Rubio et al. 2007). Во-вторых, др. недавний результат демонстрирует, что tRNAs из Methanopyrus kandleri обнаруживают разнородное редактирование своих tRNAs по C8, чтобы сформировать U8 в этой позиции, которая важна для поддержания высоко консервативной U8:A14 reverse Hoogsteen пары третичных оснований (Randau et al. 2009). tRNA turnover as a quality control mechanism Появляющиеся результаты бросили вызов широко распространенному мнению, что биосинтез tRNA неизбежно ведет к продукции tRNAs, которые фактически бесконечно стабильны. период полу-жизни tRNA в самом деле очень продолжителен, 50 ч в мышцах кур (Nwagwu and Nana 1980), 3 дня в печени птиц (Kanerva and Maenpaa 1981) и 44 ч у Euglena gracilis (Karnahl and Wasternack 1992), приблизительно сравним с периодом полу-жизни рРНК (Nwagwu and Nana 1980; Karnahl and Wasternack 1992). Однако экспериментальные результаты последних лет привели к открытию и характеристике двух путей, с помощью которых tRNAs заменяются в клетки как часть механизма за контролем качества, который отслеживает целостность tRNA во время и после их биогенеза (Fig. 4). 
Figure 4. Two different tRNA degradation pathways in yeast. pre-tRNA transcribed in the nucleus is processed (black arrows) in the nucleus and the cytoplasm (steps 1) to remove the 5' leader and 3' trailer (purple circles), to add CCA to the 3' end (blue circles), to remove the intron if present (not shown), and to add modifications [pink circles, as for tRNAVal(AAC)], ultimately emerging in the cytoplasm for translation (step 2). If m1A58 is not added to pre-tRNAiMet (absence of m1A indicated by black circle), this pre-tRNA is degraded by the nucelar surveillance pathway (step 3, red arrow) in which the pre-tRNA is first polyadenylated by the TRAMP complex, and then degraded from the 3' end by the nuclear exosome. If m7G46 and m5C49 are not added to tRNAVal(AAC) (black circles), the hypomodified mature tRNA is at least partially functional, but is degraded by the RTD pathway (red arrows), by Xrn1 in the cytoplasm (step 4), or by Rat1 in the nucleus (step 6), possibly after nuclear import (step 5). (Step 7) The elevated presence of pAp in met22 mutants inhibits the RTD pathway by inhibiting both Xrn1 and Rat1. Nuclear surveillance of pre-tRNA and degradation from the 3' end Anderson с сотр. (Kadaba et al. 2004, 2006) показали существование пути, который отслеживает качество pre-tRNA во время биогенеза tRNA. Предварительные работы показали, что Trm6/Trm61 (Gcd10/Gcd14) является methyltransferase, которая катализирует образование m1A58 в tRNA (Anderson et al. 2000), что чувствительные к температуре trm6ts мутанты могут быть супрессированы с помощью больших количеств инициатора tRNA в высоко-копийных плазмидах и что trm6ts мутанты обнаруживали повышенный оборот вновь синтезированной tRNAiMet, но не elongator tRNAMet (Anderson et al. 1998). Идентификация и анализ trm6ts супрессоров привел к установлению пути ядерного надзора за оборотом, с помощью которого ядерные pre-tRNAiMet, лишенные m1A58, становились объектом полиаденилирования с помощью Trf4 из комплекса TRAMP, а затем деградировали с помощью Rrp6 и ядерных экзосом (Kadaba et al. 2004, 2006). Др. эксперименты показали, что избыточная экспрессия poly(A) polymerase Trf5 может замещать отсутствие Trf4 в пути ядерного надзора (Kadaba et al. 2006), и что мутанты с дефектом в АТФ-зависимой активности RNA helicase Mtr4 предупреждают деградацию pre-tRNAiMet, но не мешают её образованию из TRAMP комплекса или полиаденилированию pre-tRNA (Wang et al. 2008).
Две линии доказательств показали, что 3'-5' exonuclease Rex1 играет важную роль в пути ядерного надзора. Во-первых, rex1 trm6 мутанты обнаруживают синтетический фенотип роста, который ассоциирует с полиаденилированием тех pre-tRNAiMet видов и pre-tRNAVal(CAC) видов, которые имеют более длиные 3' trailers, и обнаруживают димерные tRNAArg-tRNAAsp транскрипты (Ozanick et al. 2009). Во-вторых, Wolin с сотр. (Copela et al. 2008) показали, что не подвергшиеся сплайсингу pre-tRNA виды являются предметом пути ядерного надзора, гл не у rex1 мутантов, указывая тем самым, что Rex1 функция может генерировать эти pre-tRNA деградационные субстраты, а дальнейшие эксперименты подтвердили, что Rex1 конкурирует с La (Lhp1) белком за эти 3' концы.
Полная степень использования La белка в ядерном надзоре и/или в др. путях оборота tRNA пока неизвестна, но он, скорее всего, играет некоторую роль, поскольку избыточная экспрессия La белка может также супрессировать мутантов trm6ts (Anderson et al. 1998). La белок действует путем связывания UUU-OH последовательности на конце или транскриптов pre-tRNA (see Maraia and Bayfield 2006; Teplova et al. 2006 and references therein) благодаря использоанию двух сайтов (Bayfield and Maraia 2009), обладает активностью RNA шаперона (Chakshusmathi et al. 2003), и, по-видимому, защищает РНК от Rrp6 из пути ядерного надзора у Schizosaccharomyces pombe (Huang et al. 2006). Однако, La также защищает РНК независимо от Rrp6, указывая, что он участвует в др. пути оборота (turnover) (Huang et al. 2006).
Детальные и элегантные биохим. эксперименты подтвердили предположение, что TRAMP комплекс сотрудничает с ядерными экзосомами, чтобы полиаденилировать субстраты из tRNAs и деградировать их с 3' конца (LaCava et al. 2005; Vanacova et al. 2005), и показали, что эта активность действует на pre-tRNA транскрипты (LaCava et al. 2005); на немодифицированные tRNAiMet транскрипты, но не на их полностью модифицированные производные (Vanacova et al. 2005); на tRNAAla вариант со структурным дефектом, но не на немодифицированную дикого типа tRNAAla (Vanacova et al. 2005); и на tRNAiMet, лишенную только m1A58, но не на др. tRNA субстраты (Schneider et al. 2007). Rapid tRNA decay (RTD) of mature tRNA from the 5' end Др. эксперименты показали, что зрелые tRNAs также подвержены обороту. Так, trm8 trm4 мутанты, лишенные m7G и m5C в их tRNAs, являются чувствительными к температуре из-за специфической деградации tRNAVal(AAC) с помощью RTD пути, который отличается от пути ядерного надзора, который действует на pre-tRNAiMet, лишенную m1A58 (Alexandrov et al. 2006). Этот RTD путь, по-видимому, общий, поскольку несколько разных видов tRNA, лишенные разных комбинаций модификаций, оказываются предметом деградации с помощью этого пути (Chernyakov et al. 2008). Более того, деградация происходит на уровне зрелых tRNA скорее, чем pre-tRNA, поскольку клетки, обработанные ингибитором транскрипции thiolutin, подвергаются деградации с той же скоростью и деградируют все tRNA из субстратных типов (Chernyakov et al. 2008). Генетический анализ показывает, что деградация tRNA с помощью пути RTD катализируется с помощью 5'-3' экзонуклеаз Rat1 и Xrn1 и нуждается в энзиме биосинтеза methionine Met22 (Chernyakov et al. 2008), скорее всего, т.к. её субстрат, pAp, накапливается у met22 мутантов (Murguia et al. 1996) и ингибирует Rat1 и Xrn1 (Dichtl et al. 1997). Интересно, что субстратом для RTD пути может быть aminoacylated tRNA, поскольку деградация tRNA сопровождается селективной потерей aminoacylated фракции популяции tRNAVal(AAC) (Alexandrov et al. 2006) и поскольку мутации в MET22 или RAT1 и XRN1, которые предупреждают деградацию, также восстанавливают фракцию заряженных tRNA (Chernyakov et al. 2008). Пока неизвестно, участвует ли и до какой степени аппарат трансляции в этом пути; почему специфические гипомодифицированные tRNA субстраты отбираются для деградации этим путем, тогда как др. tRNAs, лишенные тех же самых модификаций, остаются; неизвестна и степень, с которой этот путь действует на др. типы дефектных tRNAs. tRNA cleavage pathways activated by stress and other growth conditions, and signaling by tRNA fragments Серия исследований последних лет детализировала существование ранее неизвестного пути, который появляется у разных организмов при специфических условиях роста и вызывает расщепление tRNA в области петли антикодона (rev. Thompson and Parker 2009b). Так, Collins с сотр. (Lee and Collins 2005) показали, что голодание Tetrahymena thermophila вызывает расщепление больших количеств разных tRNAs, которые произошли из макроядра, но не из митохондрий. Расщепление tRNA происходит по разным позициям в и вокруг петли антикодона и иногда в разных плечах, по-видимому, находит tRNAs, которые модифицированы, но лишены своего CCA конца, является в количественном отношении минорным и, по-видимому, нуждается в трансляции (Lee and Collins 2005). Эксперименты на дрожжах продемонстрировали, что сходное расщепление множественных видов tRNA происходит в клетках, подвергшихся оксидативным стрессам, голоданию по methionine, растянутому росту в стационарной фазе и росту при высокой температуре, но не в клетках, подвергнутых ultraviolet (UV) стрессу, азотному голоданию или глюкозному голоданию (Thompson et al. 2008). Более того, сходное расщепление наблюдается у Arabidopsis thaliana и в клетках людей, подвергнутых оксидативным стрессам (Thompson et al. 2008; Fu et al. 2009; Yamasaki et al. 2009), aа также у Streptomyces coelicolor (Haiser et al. 2008) и у некоторых др. организмов, обычно в условиях голодания или др. условиях, вызывающих онтогенетические изменения (see Thompson and Parker 2009b and references therein). Последующие эксперименты показали, что этот путь обеспечивается с помощью члена семейства RNase T2 Rny1, который перемещается из вакуоли в цитоплазму во время оксидативного стресса и обеспечивает клеточную гибель (Thompson and Parker 2009a). Однако активность, ассоциированная с Rny1, которая обусловливает клеточную гибель, демонстрирует независимость от её расщепляющей активности (Thompson and Parker 2009a). Интересно, что человеческий Rny1 ортолог RNASET2 облдает рядом активностей, сходных с теми, что у дрожжевого Rny1, поскольку экспрессия RNASET2 в дрожжах восстанавливает продукцию фрагментов расщепления tRNA у rny1 мутантных линий и восстанавливает редуцированную жизнеспособность клеток, подвергающихся оксидативному стрессу (Thompson and Parker 2009a), тогда как экспрессия RNASET2 в клетках млекопитающих действует как опухолевый супрессор независимо от его расщепляющей активности (Acquati et al. 2005; Smirnoff et al. 2006).
Продукты расщепления tRNA также генерируются с помощью Dicer-зависимого расщепления. Глубокое секвенирование выявило существование выдающегося генерируемого с помощью Dicer, фрагмента tRNAIle в мышиных эмбриональных стволовых (ES) клетках, который происходит из 3' конца гена и части trailer последовательности, и может возникать благодаря альтернативной упаковке транскриптов tRNA (Babiarz et al. 2008). Кроме того, глубокое секвенирование идентифицировало ряд Dicer-генерируемых 5' tRNA фрагментов в клетках HeLa, которые стремятся образоваться в результате расщепления после остатка 19 в D-loop, и возникают в основном из 4 основных видов tRNA (Cole et al. 2009). Т.к. эти фрагменты РНК, по-видимому, модифицированы по 3' концу и слабо связывают комплексы Argonaute, то они вряд ли действуют как microRNAs (miRNAs); поэтому их функция остается неизвестной. Possible signaling effects of tRNA fragments Два недавних сообщения показали, что продукты расщепление tRNA ингибируют трансляцию. Во-первых, Anderson с сотр. (Yamasaki et al. 2009) показали, что любое из некоторых разных воздействий стрессами активирует в клетках млекопитающих рибонуклеазу angiogenin, чтобы расщепить tRNA и продуцировать tRNA-derived stress-induced RNAs (tiRNAs) , которые ингибируют трансляцию. Angiogenin является мощным ангиогенным фактором, изолированным из среды человеческих клеточных линий или из плазмы (Shapiro et al. 1987), с рибонуклеазной активностью, которая важна для его ангиогенной активности (Shapiro and Vallee 1987). Удивительно, 5' tiRNAs продуцируемые с помощью angiogenin, оказывают разные ингибирующие эффекты на клеточный рост, поскольку трансфекция с помощью 5' tiRNA фрагментов, но не 3' tiRNA фрагментов, вызывает арест трансляции, независимый от фосфорилирования eIF2α (Yamasaki et al. 2009) посредством образования стрессовых гранул (Emara et al. 2010). Во-вторых, pumpkin сок флоэмы, как было установлено, содержит tRNA фрагменты от нескольких tRNAs, которые расщепляются или в антикодонной петле или D-loop, и которые, по-видимому, ингибируют трансляцию, исходя из снижения трансляции в присутствии РНК из сока флоэмы или RNase A-сгенерированных фрагментов дрожжевой tRNA (Zhang et al. 2009). Остается определить, ингибируется ли сходным образом трансляция в др. системах, в которых продуцируются фрагменты tRNA.
Dutta с сотр. (YS Lee et al. 2009) нашли с помощью глубокого секвенирования, что множественные отличающиеся происходящие из фрагменты (tRNA-derived fragments (tRFs)) продуцируются в клеточных линиях из рака простаты, по крайней мере, одна из которых обнаружила мощные эффекты, стимулирующие клеточную пролиферацию. Эти tRFs длиной в 13-26 nt, составляют в целом 40% от non-miRNA последовательностей в этом ранге размеров и происходят из одного из трех точных регионов tRNA: 5' конец зрелой tRNA, 3' конец зрелой tRNA, заканчивающийся CCA последовательностью, или 3' trailer последовательность, начинающаяся непосредственно после 3' конца tRNA. Один из этих tRF видов, tRF-1001, происходит из 3' trailer последовательности специфических tRNASer(UGA) видов и оказывает выраженные эффекты на клеточный рост. tRF-1001 экспрессируется на высоком уровне в ряде различных пролиферирующих линиях раковых клеток и его экспрессия редуцируется после сывороточного голодания или когда плотность клеток высока. Более того, siRNA-обусловленный нокдаун экспрессии tRF-1001 ассоциирует со снижением клеточной пролиферации и клеточная пролиферация восстанавливается с помощью трансфекции синтетического 2'-O-метилированного tRF-1001 РНК олигонуклеотида, который не реагирует на воздействие siRNA. Дальнейшие эксперименты показали, что tRF-1001 формируется за счет действия ELAC2, которая кодирует RNase Z и первоначально была идентифицирована как кандидат на роль рега чувствительности к раку простаты (Tavtigian et al. 2001), и что tRF-1001 (и его pre-tRNA) обнаруживаются почи исключительно в цитоплазме, приводя к предположению, что pre-tRNAs могут подвергаться процессингу или в tRNA в ядре, или в цитоплазме в форму tRF-1001 и родственные типы (YS Lee et al. 2009). Т.к. tRF-1001 не влияет на экспрессию репортера, который д. быть чувствителен к siRNA или miRNA, механизм, с помощью которого он способствует пролиферации клеток предстоит ещё определить. Сходным образом, предстоит определить регулируют ли и до какой степени др. tRFs клеточные функции и как эти tRFs генерируются. Distinct tRNA cleavage pathways as part of host defense mechanisms Эти широко распространенные пути расщепления tRNA отличны от разнообразных tRNA расщепляющих токсинов, которые действуют на специфические наборы tRNAs и в специфических позициях внутри tRNA антикодоновой петли, чтобы сделать неспособными субстратные tRNAs. Наиболее хорошо известен из них это PrrC эндонуклеаза, которая атакует tRNALys виды во время инфекции с помощью фага T4 (Amitsur et al. 1987), но описаны и некоторые др., включая colicins и onconase (for review, see Phizicky 2008). Последним добавлением к этому семейству является γ-toxin из K. lactis, который находит специфические tRNAs у дрожжей S. cerevisiae, которые имеют mcm5s2U модификацию в позиции 34 и расщепляет tRNA путем образования 2'-3' cyclic phosphate (Lu et al. 2005). Shuman с сотр. (Nandakumar et al. 2008) показали, что этот путь расщепления может быть репарирован путем внесения T4 лигазы или киназы или путем экспрессии растительного RNA ligase домена вместе с дрожжевой splicing cyclic phosphodiesterase и киназной активностью, вполне правдоподобно, что любой из путей расщепления, описанных выше, также является предметом репарации РНК. Интересно, что добавление CCA с помощью nucleotidyl transferase также может действовать как часть механизма контроля качества, т.к. tRNAs, которые помечены, не являются эффективными субстратами для энзимов (Dupasquier et al. 2008). Неясно, неясно, что происходит с такими субстратами in vivo, но они могут, в принципе, также репарироваться. Nonconventional uses of tRNA and other signaling pathways using tRNA Хотя обычная функция tRNAs доставлять аминокислоты в аппарат трансляции специфицируется с помощью мРНК кодонов, хорошо известно как у прокариот, так и эукариот, что tRNAs выполняют и многочисленные др. функции. У прокариот, aminoacylated tRNAs служат в качестве доноров для доставки аминокислот, используемых в разнообразных биохимических путях, включая биосинтез peptidoglycan, добавления к липидам, продукцию определенных антибиотиков и доставляя белки на деградацию посредством пути N-end правила (rev. Banerjee et al. 2010; Francklyn and Minajigi 2010). Более того, поскольку прокариотические организмы лишены полного набора aminoacyl-tRNA synthetases, чтобы генерировать все необходимые aminoacylated tRNAs, то существуют механизмы, использующие нераспознанную aminoacyl-tRNAs функцию, чтобы генерировать полный набор необходимых aminoacyl-tRNAs. Напр., Glu-tRNAGln и Asp-tRNAAsn модифицируются в Gln-tRNAGln и Asn-tRNAAsn с помощью amidotransferases (rev. Feng et al. 2004). Наконец, в Gram-позитивных бактериях, tRNAs также функционируют как сенсоры, чтобы регулировать генную экспрессию в ответ на пригодность пищи, как четко демонстрируется с помощью T-box riboswitch механизма; этот tRNA-зависимый процесс использует незаряженные tRNAs, которые взаимодействуют с мРНК лидерной последовательностью, чтобы генерировать anti-termination элементы и тем самым делают возможной полную транскрипцию продуктов гена, участвующих в биосинтезе аминокислот (for review, see Green et al. 2010).
tRNAs также выполняют неконвенционные функции у эукариот. Большинство этих функций отличается от неконвенционных функций tRNAs у прокариот, но, по крайней мере, две роли сходны у прокариот и эукариот. Первая это использование aminoacylated tRNAs в качестве доноров аминокислот для N-терминальной конъюгации аминокислот на белки, находя белки реципиенты для деградации (rev. Varshavsky 1997; Mogk et al. 2007). Вторая связана с ролью незаряженных tRNAs в путях сигнальной трансдукции, чувствительных к истощению питательных веществ. У дрожжей общий путь чувствительности к аминокислотам отвечает на лишение аимнокислот, используя незаряженные tRNAs, которые взаимодействуют с Gcn2, протеин киназой, которая фосфорилирует фактор инициации трансляции eIF2. Фосфорилирование eIF2 с помощью Gcn2 приводит к снижению уровней общей трансляции, но увеличивает трансляцию регулятора транскрипции Gcn4, который в свою очередь вызывает транскрипцию многочисленных генов, участвующих в биосинтезе аминокислот и нуклеотидов (rev. Dever and Hinnebusch 2005). У мышей сходный Gcn2-зависимый процесс происходит, при котором связывание незаряженных tRNAs с Gcn2 ведет к изменению пищевой реакции (Hao et al. 2005; Maurin et al. 2005; rev. Dever and Hinnebusch 2005). Неожиданно путь Gcn4 также включается воздействиями, повреждающими ДНК у дрожжей, который действует посредством передачи сигналов Mec1 и Rad53, чтобы релокализовать Los1 в цитоплазму, вызывая тем самым накопление не сплайсированных tRNA в ядре (Ghavidel et al. 2007). Неизвестно, какой из видов tRNA активирует этот путь, но Gcn4 активируется также в los1-? клетках независимо от Gcn2 (Qiu et al. 2000), так что этот путь реакции на повреждения ДНК, скорее всего, осуществляется тем же самым способом.
Существуют также неконвенционные роли tRNAs, которые неодинаковы у эукариот и прокариот. Напр., tRNAs участвуют в регуляции апоптоза в клетках млекопитающих (Mei et al. 2010). Эти исследования показали, что tRNAs связывают cytochrome c, тем самым предупреждают взаимодействие cytochrome c активатором каспазы Apaf-1 и предупреждают его активацию. Эти результаты открывают новые пути размышления о том, как уровни tRNA в клетках влияют на клеточный рост и онкогенез. Др. специфичной для эукариот неконвенционной функцией tRNAs это использование tRNAs в жизненном цикле ретровирусов. Ретровирусы обладают захваченными tRNAs чтобы служить в качестве праймеров для обратной транскрипции их РНК генома (rev. Marquet et al. 1995) и для переноса HIV-1 minus нити (Piekna-Przybylska et al. 2010 and references therein). HIV также захватывают ретроградный tRNA путь (see below) в качестве одного из механизмов для доставки обратно-транскрибируемого комплекса из цитоплазмы в ядро (Zaitseva et al. 2006). The long and winding cellular road for tRNA biogenesis Довольно неожиданный набор новых механизмов регуляции синтеза tRNA, новая информация о модификациях, новые пути процессинга и оборота tRNA и новые пути расщепления tRNA открывается недавними результатами. В самом деле, как будет описано ниже, широкое распространение генных продуктов, участвующих в транскрипции, процессинге предшественников и ядерном экспорте tRNAs существенно отличается от значительно более локального распределения продуктов генов, функционирующих в аналогичных событиях биогенеза др. РНК. Напр., для продукции мРНК очевидно, что большая часть биохим. аппарата рекрутируется в месте транскрипции; capping, процессинг концов, сплайсинг и компоненты аппарата экспорта рекрутируются в локусы или на мРНК одновременно с транскрипцией (rev. Iglesias and Stutz 2008). Сходным образом, как показывает ЭМ,процессинг пре-рРНК, осуществляется одновременно с транскрипцией (Osheim et al. 2004), а недавнее исследование кинетики метаболически меченных дрожжевых клеток привело к заключению, что при определенном исключении цитоплазматического процессинга 20S pre-rRNA в 18S зрелые rRNA, ступени процессинга эксцизии и модификации продукции рРНК осуществляются одновременно с транскрипцией (Kos and Tollervey 2010). В резком контрасте находится транскрипция и процессинг tRNA, происходящие в нескольких разных субклеточных местах, включая ядрышко, нуклеоплазму, внутреннюю ядерную мембрану (INM), цитоплазму и цитоплазматическую поверхность митохондрий (Fig. 5). 
Figure 5. The cell biology of tRNA biosynthesis and nuclear-cytoplasmic trafficking for intron-containing tRNAs in the yeast S. cerevisiae. tRNA transcription and 5' end-processing occur in the nucleolus. Following 3' end-processing, CCA addition, and various modification steps in the nucleoplasm and at the INM, intron-containing pre-tRNAs are exported to the cytoplasm via the Los1 exportin and at least one unknown pathway. After pre-tRNA splicing on the cytoplasmic surface of mitochondria, additional modifications in the cytoplasm, and aminoacylation, mature charged tRNAs can participate in protein synthesis. Cytoplasmic tRNAs are constitutively imported into nuclei, directly or indirectly, via Mtr10. Re-export of nuclear tRNAs to the cytoplasm is mediated by Los1 and Msn5 and is regulated by nutrient status; likely, Msn5-dependent re-export requires that the tRNA be appropriately structured and aminoacylated in the nucleus. (Green and red circles) Parts of the tRNA that are maintained in the mature structure; (red circles) anticodon; (purple circles) transcribed 5' leader and 3' trailer sequences; (dark-blue circles) intron sequence; (light-blue circles) CCA end; (yellow, orange, and pink circles) various modifications made in the nucleoplasm, at the INM, and in the cytoplasm, respectively; (aa) amino acid. Processing steps are labeled, as are the ?-importin members that function in the nucleus-cytoplasm import and export steps. tRNA transcription in the nucleolus in yeast Хотя хорошо известна выдающаяся роль в транскрипции рРНК процессинга pre-rRNA и сборки рибосом, ядрышко также является местом транскрипции tRNA у дрожжей и процессинга pre-tRNA 5' конца у многочисленных организмов. Геном дрожжей содержит 274 tRNA генов, распределенных случайно среди 16 хромосом. О, как показано с помощью fluorescence in situ hybridization (FISH), гены tRNA рекрутируются в одно околоядерное место-ядрышко-и здесь транскрибируются (Thompson et al. 2003; rev. Hopper et al. 2010; Pai and Engelke 2010). Расположение рассеянных дрожжевых генов tRNA в ядрышке зависит от транскрипции гена tRNA, т.к. дикого типа гены tRNA локализуются в ядрышке ~50% времени, тогда как транскрипционно инактивированные tRNA гены располагаются в ядрышке только ~10% своего времени (Thompson et al. 2003; Hopper et al. 2010). Локализация tRNA генов в ядрышке также зависит от целостности ядрышек, т.к. дисперсия структуры ядрышек ведет к распределению генов tRNA в нуклеоплазме (Thompson et al. 2003; Wang et al. 2005).
Хромосомы конденсирующий комплекс condensin участвует в организации tRNA генов. Condensin ассоциирует физически с tRNA генами, а клетки, условно дефектные по субъединицам condensin, неспособны собирать в кластер tRNA гены в ядрышке (D'Ambrosio et al. 2008; Haeusler et al. 2008). Интересно, что condensin может участвовать в создании совместных кластеров tRNA генов скорее, чем локализовать их в ядрышке per se. Эта идея подтверждается наблюдением, что локализация в ядрышке tRNA генов может быть нарушена обработкой nocodazole, но это воздействие не влияет на сборку в кластеры tRNA генов (Haeusler et al. 2008). Т.о., образование совместных кластеров tRNA генов и локализация кластера в ядрышке, по-видимому, отдельные процессы. Хотя имеется мало доказательств локализации tRNA генов в ядрышке у др. организмов, образование кластеров tRNA может быть законсервированным процессом, т.к. сообщалось, что диспергированные tRNA гены у делящихся дрожжей S. pombe собираются в кластер в ядерном регионе вблизи центромер и что образование кластеров на центромерах зависит от condensin (Iwasaki et al. 2010). Роль образования кластеров и локализации в ядрышке tRNA генов не до конца понятно, но эта организация чётко подавляет транскрипцию близко расположенных мРНК кодируемых генов (Kendall et al. 2000; Wang et al. 2005). tRNA 5' end processing in the nucleolus Процессинг 5' конца обычно первая степень пути процессинга tRNA. RNase P, эндонуклеаза, ответственная за каталитическое удаление 5' лидерной последовательности pre-tRNAs (see above), располагается в ядрышке у дрожжей и в клетках позвоночных, хотя у последних некоторые из субъединиц этого комплекса RNP располагаются также и в др. местах (Bertrand et al. 1998; Jarrous et al. 1999). Поскольку RNase P обладает общими субъединицами с RNase MRP (Chamberlain et al. 1998), сходным RNP, участвующим в процессинге pre-rRNA в ядрышке (Schmitt and Clayton 1993), локализация RNase P в ядрышке может в основном облегчать разделение субъединиц от RNase MRP. Однако, RNase P более склонна осуществлять более непосредственную ядрышковую функцию, поскольку она преобразует у дрожжей интроном кодируемые box C/D snoRNAs, которые необходимы для соотв. процессинга pre-rRNA в ядрышке (Coughlin et al. 2008). tRNA 3' end processing in the nucleoplasm? Процессинг 3' конца pre-tRNAs обычно следует за процессингом 5' конца и катализируется с помощью обеих эндонуклеаз (Rex1 у дрожжей) (Piper and Straby 1989; Copela et al. 2008; Ozanick et al. 2009) и RNase Z эндонуклеазы (Trz1 у дрожжей) (for review, see Vogel et al. 2005). Баланс между эндонуклеотическим и экзонуклеотическим процессингом 3' конца зависит, по крайней мере, от tRNA-связывающего La белка как у низших, так и высших эукариот (Huang et al. 2006; Copela et al. 2008; Zhao et al. 2009). Поскольку имеется, по крайней мере, одна дрожжевая pre-tRNA, в которой процессинг 3' конца предшествует процессингу 5' конца (Kufel and Tollervey 2003), и поскольку некоторые из энзимов, которые участвуют в процессинге 3' pre-tRNA конца, участвуют также в пути процессинга pre-rRNA (e.g., Rex1) (van Hoof et al. 2000), отсюда можно предположить, что процессинг pre-tRNA 3' конца подобно процессингу 5' конца, должен происходить в ядрышке. Однако, по-видимому, этому нет доказательств, т.к. геномный проект по GFP-tagging , осуществленный на дрожжах, показал, что ядерный пул Trz1 и Lhp1 (дрожжевой La) находится преимущественно в нуклеоплазме, не в ядрышке (Huh et al. 2003). Nuclear tRNA modification enzymes reside at various subnuclear locations Некоторые исследования продемонстрировали, что некоторые отличающиеся модификации tRNA происходят в ядре у разных организмов. Исследования на ооцитах Xenopus с использованием плазмид, кодирующих дрожжевую tRNATyr, инъецированных в ядра ооцитов, показали, что некоторые модификации обнаруживаются в инициальных транскриптах tRNA, тогда как др. не обнаруживаются до тех пор, пока tRNAs не созреет окончательно (Melton et al. 1980; Nishikura and De Robertis 1981). Т.к. эти инициальные транскрипты и процессинг промежуточных образований ограничены ядром, то энзимы, катализирующие модификации д. располагаться в ядре. Сходным образом, исследования проведенные на дрожжах с дефектами ядерного экспорта tRNA , показали, что pre-tRNAs содержат те же самые, но не все модификации (Hopper et al. 1978; Knapp et al. 1978; Etcheverry et al. 1979). В согласии с этими находками исследования индивидуальных tRNA модификаций белков, а также геномные GFP-tagging базы данных по дрожжам, демонстрируют, что субнабор модификационных энзимов располагается в ядре и отсутствует в цитоплазматическом пуле (Simos et al. 1996; Huh et al. 2003; for review, see Martin and Hopper 1994). Напр., из 8 pseudouridine synthases, две (Pus1 и Pus7) не появляются в цитоплазматическом пуле, а 5 из 17 белков, участвующих в метилировании tRNA (Trm1, Trm6, Trm8, Trm61, and Trm82), по-видимому, локализованы в ядре.
Удивительно, модификационные энзимы, располагающиеся преимущественно в ядре имеют разное субъядерное распределение и могут быть локализованы в ядрышке, в нуклеоплазме или в INM. Напр., Pus1 довольно случайно распределен по нуклеоплазме (Simos et al. 1996; Huh et al. 2003). Напротив, MOD5-кодирующие изоэнзимы локализуются в митохондриях, цитоплазме и ядре, а ядерный Mod5 концентрируется в ядрышке (Tolerico et al. 1999). Поскольку модификация i6A, катализируемая с помощью Mod5 (Laten et al. 1978; Martin and Hopper 1982), происходит только после удаления интрона (Spinelli et al. 1997; for review, see Grosjean et al. 1997), это происходит в цитоплазме (Yoshihisa et al. 2003, 2007), то роль ядрышкового Mod5 остается неизвестной. Trm1 локализуется в третьем внутриядерном сайте, в INM. Хотя цис-действующие и некоторые транс-действующие факторы, ответственные за распределение Trm1 в ядре и в INM, охарактеризованы (Rose et al. 1992; Murthi and Hopper 2005; Lai et al. 2009), остается неизвестным, почему Trm1 локализуется в ядре и специфически в INM, поскольку предупреждение ядерного импорта Trm1 не мешает ему катализировать модификацию tRNA (Rose et al. 1992). Итак, причины разных распределений в ядре модификационных энзимов для tRNA предстоит выяснить. tRNA modifications catalyzed in the cytoplasm Исследования по инъекции Xenopus, описанные выше, показали также, что некоторые модификации, особенно те, что локализуются в антикодонной петле, появляются только в зрелых tRNAs, и , следовательно, могут катализироваться в цитоплазме (Melton et al. 1980; Nishikura and De Robertis 1981); однако мало сообщений относительно распределения энзимов, модифицирующих tRNA в клетках высших эукариот. У дрожжей многочисленные модификационные белки для tRNA располагаются исключительно в цитоплазме. Для некоторых из них, цитоплазматическая локализация может быть связана с приспособлением к специфичным субстратам. Напр., модификации антикодонов из A37 в i6A, и C32 и G34 в Cm32 и Gm34, соотв., происходят только после удаления интрона (Jiang et al. 1997; Pintard et al. 2002; for review, see Grosjean et al. 1997). Как будет описано ниже удаление интрона у дрожжей ограничено цитоплазмой (Yoshihisa et al. 2003, 2007), энзимы, которые катализируют модификации, которые появляются после сплайсинга, д. быть цитоплазматическими, по крайней мере, у дрожжей. tRNA splicing on the mitochondrial cytoplasmic surface in some, but not all, organisms Вообще-то наиболее курьёзным распределения энзимов биогенеза tRNA является локализация аппарата сплайсинга tRNA у дрожжей. В резком контрасте с ядерной локализацией сплайсинга tRNA у позвоночных (Melton et al. 1980; Lund and Dahlberg 1998; Paushkin et al. 2004), сплайсинг pre-tRNA у дрожжей не происходит в ядре. Как было показано выше, аппарат сплайсинга у дрожжей представлен тремя энзимами: tRNA splicing endonuclease, tRNA ligase (Trl1) и 2' phosphotransferase (Tpt1). Удивительно, что субъединицы tRNA splicing endonuclease локализуются на цитоплазматической поверхности митохондрий (Huh et al. 2003; Yoshihisa et al. 2003, 2007; Shaheen and Hopper 2005). Два др. белка-Trl1 и Tpt1-необходимые для сплайсинга, не исключаются из ядра (Huh et al. 2003; N. Dhungel and AK Hopper, unpubl.). Несмотря на это, после накопления pre-tRNAs в цитоплазме происходит настоящий процессинг промежуточных образований (Yoshihisa et al. 2007), очевидно, что у дрожжей сплайсинг tRNA происходит в цитоплазме, а не в ядре.
Расположение сплайсинга tRNA у растений не совсем выяснено. Экспрессия рекомбинантных генов в гетерологических растениях предоставляет доказательства ядерного пула tRNA splicing endonuclease (Englert et al. 2007), это согласуется с тем, что сплайсинг pre-tRNA у растений происходит в ядре, как и у позвоночных; однако др. генетические исследования показали, что ингибирование ядерного экспорта tRNA ведет к дефектам удаления интрона (Park et al. 2005), что лучше всего объясняется цитоплазматическим расположением сплайсинга pre-tRNA у растений, как и у дрожжей. Необходимы дополнительные исследования для определения локализации сплайсинга tRNA в царстве растений, тем не менее ясно, что имеются разные локализации сплайсинга pre-tRNA у разных организмов. Возможными причинами разных субклеточных распределений энзимов сплайсинга tRNA у эукариот является выбор, базирующийся на др. функциях аппарата сплайсинга (Sidrauski et al. 1996; Sidrauski and Walter 1997; Paushkin et al. 2004) и/или на координации клеточного метаболизма и процессинга pre-tRNA у дрожжей, но не в клетках позвоночных (for review, see Hopper and Shaheen 2008; Hopper et al. 2010). tRNA processes occurring in both the nucleus and the cytoplasm Cca1 addition Хотя все гены E. coli tRNA кодируют соотв. 3'-терминальные CCA нуклеотиды, геном E. coli обладает также CCA nucleotidyl transferase, а его делеция вызывает замедление роста, указывая на важную роль этого энзима в репарации tRNA 3' конца у прокариот (Zhu and Deutscher 1987). Как указывалось выше, все гены эукариотических tRNA лишены, кодируемых CCA и поэтому нуждаются в добавлении CCA в ходе процессинга, а имеющиеся доказательства указывают на то, что эта ступень происходит в ядре. Инъекционные исследования на ооцитах Xenopus чётко документируют, что CCA добавляется к tRNAs прежде их экспорта в цитоплазму (Melton et al. 1980; Nishikura and De Robertis 1981; Lund and Dahlberg 1998), и известно, что добавление CCA к tRNAs необходимо для эффективного экспорта из ядра tRNA в клетках позвоночных (Arts et al. 1998b; Lipowsky et al. 1999). Доказательства также подтверждают роль добавления CCA в ядре у дрожжей, т.к. преобразованные на концах, содержащие интрон, pre-tRNAs располагаются прежде всего в ядре и обладают CCA на своих 3' концах (Wolfe et al. 1996). Тем не менее, помимо ядерного пула имеется также цитоплазматические пулы CCA nucleotidyl transferase как у дрожжей, так и в клетках позвоночных (Solari and Deutscher 1982; Wolfe et al. 1996). Эти цитоплазматические пулы, скорее всего, служат для репарации tRNA 3' концов, аналогично функции подобной активности у прокариот, т.к. перераспределение цитоплазматической CCA nucleotidyl transferase в ядро у дрожжей ведет к накоплению зрелых tRNAs, лишенных 3' CCA нуклеотидов (Wolfe et al. 1994). Т.о., у эукариот, в то время как нуклеоплазматическая CCA nucleotidyl transferase участвует в процессинге tRNA, цитоплазматическая CCA nucleotidyl transferase скорее всего участвует в репарации tRNA конца. RTD turnover pathway Путь оборота RTD также, по-видимому, участвует как в ятдре, так и цитоплазме. Доказательства, подтверждающие тот факт, что гипомодифицированные tRNAs, которые являются предметом для этого пути, неполностью стабилизированы, если или ядерная Rat1 5'-3' exonuclease или ортологичная цитоплазматическая Xrn1 делетированы, но почти полная стабилизация достигается при элиминации как Rat1, так и Xrn1 (Chernyakov et al. 2008). В противоположность пути RTD, путь TRAMP-обеспечиваемого оборота tRNA ограничен ядром (for review, see Houseley et al. 2006). Enzymes shared by more than one subcellular compartment Общей темой для энзимов процессинга tRNA является разделение белков. кодируемых одиночным геном между цитоплазматическим и ядерным компартментами и в митохондриях. Энзим модификации tRNA дрожжей Trm1 является первым примером эукариотических генов, кодирующих сортируемых изоэнзимы-множественные белки, кодируемые одиночными генами, каждый из которых имеет разное субклеточное распределение (Hopper et al. 1982). TRM1 кодирует два белка, отличающихся обладанием 16-аминокислотного N-терминального пептида: Trm1-I, длинная форма, обнаруживается исключительно в митохондриях, а короткая форма , Trm1-II, распределена преимущественно в ядерной INM (Ellis et al. 1989; Li et al. 1989). Сходные механизмы создают разные изоэнзимы для Mod5 и Cca1, давая более длинные формы, располагающиеся в митохондриях и более короткие формы располагающиеся в др. местах клетки (Wolfe et al. 1994; Tolerico et al. 1999; for review, see Martin and Hopper 1994). Хотя информация всё ещё неполная, разделение по компартментам, по-видимому, характерно для энзимов процессинга tRNA у дрожжей. Напр., из 17 известных дрожжевых генов, кодирующих субъединицы nucleoside methyltransferases, ни одна, по-видимому, не кодирует белки, нацеленные только на митохондрии; т.о., для этих модификаций tRNA, которые происходят как в митохондриях, так и ядре закодированных tRNAs, митохондриальные энзимы д. быть закодированы теми же самыми генами, которые кодируют в цитоплазме и/или ядре локализованные энзимы. Сходным образом, 8 генов, участвующих в tRNA pseudouridylation, только два, PUS2 и PUS9, кодируют активности, которые модифицируют только tRNAs, расположенные в митохондриях (Behm-Ansmant et al. 2004, 2007). Механизмы, с помощью которых многочисленные двунаправленные активности распределяются по множественным субклеточным компартментам ещё до конца не установлены.
Разделение по компартментам также обнаруживается среди некоторых aminoacyl-tRNA synthetases. Впервые было показано на дрожжах, что одиночный ген кодирует как цитоплазматическую, так и митохондриальную histidyl-tRNA synthetase (Natsoulis et al. 1986). Сходным образом, митохондриальная и цитоплазматическая alanyl-tRNA, glycyl-tRNA и valyl-tRNA synthetases кодируются одиночными генами (Chatton et al. 1988; Turner et al. 2000; Tang et al. 2004). Остальные дрожжевые митохондриальные и цитоплазматические tRNA synthetases, по-видимому, кодируются разными генами. У растений существует сходная ситуация; митохондриальная и хлоропластная tRNA synthetases кодируются одним геном и имеются множественные примеры одиночных генов. кодирующих как цитоплазматическую, так и пластидную активности (Duchene et al. 2005). Amazing nuclear-cytoplasmic tRNA dynamics Устоявшееся мнение о ядерно-цитоплазматической динамике tRNAs заключается в том, что tRNAs транскрибируются и преобразуются в ядре и затем высвобождаются в цитоплазму для aminoacylation и участия в трансляции. Этому мнению противоречит то, что (1) tRNA aminoacylation не ограничивается цитоплазмой (Arts et al. 1998b; Lund and Dahlberg 1998; Sarkar et al. 1999; Grosshans et al. 2000), (2) дефекты tRNA aminoacylation в ядре вызывают накопление в ядре tRNA (Lund and Dahlberg 1998; Sarkar et al. 1999; Grosshans et al. 2000; Azad et al. 2001; Steiner-Mosonyi and Mangroo 2004), и, (3) у дрожжей, сплайсинг tRNA происходит не в нуклеоплазме, а скорее в цитоплазме на поверхности митохондрий (Yoshihisa et al. 2003, 2007). Эти наблюдения и тот факт, что у дрожжей spliced tRNAs (т.e., tRNAs , которые "посещают" цитоплазму) накапливаются в ядре, если aminoacylation дефектно (Grosshans et al. 2000; Feng and Hopper 2002), это привело к предположению и последующему подтверждению, что субклеточный трафик tRNA не является однонаправленным из ядра в цитоплазму. Скорее всего существует ретроградный путь, с помощью которого цитоплазматические tRNAs импортируются в ядро и они могут повторно экспортироваться в цитоплазму в ответ на пищевую доступность (Shaheen and Hopper 2005; Takano et al. 2005; Hurto et al. 2007; Whitney et al. 2007). Этот ретроградный процесс консервативен в клетках позвоночных и HIV, по-видимому, обладает кооптированным процессом в качестве единственного механизма доставки retrotranscribed комплексов в ядро (Zaitseva et al. 2006; Shaheen et al. 2007). Перемещения tRNA между ядром и цитоплазмой происходят в три отдельные ступени (Fig. 5). Во-первых, вновь транскрибированные и частично преобразованные tRNAs экспортируются из ядра в цитоплазму ("первичный ядерный экспорт tRNA"). Во-вторых, tRNAs импортируются из цитоплазмы в ядро ("tRNA ядерный импорт"). Наконец, tRNAs, которые уже побывали в цитоплазме, но располагаются в ядре, могут повторно вступать в цитоплазму за счет "tRNA ре-экспорта" (Whitney et al. 2007). Primary tRNA nuclear export Существует хорошо известный механизм экспорта tRNA из ядра в цитоплазму, который использует путь Ran-GTPase, а у позвоночных члена семейства Ran-binding β-importin, Xpo-t (Arts et al. 1998a; Kutay et al. 1998). Xpo-t имеет ортологи у грибов (Los1 или Xpot) и растений (PSD или PAUSED) , по-видимому, функционирующие сходным образом (Hellmuth et al. 1998; Sarkar and Hopper 1998; Hunter et al. 2003). Xpo-t и его ортологи непосредственно связывают tRNA в присутствии Ran-GTP, а гетеротримерный Ran-GTPoXpo-totRNA комплекс пермещается по ядерным порам в цитоплазму, где после Ran-GAP-обеспечиваемого усиления гидролиза Ran-GTP в Ran-GDP, комплекс диссоциирует и tRNA высвобождается. Недавно получена, с 3.2 A разрешением структура S. pombe Xpot в комплексе с Ran-GTP и tRNA, а также 3.1 A структура несвязанного Xpot (Cook et al. 2009). Эти структуры элегантно продемонстрировали, что Xpot оборачивается вокруг tRNA, осуществляя контакты с плечом акцептором и T&Rsi;C и D-петлями, оставляя открытой антикодоновую петлю. Эти исследования подтвердили более раннюю работу, которая продемонстрировала, что Xpo-t соединяется предпочтительно с tRNAs со зрелыми её концами 5' и 3' , содержащими концевую CCA и что альтерации последовательностей tRNA, разрушающие chernehe клеверного листа или третичную структуры tRNA ведут к снижению связывания с Xpo-t, а присутствие интронов не влияет на эффективность связывания Xpo-t с tRNA (Arts et al. 1998b; Lipowsky et al. 1999). Эти взаимодействия показывают, что Xpo-t осуществляет функцию вычитки, так что tRNAs с несоотв. структурой или с незрелыми 5' и 3' концами, неспособны доставляться в цитоплазму. Взаимодействия также объясняют как неподвергшиеся сплайсингу tRNAs, содержащие интроны в антикодоновых петлях, могут взаимодействовать с Los1 и экспортироваться в цитоплазму. Однако данные проливают немного света на то, как aminoacylation влияет на ядерный экспорт tRNA, поскольку несплайсированные tRNAs не могут быть aminoacylated (O'Farrell et al. 1978), но у дрожжей они несмотря на это экспортируются из ядра с помощью Los1.
Две линии доказательств подтверждают, что, по крайней мере, у некоторых организмов имеются дополнительные пути для доставки tRNA в цитоплазму, которые независимы от ортологов Xpo-t. Во-первых, LOS1 у почкующихся и делящихся дрожжей и его растительный ортолог, PSD, несущественны, даже если ядерный экспорт tRNA безусловно существенен для этих клеток. Хотя у растений без PSD обнаруживаются дефекты развития, рост los1Δ и LOS1 дикого типа клеток очень сходен (Hurt et al. 1987; Hunter et al. 2003; Li and Chen 2003). Во-вторых, некоторые органимы, такие как членистоногие, не обладают ортологом Xpo-t среди членов их семейства <β-importin (S Shibata et al. 2006 and references therein).
Помимо своей роли в ядерном экспорте определенных фосфорилированных белков у почкующихся дрожжей (Kaffman et al. 1998; DeVit and Johnston 1999; for review, see Hopper 1999) и в ядерном экспорте pre-miRNAs у метазоа и растений (Lund et al. 2004; Zeng and Cullen 2004; Park et al. 2005; S Shibata et al. 2006), член β-importin Exportin-5, скорее всего служит в качестве ядерного экспортера tRNA у некоторых организмов. Exportin-5 связывает tRNA в присутствии Ran-GTP (Bohnsack et al. 2002; Calado et al. 2002; S Shibata et al. 2006). Структура этого комплекса ещё не описана, но существуют предположения о ней, исходя из недавно описанной структуры в 2.9 A pre-miRNA в комплексе с Exportin-5 и Ran-GTP (Okada et al. 2009). У дрожжей биологические эксперименты задокументировали роль Exportin-5 ортолога Msn5 в ядерном экспорте tRNA. Во-первых, los1Δ
msn5Δ двойные мутанты накапливают больше tRNA в ядре, чем любой из одиночных мутантов (Takano et al. 2005). (Поскольку los1Δ msn5Δ двойные мутанты крепкие, они д. содержать, по ркйней мере ещё один неидентифицированный экспортер tRNA для ядерного экспорта у дрожжей). Во-вторых, как будет описано ниже, Msn5 участвует в ре-экспорте tRNA, части ретроградного процесса (Eswara et al. 2009; Murthi et al. 2010). Сходным образом у Drosophila, у которых отсутствует ортолог Exportin-t, ортолог Exportin-5 ,dmExp5, служит в качестве ядерного экспортера tRNA в дополнение к функции ядерного экспортера pre-miRNA (S Shibata et al. 2006). Итак, у дрожжей и мух, гомологи Exportin-5 участвуют в ядерном экспорте tRNA. Это контрастирует с биологической ролью у др. организмов. Напр., несмотря на способность Exportin-5 позвоночных соединяться с tRNA, он не рассматривается как основной вкладчик в ядерно-цитоплазматическую динамику tRNA у позвоночных, поскольку Xpo-t экспортирует большую часть ядерного пула tRNA в цитоплазму клеток позвоночных (Arts et al. 1998b; Lipowsky et al. 1999), и поскольку Exportin-5 оказывает лишь небольшой эффект на ядерный пул tRNA (Bohnsack et al. 2002; Calado et al. 2002). Сходным образом растительный ортолог Exportin-5, HST, как известно, не участвует в ядерном экспорте tRNA (Park et al. 2005). Итак, гомологи Exportin-5, по-видимому, участвуют в ядерном экспорте tRNA у некоторых, но не всех организмов. Retrograde tRNA nuclear import Один член дрожжевого β-importin семейства, Mtr10 (vertebrate TNPO3 или TRN-SR2), участвует в ретроградном ядерном импорте tRNA. Делеция MTR10 вызывает дефекты накопления в ядре tRNA (Shaheen and Hopper 2005; Hurto et al. 2007; Whitney et al. 2007). Взаимодействует ли Mtr10 непосредственно с tRNA неизвестно, но его роль может быть косвенной, исходя из хорошо охарактеризованного взаимодействия Mtr10 и TNPO3 с белками, особенно cHYR-связывающими белками (for review, see Pemberton and Paschal 2005). tRNAs накапливаются в ядре после лишения пищи (Shaheen and Hopper 2005; Hurto et al. 2007; Whitney et al. 2007). Однако процесс ядерного импорта не является чувствительным к достатку пищи, т.к. было показано, он является конституитивным процессом (Shaheen and Hopper 2005; Takano et al. 2005; Zaitseva et al. 2006; Murthi et al. 2010). Retrograde tRNA re-export Ядерный импорт tRNA является конституитивным, но ретроградный путь чувствителен к пище, ступень ре-экспорта, скорее всего, регулируется и чувствительна к пище. Интересно, что две линии доказательств подтверждают, что Los1 участвует как в первичном экспорте tRNA, так и в процессе ре-экспорта. Во-первых, цитоплазматические tRNAs накапливаются в ядрах в los1Δ гетерокарионов (Shaheen and Hopper 2005; Takano et al. 2005). Во-вторых, ядерный пул tRNAs в клетках los1Δ заметно уменьшен, когда уменьшен ядерный импорт tRNA в mtr10Δ los1Δ клетках (Murthi et al. 2010). Los1-обеспечиваемый ядерный экспорт вряд ли участвует в зависимом от пищи или в aminoacylation-зависимом ре-экспорте tRNA, поскольку Los1 может экспортировать pre-tRNA, которые не aminoacylated.
Как было описано выше,дрожжевой член β-importin семейства Msn5 участвует в ядерном экспорте tRNA. Т.к. делеция MSN5 не оказывает эффекта на ядерный экспорт содержащих интрон pre-tRNAs, то роль Msn5's в ядерном экспорте tRNA ограничена ре-экспортом, по крайней мере, тех tRNAs, кодируемых интрон-содержащими генами (Eswara et al. 2009; Murthi et al. 2010), и является, скорее всего, tRNA экспортером, чувствительным к доступности пищи. Неизвестно как Msn5 взаимодействует и экспортирует зрелые tRNAs из ядра в цитоплазму, но нет транскриптов, которые содержат интроны. Неизвестно, почему Msn5 чувствителен к доступности пищи и почему прежде всего экспортируются aminoacylated tRNAs. Одним из объяснений является то, что он может кооперироваться с др. белками, способными отличать зрелые tRNAs от интрон-содержжащих pre-tRNAs, и aminoacylated от незаряженных tRNAs. Фактор элонгации трансляции Tef1/2 (vertebrate eEF1-a) является кандидатом на роль такого белка, поскольку он взаимодействует только со зрелыми aminoacylated tRNA, участвует в ядерном экспорте tRNA (Grosshans et al. 2000; McGuire and Mangroo 2007), и способен перемещаться в и из ядра дрожжей (Murthi et al. 2010). Др. дрожжевые белки, включая Utp9 (Eswara et al. 2009), Utp8 (McGuire et al. 2009) и Sol1/2 (Shen et al. 1996; Stanford et al. 2004) также участвуют в ядерно-цитоплазматической динамике зрелых tRNAs, но необходимы дальнецшие исследования, чтобы понять роль этих белков в ре-экспорте
tRNA Future prospects The pace of progress in our understanding of tRNA processing, tRNA trafficking, and tRNA function is truly staggering, since almost all of the highlighted information in this review is new since 2003 (Hopper and Phizicky 2003), and since we omitted so many results from the study of organisms other than yeast and from organelles. The future promises to be equally revealing. For example, we can expect that every tRNA modification pathway will be worked out in yeast and in several other model organisms, as well as in humans, and we will know most of the functions in some detail. In yeast, the recent finding that sua5 mutants lack the universally conserved threonylcarbamoyladenosine modification (t6A) has opened the door to study of this ancient modification (El Yacoubi et al. 2009). The increasing application of synthetic genetic and chemical genetic arrays and other similar methods for analyzing complex genetic phenotypes promises to yield great insights into tRNA biology (Gustavsson and Ronne 2008; Wilmes et al. 2008). Increased use of deep sequencing methods and microarray-based analysis will undoubtedly contribute significantly new information on tRNA expression, signaling, and translation (Netzer et al. 2009). The increased sophistication of crystallographic analysis (Murphy et al. 2004; Ogle and Ramakrishnan 2005) and in vitro translation assays (Kothe and Rodnina 2007; Zaher and Green 2009) promises to add great dimension to our understanding of tRNA translation efficiency and fidelity, and ever more sophisticated assay systems will allow an increasingly clear picture of translation in vivo (Salas-Marco and Bedwell 2005; Kramer and Farabaugh 2007) and subcellular tRNA trafficking pathways. In addition, further study of the involvement of tRNA and tRNA fragments in signaling pathways and stress response pathways will undoubtedly lead to new links between tRNA function and other global cellular response systems. Note added in proof Recent results demonstrate that the tRNA m5C methyltransferase Dnmt2, which modifies residue 38 of substrate tRNAs (Goll et al. 2006), has a prominent role in the stress response (Schaefer et al. 2010). Drosophila Dnmt2 mutants are significantly less viable in response to oxidative or heat stress, and substrate tRNAs in these mutants are more sensitive to stress-induced cleavage and cleavage by angiogenin (Schaefer et al. 2010). Since this sensitivity to cleavage by angiogenin is also observed in tRNA from mouse embyonic fibroblasts derived from the corresponding mouse mutant (Schaefer et al. 2010), these results suggest that tRNA modification may play a conserved role in modulation of the stress response.
|
