Посещений:
УБИКВИТИНОВЫЕ СЕТИ

Пространственная и Временная Организация

The spatial and temporal organization of ubiquitin networks
Caroline Grabbe, Koraljka Husnjak & Ivan Dikic
Nature Reviews Molecular Cell Biology 12, 295-307 (May 2011) | doi:10.1038/nrm3099

In the past decade, the diversity of signals generated by the ubiquitin system has emerged as a dominant regulator of biological processes and propagation of information in the eukaryotic cell. A wealth of information has been gained about the crucial role of spatial and temporal regulation of ubiquitin species of different lengths and linkages in the nuclear factor-κB (NF-κB) pathway, endocytic trafficking, protein degradation and DNA repair. This spatiotemporal regulation is achieved through sophisticated mechanisms of compartmentalization and sequential series of ubiquitylation events and signal decoding, which control diverse biological processes not only in the cell but also during the development of tissues and entire organisms.


Рис.1.  |  Ubiquitylation — bringing temporal and spatial order to the NF-κB pathway.


Рис.2.  |  Ubiquitin-mediated coordination of receptor endocytosis.


Рис.3.  |  Polarized functions of ubiquitylation in neurons.


Рис.4.  |  Control of development by localized ubiquitylation events.


Рис.1.  |  Box 1 | The ubiquitin network — what a difference a decade makes


Рис.1.  |  Box 2 | Crosstalk between the ubiquitin network and other post-translational modifications

10 лет тому назад мы только начинали подозревать главную роль, которую играет ubiquitin сеть для понимания передачи сигналов в клетке. В то время убиквитинирование было только в начале всеобщего признания, что это не просто сигнал для деградации белка, а главный регулятор биологических событий1. RING домены были распознаны, как медиаторы активности ubiquitin ligase, а по-разному прикрепленные цепочки ubiquitin были заподозрены в регуляции различных процессов, что подтверждалось сообщениями о сцеплении Lys63 цепочек ubiquitin с провоспалительными сигнальными путями и реакциями репарации ДНК. С того времени убиквитиновая система оказалась очень разносторонней в терминах как диапазона убиквитиновых сигналов, так и круга клеточных реакций, которое может запускать присоединение ubiquitin (Box 1).

Box 1 | The ubiquitin network - what a difference a decade makes Full box
Убиквитинирование достигается за счет сочетанного действия активирующих (E1), конъюгирующих (E2) и связывающих (E3) энзимов, некоторые из которых обладают активностью удлинения, что поддерживает генерацию polyubiquitin цепей2-6. Белки могут быть модифицированы посредством конъюгации monoubiquitin или polyubiquitin цепочек различной длины по каждому из семи Lys остатков (Lys6, Lys11, Lys27, Lys29, Lys33, Lys48 или Lys63) или N-терминального Met (Met1) мономера убиквитина. Убиквитиновые цепочки могут быть, таким образом, соединены посредством, по крайней мере, 8 разных гомотипических сцеплений, а также с помощью диапазона атипических цепочек (гетерологичных, вилкообразных или смешанных)5, 7, 8. Иногда эффективное полиубиквитинирование белка нуждается в добавочных факторах конъюгации, т.наз. E4 энзимах, которые поддерживают элонгацию убиквитиновых цепочек9 (rev. Ref. 10). Несметное количество видов ubiquitin сигналов распознается и декодируется с помощью специализированных ubiquitin-binding domains (UBDs), которые образуют временные, нековалентные взаимодействия с любой из частей убиквитина или область сцепления в цепочках убиквитина11. Строгий контроль убиквитинирования завершается с помощью deubiquitylating (DUBs) энзимов, дивергентного семейства isopeptidases, которые в противоположность убиквитинированию удаляют метки конъюгированного убиквитина12, 13. Некоторые недавние обзоры тщательно разрабатывают принципиальные механизмы, с помощью которых убиквитинирование участвует в регуляции различных аспектов клеточной физиологии, включая деградацию белков, репарацию ДНК, путь ER-associated degradation (ERAD), эндоцитоз рецепторов, апоптоз и аутофагию14-20.

Ubiquitylation in space and time


Обилие ubiquitin во всех клетках и в большинстве субклеточных структур принуждает живую клетку разрабатывать многочисленные стратегии для соотв. организации сети ubiquitin в пространстве и времени. Интересно, что хотя убиквитин, по-видимому, не обнаруживается внутри органелл, таких как эндоплазматический ретикулум (ER), митохондрии21 или хлоропласты22, присоединение ubiquitin несомненно, по-видимому, влияет на функцию или гомеостаз всех субклеточных компартментов. Несколько уровней специфичности достигается с помощью следующего: избирательности к разным белкам мишеням, которая обеспечивается с помощью индивидуальных E2-E3 пар; распознавания длины и сцепления ubiquitin конъюгата с помощью UBDs; и очевидной корреляции между функциональным исходом и разными видами убиквитина. Однако эти механизмы не объясняют полностью, как убиквитиновая система может специфически регулировать тысячи клеточных функций23. Вместо этого, тонкая настройка убиквитинирования зависит от динамических изменений и секвестрации компонентов внутри убиквитиновой сети, а также от шаперонов и каркасных белков. Последовательная сложная сборка, базирующаяся на множественных взаимодействиях между ubiquitin и UBD, которые регулируются в пространстве и времени, делает возможной распространение сигнальных событий, контролирующих динамику доставки рецепторов, активацию киназ NF-κB пути, синаптическую пластичность и ход клеточного цикла.
Compartmentalization of the conjugation machinery. растут доказательства, подчеркивающие существенную роль E2 энзимов и E3 энзимов в обеспечении субстратной специфичности, а также пространственного и временного контроля убиквитинирования. Хотя некоторые белки аппарата конъюгации ubiquitin преимущественно экспрессируются в определенных тканях, напр., мышце-специфическая E3 лигаза tripartite motif-containing 63 (TRIM63)24, большинство из предполагаемых ~40 E2 энзимов5 и более 600 E3 энзимов4, 25 обнаруживают паттерны широкой экспрессии и поэтому нуждаются в пространственной организации на субклеточном уровне.
Одной из наиболее ясных стратегий контроля локализации белка является физическое закрепление на специфических органеллах или субклеточных мембранах. В самом деле, большинство E3 энзимов содержат регионы, которые, как предполагают, являются трансмембранными доменами и ограничивают их везикулярными структурами. E2 и E3 субъединицы, которые лишены трансмембранных доменов, могут также ассоциировать со специфическими органеллами путем взаимодействия с каркасными белками или путем образования комплексов убиквитин лигазы из многих субъединиц, которые включают компоненты, нацеливающие их на специфическую субклеточную локализацию.
Белки убиквитиновой сети, которые ограничиваются специфическими субклеточными компартментами, включают E2 энзимы ubiquitin-conjugating enzyme 6 (Ubc6) и Ubc7, которые ассоциированы с ER и участвуют в ERAD26. Ubc6 закреплен на ER посредством своего трансмембранного домена, тогда как Ubc7 (который обычно цитоплазматический) рекрутируется на ER с помощью каркасного белка, связанного с конъюгацией убиквитина conjugation to ER degradation 1 (Cue1)27. Интересно, что в отсутствие Cue1, Ubc7 деградирует посредством ubiquitin fusion degradation 4 (Ufd4)-зависимого Lys48-сцепленного убиквитинирования, механизма, которые гарантирует, что Ubc7 действует только, когда локализован соотв. образом на the ER28.
Множественные E3 лигазы специфически рекрутируются на митохондрии29, и многие из них используют трансмембранные домены для прикрепления к наружной митохондриальной мембране (OMM), где они катализируют убиквитинирование в цитоплазматическом пространстве, окружающим митохондрии. В самом деле, митохондриальные E3 лигазы выполняют многие роли, свойственные митохондриям, такие как регуляция контроля качества внутренних митохондриальных белков30, митохондриальный трафик и морфологическая динамика во время делений митохондрий25, 31; однако они также важны для интеграции митохондрий в клеточную среду. Напр., митохондриальный ubiquitin ligase активатор NF-κB25 (MULAN; известен также как GIDE32) является E3 лигазой, которая участвует в передаче сигналов от митохондрий в ядро25, регуляции клеточного роста и индукции caspase-зависимой апоптической клеточной гибели32.
В дополнение к белкам, которые постоянно локализуются в специфических субклеточных компартментах, многочисленные E2-E3 пары доставляются к месту действия только в ответ на специфические физиологические условия и/или разнообразные посттрансляционные модификации (Box 2). Напр., члены class III E2 семейства (UBCH6 (также известен как UBE2E1), ubiquitin-conjugating enzyme E2 E2 (UBE2E2) и UBCM2 (также известен как UBE2E3)) транслоцируются в ядро вследствие прикрепления ubiquitin к остатку Cys в их активном сайте. Транслокация в ядро обеспечивается с помощью importin 11, который специфически распознает ubiquitin-charged E2 энзимы33.

Box 2 | Crosstalk between the ubiquitin network and other post-translational modifications Full box
Др. интригующим примером пространственно-временной регуляции в убиквитиновой сети является вемя-зависимая сборка DNA damage response (DDR) комплексов в специфических ядерных фокусах в ответ на повреждения ДНК, такие как разрывы двойной нити ДНК (DSBs). Ключевой молекулой во время сборки комплексов DDR адапторный и nucleating белок mediator of DNA damage checkpoint 1 (MDC1). Будучи фосфорилированным с помощью ataxia-telangiectasia mutated (ATM), MDC1 запускает последовательное рекрутирование E3 лигазы RING finger 8 (RNF8; которая вместе с UBC13 (также известной как UBE2N), убиквитинирует гистон H2A и его варианты), breast cancer type 1 susceptibility (BRCA1) и p53-binding protein 1 (53BP1) на DSBs (rev. 34). Чтобы поддержать устойчивое убиквитинирование гистона H2A, рекрутируется дополнительная E3 лигаза, RNF168. Это обеспечивается с помощью двух RNF168's доменов MIU (motif interacting with ubiquitin) и недавно идентифицированного UMI (UIM (ubiquitin-interacting motif)- и MIU-родственного) домена, который распознает убиквитинированный H2A. Это приводит к локальной амплификации H2A, модифицированного с помощью Lys63-сцепленных полиубиквитиновых цепочек и к удержанию 53BP1 и BRCA1 на DSBs (rev. 16). Дополнительные E3 лигазы также рекрутируются на DSBs, включая RAD18 (которая способствует гомологичной рекомбинации за счет непосредственного связывания ДНК рекомбиназы RAD51C35) и HECT E3 ligase HECT domain и RCC1-like domain-containing 2 (HERC2; которая стабилизирует RNF8-UBC13, чтобы способствовать амплификации Lys63-сцепленных ubiquitin сигналов на DSBs36).
Timing is everything - dynamics through DUBs. Принимая во внимание, что DUBs участвуют в предопределении времени прикрепления и удаления ubiquitin, ветвь DUB из убиквитиновой сети является также критической для пространственно-временной регуляции убиквитинирования. Тесная ассоциация загрузки и удаления убиквитина убедительно продемонстрирована путем идентификации многих E3-DUB пар, в которых два противодействующих энзима взаимодействуют непосредственно с тонкой настройкой конъюгации ubiquitin. Образование пар E3 лигазами с соответствующими им DUBs, как было установлено, является регуляторным механизмом для предупреждения аутоубиквитинирования лигаз и/или индукции направления в протеосомы DUBs12.
Подобно ubiquitin-конъюгационному аппарату, DUBs содержат структурные вариации, которые вносят вклад в субстратную специфичность, субклеточную локализацию и межбелковые взаимодействия37. Из оцененных 95 DUBs в геноме человека38, только ubiquitin-specific-processing protease 30 (USP30) 39 (закрепленная на OMM) и USP19 (Ref. 40) (закрепленная на ER) имеют прогнозируемые трансмембранные регионы. Однако опять же подобно ubiquitin-конъюгационному аппарату, DUBs могут доставляться в специфические субклеточные компартменты путем ассоциации с белками. содержащими трансмембранные домены. Напр., ataxin 3 соединяется с AAA-ATPase p97 (Ref. 41), которая рекрутирует его на цитоплазматическую поверхность ER, где он управляет обратной транслокацией убиквитинированных ERAD субстратов в цитоплазму41.
Прекрасным примером, иллюстрирующим важность DUBs для регуляции во времени передачи сигналов ubiquitin, является сборка комплексов. компетентных к репарации ДНК, во время реакции на DSB. По крайней мере, семь DUBs были описаны, как противодействующие активности E3 лигаз и способные к динамическим изменениям в DSB ландшафте. Среди них USP3 и USP16 непосредственно деубиквитинируют гистон H2A42, 43. Напротив, BRCA1-BRCA2-containing complex subunit 36 (BRCC36), которая рекрутирует RNF8-UBC13-синтезированные Lys63-сцепленные цепочки на DSBs, как часть RAP80 комплекса после облучения44, функционирует в качестве генерального Lys63-специфического DUB энзима, который противодействует активности RNF8-UBC13 ubiquitin ligase комплекса с помощью деубиквитинирования γH2AX45. Однако молекулярные механизмы, лежащие в основе контроля во времени активации лигаз, сопровождаемой точным вовлечением BRCC36 в этот сигнальный каскад, остаются неясными. Др. ключевым DUB является USP1, который модулирует убиквитилирование proliferating cell nuclear antigen (PCNA)46 и Fanconi anaemia белки FANCD2 и FANC147, 48. Двумя недавними сюрпризами на арене ассоциированных с DSB энзимов DUBs стали ubiquitin carboxy-terminal hydrolase 37 (UCH37; также известная как UCHL5)49 и OTUB1 (Ref. 50). UCH37, которая уже давно рассматривалась как протеосом-специфический DUB51, 52, как было установлено, недавно ассоциирует с inositol-requiring 80 (INO80) хроматин-ремоделирующим комплексом, чтобы катализировать скольжение нуклеосом. OTUB1 супрессирует RNF168-зависимое полиубиквитинирование путем связывания и ингибирования E2 UBC13 независимо от её каталитической активности50. Кажется, что в физиологическом аспекте накопление OTUB1 в компартменте клетки, обогащенном E2 энзимом, может создавать порог для инициации передачи сигналов в ответ на повреждения ДНК50.
Ubiquitin recognition through UBDs. После конъюгации ubiquitin клеточное распознавание и интерпретация убиквитиновых сигналов осуществляется с помощью нижестоящих эффекторов и каркасных белков, которые также д.быть пространственно организованы. Непосредственными декодировщиками убиквитинирования являются белки, содержащие один или несколько UBDs (известных как рецепторы ubiquitin), которые часто обнаруживают специфичность в отношении длины и паттернов сцепления ubiquitin (rev. Ref. 11); эти белки также обладают и др. функциональными доменами. Низкое сродство, описанное для ubiquitin-UBD взаимодействий (часто на микромолекулярном уровне11, 53), которое в течение ряда лет казалось неожиданным, привело к заключению, что высокая специфичность взаимодействий ubiquitin-UBD в физиологических параметрах постоянно базируется на локальной концентрации партнеров по связыванию, на присутствии дополнительных связывающих интерфейсах и/или образовании предварительно сформированных сигнальных комплексов.
Аналогично ubiquitin-conjugation аппарату и DUBs, рецепторы ubiquitin могут быть ограничены субклеточными компартментами за счет интегральных трансмембранных якорей или доменов, которые обеспечивают ассоциацию с мембранами за счет непосредственного взаимодействия с разными фосфолипидами. Это общераспространенная стратегия для белков, участвующих в эндоцитозе и доставке пузырьков, которые обладают UBD UIM вместе с phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2)- и PtdIns(1,4,5)P3-binding epsin N-terminal homology (ENTH) доменом (в случае epsins) или с PtdIns3P-specific FYVE доменом (в случае hepatocyte growth factor-regulated Tyr kinase substrate (HRS) и signal-transducing adaptor molecule (STAM))18, 54. Динамичное рекрутирование рецепторов ubiquitin в ответ на физиологический статус также широко распространено в ядрах, где взаимодействия с др. ядерными белками, а также конъюгация с ubiquitin и/или small ubiquitin-like modifier (SUMO), регулируют многоступенчатую сборку белковых комплексов на поврежденном хроматине16, 55. Одним из таких примеров является рекрутирование translesion ДНК полимераз на убиквитинированный PCNA, которое обеспечивается с помощью ubiquitin-binding motif (UBM) и ubiquitin-binding zinc-finger (UBZ) доменов56, а также с помощью MIU- и UMI-зависимого хроматинового таргетинга RNF168 (Refs 57, 58).
Функции более чем 200 клеточных рецепторов ubiquitin по большей части неизвестны11. Интересные комбинации из UBDs с трансмембранными доменами, из мотивов распознающих РНК и множественных модулей межбелковых взаимодействий указывают на то, что может быть открыто значительно больше, если это будет происходить в результате пространственного и временного определения ориентиров (targeting) убиквитиновой сети.

Functions of restricted ubiquitin signals


Чтобы продемонстрировать, как строгая пространственно-временная регуляция убиквитиновых сетей используется для руководства клеточным поведением, мы коротко обсудим 4 хорошо охарактеризованных процесса, при которых убиквитинирование было изучено детально: путь передачи сигналов NF-κB; доставка и эндосомная сортировка трансмембранных белков; протеосомная деградация поврежденных и нежелательных белков; и регуляция p53-обеспечиваемой транскрипционной активации с помощью ubiquitin сигналов.
NF-κB - a prototype for ubiquitin compartmentalization. Последние несколько лет получено значительное количество информации, связанной с интеграцией многих ubiquitin сигналов пути NF-κB (Fig. 1), которые важны для собственно регуляции воспаления, иммунных ответов и жизнеспособности клеток59. Хотя активация NF-κB (состоящего из p50 и p65) может возникать в результате стимулирования многих рецепторов клеточной поверхности и внутриклеточных рецепторов (таких как tumour necrosis factor receptor 1 (TNFR1), interleukin-1 receptor type 1 (IL-1R1) или Toll-like receptor 4 (TLR4) и CD40), все пути, по-видимому, конвергируют на стадии ингибитора NF-κB (IκB) kinase (IKK) комплекса. Этот основной регуляторный комплекс, состоящий из IKKα, IKKβ и NF-κB essential modulator (NEMO; известен также как IKKγ, обеспечивает событие фосфорилирования, которое делает возможным Skp-cullin-F-box-βTrCP (SCFβTrCP)-индуцированное Lys48-сцепленное полиубиквитинирование и последующую деградацию ингибирующих IκB белков. Это в конечном итоге делает возможным транслокацию NF-κB в ядро и активацию транскрипции (rev. Refs 60, 61).

Разные типы убиквитиновых цепочек были предложены для пространственного и временного контроля активации IKK комплекса в разных ветвях пути NF-κB7, 8, 61. Активация IKK комплекса зависит от Lys63-сцепленного убиквитинирования многочисленных receptor-proximal субстратов, включая receptor-interacting protein 1 (RIP1), IL-1R-associated kinase (IRAK) и различные TNFR-associated factors (TRAFs) в разных установочных параметрах, генерируемых с помощью кооперативных усилий из Lys63-специфического E2 комплекса UBC13-UBE2 variant 1A (UEV1A) вместе с дивергентным набором ubiquitin E3 лигаз (напр., TRAFs, inhibitor of apoptosis proteins (IAPs) и Pellino)61. Lys63-сцепленные цепочки, которые действуют как стыковочные сайты для ubiquitin-связывающих neural zinc-finger factor (NZF) доменов из TAK1-binding 2 (TAB2) и TAB3 адапторных белков, давно уже считались доминантным ubiquitin сигналом, лежащим в основе активации IKKs61. Lys63-сцепленные ubiquitin цепочки, которые конъюгируют с адапторными белками (RIP1, TRAFs и IRAKs) могут и в самом деле служить в качестве платформ для рекрутирования TAB2-bound TGFβ-activated kinase 1 (TAK1) и NEMO-ассоциированных IKK посредством UBDs из TAB2 и NEMO, соотв.61 (Fig. 1). Эта модель подтверждается с помощью преципитационных экспериментов, в которых все эти белки были обнаружены в активированных рецепторных комплексах вместе с некоторыми белками, декорированными Lys63-сцепленными убиквитиновыми цепочками неизвестной длины. Однако остается неизвестным, что детерминирует время и специфичность рекрутирования киназ (TAB2, TAB3 и TAK1 д. привлекаться первыми, после чего NEMO-IKK) и как направленность в передаче сигналов осуществляется в таких комплексах.
Возможное объяснение этой загадки предлагается недавними находками, что убиквитиновые цепочки, купированные посредством Met1 (известны как линейные убиквитиновые цепочки), могут предоставлять критические компоненты специфичности выше активации IKK activation62-64. Линейные убиквитиновые цепочки продуцируются в клетках с помощью linear ubiquitin chain assembly complex (LUBAC), которые состоят из каталитического RING-between-RING домена белка HOIL1-interacting protein (HOIP), связанного с двумя адапторными белками, haeme-oxidized IRP2 ubiquitin ligase 1 (HOIL1; известна также как RBCK1)62, 64 и недавно идентифицированного SHANK-associated RH domain-interacting protein (SHARPIN)65, 66, 67. Современная модель указывает на то, что тримерный комплекс LUBAC быстро доставляется из цитозоля на активированные TNFR и CD40 рецепторные комплексы путем соединения с субстратами с Lys63- или с Lys11-сцепленными цепочками59, 65, 66, 68. Вследствие такой доставки, LUBAC может обеспечивать линейное убиквитинирование NEMO, RIP1 и потенциально др. неидентифицировнных компонентов, которые существенны для активации пути NF-κB62, 64-67. Механистически линейные убиквитинированные цепочки, конъюгированные с NEMO молекулами, были обнаружены взаимодействующим с ubiquitin связыванием в ABIN and NEMO (UBAN) домене соседних NEMO молекул63, приводя к конформационным изменениям в NEMO димерах, которые потенциально могут запускать активацию IKKs63 (Fig. 1).
Недавние данные указывают. что длина убиквитиновых цепочек также может быть важным детерминантом в активации NF-κB23. Структурные и биофизические данные указывают, что изолированный UBAN домен из NEMO преимущественно связывает линейный diubiquitin скорее, чем Lys11-, Lys48- или Lys63-сцепленные убиквитиновые цепочки63, 68-70. Напротив, при экспрессии вместе с C-терминальным цинковым пальчиком из NEMO, связывание более длинных Lys63-сцепленных цепочек увеличивается71. Т.о., очень возможно, что NEMO считывает множественные ubiquitin цепочки, используя различные механизмы для контроля динамики и направленности активации IKK комплекса (Fig. 1).
Инактивация NF-κB контролируется также во времени. Два DUBs, A20 (также известен как TNFAIP3) и CYLD, по-видимому, абсолютно необходимы для инактивации NF-κB, поскольку делеция или мутация любого из них вызывает неконтролируемое воспаление и туморогенез (rev. Ref. 72). A20 и CYLD выполняют по времени разные роли по ингибированию NF-κB на разных стадиях во время воспаления: CYLD ограничивает инициальную спонтанную активацию NF-κB, тогда как A20 завершает индуцибельную передачу сигналов NF-κB посредством негативной петли обратной связи. Хотя CYLD и A20 деубиквитинируют сходные субстраты, чтобы ухудшить активацию NF-κB, их способы действия и пространственно-временная регуляция отличаются существенно (rev. Ref. 72). CYLD, как было установлено, связывает NEMO непосредственно и обладает DUB активностью в отношении как Lys63-сцепленных, так и линейных цепочек73. CYLD соединение с NEMO в самом деле необходимо для его фосфорилирования с помощью IKK комплекса, которое в свою очередь ингибирует активность DUB, приводя к активации NF-κB74.
Хотя A20 регулируется во времени на транскрипционном уровне , он также соединяется со многими партнерами по взаимодействию и рекрутируется на активные рецепторные комплексы, чтобы ограничить передачу сигналов NF-κB. Напр., вследствие TNF стимуляции, A20 взаимодействует с убиквитиновым рецептором TAX1-binding protein 1 (TAX1BP1), чтобы сформировать комплексы с RIP1 (Ref. 75). Вместе с TAX1BP1 и E3 лигазами ITCH и RNF11, A20 формирует ubiquitin-редактируемый комплекс, который может ингибировать NF-κB каскад72. Это достигается путем удаления Lys63-сцепленных цепочек с A20 субстратов, таких как TRAF6 и RIP1, что сопровождается добавлением нацеленных на протеосомы Lys48-сцепленных цепочек76. Интересно, что хотя A20 преимущественно отщепляет Lys48-сцепленные цепочки по сравнению с Lys63-сцепленными цепочками in vitro73, 77, он преимущественно удаляет Lys63-сцепленные цепочки в клетках, указывая, что его специфичность in vivo может быть контролируемой с помощью неизвестных детерминант.
A20 может также по времени контролировать активацию NF-κB путем взаимодействия E3 лигаз TRAF2, TRAF6 и cellular IAP 1 (cIAP1) с E2 энзимами78. Рано после стимуляции липополисахаридом, который активирует TLRs, A20 нарушает связывание TRAF2, TRAF6 и cIAP1 с E2 энзимами UBC13 и UBCH5C, тогда как в более поздние моменты времени A20 запускает Lys48-сцепленное убиквитинирование и деградацию этих энзимов 78.
Ubiquitin controls trafficking and endosomal sorting. Белки плазматической оболочки могут быть убиквитинированы с помощью множественных monoubiquitins или oligoubiquitin цепочек, это ведёт к их интернализации и последующей эндоцитотической сортировке. Это, как известно, происходит не только для большинства рецепторных Tyr киназ, но и также для др. мембранных белков54, 79, 80 (Fig. 2). Убиквитинирование таких грузов регулируется в пространстве: оно инициируется на клеточной поверхности, но часто может продолжаться на эндосомных мембранах с помощью специфических E3 лигаз80, 81. Набор эндосомных убиквитиновых рецепторов, включая epidermal growth factor receptor substrate 15 (EPS15), epsin и endosomal sorting complex required for transport (ESCRT) аппарат, ответственен за регуляцию направленного тока и пространственной сортировки убиквитинированных грузов вдоль эндоцитотического маршрута18, 82. Каждый из 4-х ESCRTs (ESCRT-0, ESCRT-I, ESCRT-II и ESCRT-III) имеет, по крайней мере, три структурных мотива, которые управляют пространственной организацией аппарата эндосомной сортировки. Они включают домены, которые взаимодействуют с мембранными липидами, др. ESCRTs и ubiquitin, хотя ESCRT-III лишен UBD83.

В соответствии с его ролью в физическом отлавливании и концентрации убиквитинированных грузов на эндосомных мембранах, наивысшая способность связывать убиквитин обнаруживается у ESCRT-0. Этот комплекс может одновременно связывать несколько убиквитиновых единиц посредством diubiquitin motif (DIUM) в HRS и UIM в STAM. IБыло также предположено, что после того, как будет инициирован эндоцитоз на этом пути, накопление ubiquitin-декорированных грузов делает возможным последующее рекрутирование ESCRT-I и ESCRT-II. У дрожжей ESCRT-I распознает ubiquitin посредством UEV домена в vacuolar protein sorting 23 (Vps23 ; дрожжевой гомолог tumour susceptibility gene 101 (TSG101) млекопитающих), вместе с недавно открытым UBD в MVB sorting factor 12 (Mvb12)84, тогда как ESCRT-II базируется на GRAM-like ubiquitin-binding in EAP45 (GLUE) домене в Vps36 для связывания убиквитина. Рекрутирование ESCRT-III и аппарата, который в конечном итоге осуществляет образование multivesicular body (MVB) и разрезание мембран (AAA-ATPase Vps4), по-видимому, не зависит от передачи сигналов ubiquitin.
Помимо пространственного накопления доставляемых грузов с помощью ESCRTs, регуляция во времени всего процесса гарантируется действием многочисленных ubiquitin-модулирующих белков (E3 лигазы и DUBs) , которые располагаются с разных частях эндосомного компартмента. Напр., DUBs ассоциированные молекулы с SH3 доменом STAM (AMSH) и ubiquitin isopeptidase Y (UBPY; также известная как USP8, и наз. Doa4 у дрожжей) нацелены на ранние эндосомы путем взаимодействия с STAM и выполняют важные роли в инициальной сортировке убиквитинированных грузов85. Более того, множественные E3 лигазы и DUBs уравновешивают статус убиквитинирования интернализованного груза, чтобы предопределить его судьбу, которая может заключаться или в рециклинге обратно в мембрану или деградации в лизосомах. У дрожжей уровень Lys63-сцепленного полиубиквитинирования связанных с мембраной субстратов, контролируется с помощью E3-DUB пары reverses SPT-phenotype 5 (Rsp5)-Ubp2, которая рекрутируется на ESCRT-0 (содержащий Hse и Vps27, дрожжевые гомологи HRS и STAM)86, 87. В самом деле, активность Rsp5 необходима для направления в лизосомы многих белков плазматической мембраны и, как недавно сообщалось, непосредственно рекрутируется на специфические грузы клеточной поверхности с помощью arrestin-related trafficking adaptors (ARTs) у дрожжей88 посредством ART PY мотивов.
Финальная стадия эндоцитоза, деубиквитинирование является важным, поскольку событие инициального убиквитинирования завершается отсортировкой конъюгатов в MVBs. После определения интернализованного груза на деградацию, удаление конъюгированных видов ubiquitin не только существенно для рециклинга самого ubiquitin, но и также позволяет аппарату ESCRT диссоциировать от груза и повторно использоваться в клетке. Такие активности осуществляются с помощью специфических DUBs, таких как AMSH и UBPY, которые рекрутируются в поздние эндосомные компартменты за счет непосредственной ассоциации с ESCRT-III или каркасным белком ALG2-interacting X (ALIX; также известным как AIP1, и наз. у дрожжей Bro1 ) (rev. Ref. 85).
Spatial control of substrate degradation. Хотя важность убиквитинирования для деградации белка уже давно оценена, исследования последних лет бросили вызов традиционной модели, выявив линейную корреляцию между убиквитинированием и направлением в протеосомы с помощью выявления полного набора видов ubiquitin, которые контролируют удаление белка в клетках человека.
Белковые субстраты, первоначально конъюгированные с помощью Lys48-сцепленных убиквитиновых цепочек (возможно с помощью всех non-Lys63 сцеплений89), направляются в протеолитические 26S протеосомы за счет нескольких скооперированных путей. Направление белков в протеосомы может быть прямым, осуществляемым посредством непосредственного распознавания убиквитина с помощью 19S regulatory particle subunits Rpn10 (S5A у млекопитающих), которые содержат один из трех UIMs, в зависимости от вида15 и Rpn13 (ADRM1 у млекопитающих), который содержит недавно идентифицированный UBD наз. Pru90, 91. Альтернативно направление может быть непрямым и в этом случае обеспечивается с помощью протеосомных челночных факторов, таких как Rad23, Dsk2 и DNA damage-inducible 1 (Ddi1)92, 93, которые используют свои ubiquitin-ассоциированные домены (UBA домены) для связывания убиквитинированных субстратов и их N-терминальных ubiquitin-like domains (UBL доменов) для стыковки с Rpn10, Rpn13 или Rpn1 (PSMD2 у млекопитающих) субъединицей основания протеосом11, 15. Челночные факторы выполняют несколько важных ролей в пространственной организации деградации белков, поскольку они предоставляют механизм для отлавливания и транспортировки удаленно расположенных убиквитинированных субстратов в протеосомы. Было предположено, что они также стабилизируют комплексы субстрат-протеосомы и защищают убиквитиновые цепочки от избыточного удлинения и разборки во время переноса в протеосомы. Интересно, что как Rad23 так и Dsk2 непосредственно сцеплены с аппаратом конъюгации ubiquitin за счет взаимодействия с Ufd2, E4 энзимом, который точно позиционирует их вблизи цепочек убиквитина непосредственно после конъюгации. гарантируя быстрый транспорт в протеосомы94.
Будучи корректно позиционированными в узком входе в протеосомную сердцевину, белки. предназначенные на деструкцию нуждаются в деубиквитинировании, чтобы гарантировать эффективную деградацию субстрата и рециклинг убиквитиновых меток. Чтобы достичь тонко регулируемого деубиквитинирования протеосомы ассоциируют с тремя DUBs с комплементарными качествами. JAMM (JAB1/MPN/MOV34 metalloenzyme)-типа Rpn11 является интегральной субъединицей крышки регуляторной частицы, тогда как Ubp6 (USP14 у млекопитающих) и UCH37 (которая отсутствует у почкующихся дрожжей) рекрутируются и активируются путем непосредственного соединения с Rpn1 и ADRM1, соотв. (rev. Ref. 95). Комплементарным образом Rpn11 обнаруживает склонность к отщеплению убиквитиновых цепочек с проксимальной специфичностью, чтобы удалять всю цепочку сразу, тогда как Ubp6 и UCH37 удаляют фрагменты убиквитина с дистального кончика цепи, приводя к постепенному укорочению убиквитинированных субстратов15. Функционально эти отличающиеся активности, как полагают, тонко настраивают деградацию белка, предоставляя механизм ослабления деградации определенных, возможно слегка или неправильно убиквитинированных субстратов, если это необходимо. Добавление др. уровня сложности к динамичному контролю деградации субстрата, HECT E3 и E4 лигаза Hul5, как недавно сообщалось, удлиняют существующие цепочки и тем самым противодействуют активности по укорочению цепочек у Ubp6 в протеосомах96, это указывает на то, что мы всё ещё не имеем полной картины динамичной регуляции предопределения субстрата на деградацию.
Локальная передача сигналов убиквитина также играет роль в аутофагии, которая удаляет нерастворимые белки и повреждения или избыточные органеллы из клеток20, 97, но это не будет рассматриваться из-за ограничения места.
Guarding the 'guardian of the genome'. Стабильность, активность и локализация многочисленных белков регулируются различными модификациями убиквитина, а также др. посттрансляционными модификациями (Box 2). Интригующий пример такой сложной регуляции это опухолевой репрессор p53. Полиубиквитинирование p53 с помощью E3 лигазы double-minute 2 (MDM2) ведет к его протеосомной деградации98, но найдена также дополнительные E3 лигазы, чтобы модифицировать p53 с помощью monoubiquitin, Lys48-сцепленных цепочек или Lys63-сцепленных цепочек. Это позволяет тонко контролировать уровни p53 levels, а также изменения как в его субклеточной локализации, так и его предпочтений в отношении разнообразной панели партнёров по взаимодействию (recently rev. Ref. 99). Интересно, что присутствуя на низких уровнях, MDM2, также как и отбор др. E3 лигаз100, может переключать специфичность и обеспечивать моноубиквитилирование p53, которое демаскирует сигнал ядерного экспорта p53's, приводя тем самым к его экспорту из ядра101, 102. Цитозольный p53 непосредственно соединяется с антиапоптическим белком B cell lymphoma-extra large (BCL-XL) и BCL-2, запуская тем самым митохондриальный путь апоптоза103, и как недавно было установлено, репрессирует также аутофагию зависимым от клеточного цикла образом104. Более того, p53 убиквитинируется с помощью ER-резидентной E3 лигазы synoviolin вблизи ER, приводя к его деградации с помощью цитоплазматического ERAD пути; однако функциональное значение этого неясно105.

UBIQUITYLATION IN DEVELOPMENT


Пространственная и временная организация убиквитиновой сети подтверждена в последние годы как регулятор биологических процессов не только на клеточном уровне, но и также на уровне ткани и всего животного.
Polarizing ubiquitin signals in neurons. Пространственно контролируемая ubiquitin сеть важна для координации поляризованной передачи информации, которая необходима для жизни и функционирования нейронов с раннего развития и для поддержания результатов модуляции пластичности и функции. Вместе с белковым синтезом деградация белков предоставляет общий механизм тонкой настройки доступности и рецепторной функции белка в синапсах и облегченич долговременного хранения информации за счет постоянного ремоделирования протеома нейронов106, 107.
Каждая ступень развития нейрона от ранней дифференцировки до тонкой настройки синапсов, по-видимому, регулируется с помощью ubiquitin сети. Напр., путем объединения сил с её разными коактиваторами, CDH1 и CDC20, лигаза E3 anaphase-promoting complex (APC) управляет ростом и формированием паттерна аксонов108, и контролирует дифференцировку пресинаптических частей аксонов109, запуская деградацию транскрипционного фактора neurogenic differentiation factor 2 (NEUROD2) (Fig. 3a). Ubiquitin-обеспечиваемая деградация является также ключевым событием во время становления нейрональной клеточной судьбы. Аксональная и дендритная судьбы отличаются высоким и низким уровнем передачи сигналов phosphoinositide 3-kinase (PI3K) соотв., а отличительная активация PI3K пути в аксонах, как было установлено, зависит от пространственно ограниченной протеосомной деградации AKT в дендритах. Это может быть обусловлено специфической потребностью в неизвестных лигазах E3 на кончиках дендритов, приводящей к локальной деградации AKT в этих структурах110 (Fig. 3b).

Давно известно, что ростовые конусы содержат активную ubiquitin-proteasome систему и что ингибирование протеосом затрудняет хемотропный поворот ростового конуса в ответ на netrin 1, внеклеточную молекулу наведения аксонов111, а также синаптическую функцию и пластичность112. Соответственно убиквитинирование безусловно участвует в ведении аксонов, часто путем регуляции количества рецепторов наведения в плазматической оболочке. Напр., у Drosophila melanogaster Roundabout белок (отталкивающий рецептор ведения аксона, который соединяется с Slit, репелентом, секретируемым глией срединной линии113) позитивно регулируется в комиссуральных нейронах с помощью E3 лигазы NEDD4 после их вынужденного пересечения срединной линии. Это приводит к переключению чувствительности с привлекательных на отталкивающие сигналы срединой линии, ингибируя тем самым любые др. попытки пересечь срединную линию114. Механистически уровни на поверхности Roundabout зависят от рецептора сортировки Commisureless, который перенаправляет Roundabout с синтетического на поздний эндоцитический путь, приводя Roundabout к деградации. Commisureless специфически подавляется NEDD4-зависимым способом в нейронах, которые пересекают срединную линию, тем самым стимулируя усиление сортировки Roundabout на клеточную поверхность, где он действует, ингибируя вторичные попытки пересечения срединной линии114, 115.
В зрелой нервной системе компоненты ubiquitin-proteasome системы располагаются вблизи синапсов107, 112, где они контролируют собственно синаптический баланс путем поддержания оптимальных уровней белков. На пресинаптической стороне уровни белков, таких как priming белки синаптических пузырьков DUNC13 у D. melanogaster и RAB3-interacting molecule 1 (RIM1) у мыши, находятся под строгим контролем убиквитинирования (Fig. 3c), указывая на эволюционно консервативную связь между высвобождением нейротрансмиттера и ubiquitin-proteasome системой116, 117. Ещё более специфически E3 лигаза мыши SCRAPPER, как полагают, полиубиквитинирует RIM1 зависимым от активности способом и тем самым регулирует силу нейротрансмиссии, что важно для собственно тонкой настройки синапсов во время долговременной потенциации117. На постсинаптической стороне убиквитинирование чрезвычайно важно для регуляции синаптической проводимости путем контроля количества рецепторов для нейротрансмиттеров, которые располагаются на постсинаптических мембранах. У Caenorhabditis elegans, AMPA-типа Glu receptor 1 (GLR-1), как было установлено, негативно регулируется таким способом с помощью множественных Е3 лигаз, включая APC - которая регулирует его доставку и рециклинг118 - и E3 cullin-RING ubiquitin лигазный комплекс, содержащий BTB-Kelch белок KEL-8 и cullin 3 (CUL-3) - которые обеспечивают его деградацию в протеосомах119. Кроме того, GLR-1 транскрипционно контролируется с помощью SCF комплекса (SCFβTrCP), содержащего F-box белок LIN-23, который способствует деградации у C. elegans β-catenin гомолога ?-catenin- and armadillo-related 1 (BAR-1) и тем самым регулирует транскрипцию генов мишеней для WNT, включая GLR-1 (Ref. 120) (Fig. 3c). Хотя динамика регуляции GLR-1 с помощью убиквитинирования изучена не полностью, ясно, что ubiquitin-proteasome система существенна для гарантии соответствующей регулировки уровней GLR-1 в ответ на синаптические потребности в разные моменты времени. Помимо уровней рецепторов регулируется также индуцированное активностью убиквитинирование многочисленных молекул постсинаптических уплотнений, включая postsynaptic density 95 (PSD95), SH3 and multiple ankyrin repeat domains protein (SHANK) и SAP90- и PSD95-associated protein (SAPAP; также известный как GKAP)107, это важно для постоянно происходящих структурных и функциональных адаптаций PSD структуры и функции в ответ на физиологические нужды.
Ubiquitin networking in animal development. Пространственное ограничение убиквитиновой сети не только очевидно внутри клеток, но и также критическое в контексте всего организма, при этом онтогенетические выборы в значительной степени зависят от локальных активностей аппарата убиквитинирования.
У ранних эмбрионов онтогенетические решения часто базируются на секретируемых сигнальных молекулах, наз. морфогенами, которые образуют концентрационные градиенты, чтобы контролировать индукцию разных клеточных судеб. Первоначально морфогены, включая членов семейства bone morphogenetic protein (BMP), устанавливают план тела животного. Напр., у D. melanogaster ортолог BMP2 и BMP4, Decapentaplegic (DPP), является существенным для формирования дорсовентральной оси (rev. Ref. 121). Клетки внутри пределов передачи сигналов DPP отвечают активацией программ транскрипции, обеспечиваемой посредством SMAD транскрипционных активаторов MAD и MEDEA, которые формируют димеры и транслоцируются в ядро121.
В дополнение к ограниченной экспрессии DPP, недавние данные показали, что MAD и MEDEA регулируются с помощью убиквитинирования и сумоилирования соотв. (Fig. 4a). Семейство SMAD ubiquitylation regulatory factor (SMURF) из HECT E3 ubiquitin лигаз направляет MAD на протеосомную деградацию во время формирования дорсовентрального эмбрионального паттерна122, тогда как ядерная конъюгация MEDEA с помощью SUMO запускает его ядерный экспорт и тем самым негативно регулирует его активность123; эти события важны для ограничения сигнальных рамок DPP.
Пространственный и временной контроль с помощью убиквитиновой сети также важен для развития специфических тканей и типов клеток. Как уже подчеркивалось, убиквитинирование является важным детерминантом во время развития нервной системы. Помимо его роли в дифференцировке аксонов, APC, как сообщалось, регулирует асимметричное распределение Miranda и ассоциированных с ним грузовых белков (таких как Prospero, Staufen и Brain tumour (BRAT)), которые делают возможным асимметричные деления нейробластов D. melanogaster на самообновляющиеся нейробласты и детерминированные материнские клетки ганглиев124. С помощью моноубиквитинирования Miranda, APC оказывается способным к асимметричной локализации как Miranda, так и его грузовых белков, потенциально путем регуляции их связывания с убиквитиновыми рецепторами (Fig. 4b). На более поздних стадиях, APC локально индуцирует эндоцитотическую интернализацию и негативную регуляцию адгезивной молекулы Fasciclin 2 (FAS2) градированным способом вдоль аксональных проекций двигательных нейронов, создавая тем самым субклеточный градиент адгезивности, который, как полагают, координирует миграцию глии по мере роста аксона125 (Fig. 4c). Даже если прямого убиквитинирования FAS2 не было установлено у D. melanogaster, её гомолог у позвоночных, neural cell adhesion molecule (NCAM), как известно, направляется на эндоцитоз с помощью убиквитинирования126.
Альтернативный подход передачи пространственной информации посредством убиквитиновой сети действует во время терминальной дифференцировки сперматид у D. melanogaster. Этот процесс известен как индивидуализация, контролируется с помощью активности CUL3 E3 лигазного комплекса, в котором адапторный белок KLH10 направляет Bruce, члена семейства IAP, на протеолитическую деградацию127. Деградация Bruce осуществляется градированным способом, приводя к градиенту активных каспаз и последующей продукции индивидуализированных спермиев128. Этот градиент генерируется с помощью недавно идентифицированной KLH10-CUL3 E3 лигазного ингибитора Scotti, который экспрессируется в виде субклеточного дисто-проксимального градиента в сперматидах.
Помимо специфических ролей для разных компонентов убиквитиновой сети, общее состояние убиквитинирования и протеосомной деградации, по-видимому, онтогенетически регулируются. Уровни рецепторов полиубиквитинина RPN10 и RAD23 флюктуируют между разными фазами развития. Это было показано у D. melanogaster, у которой высокие уровни экспрессии этих белков во время эмбриогенеза и куколочной стадии могут отражать интенсивную тканевую реорганизацию, которая происходит на этих стадиях129. Интересно, что состав протеосом также, как было установлено, тесно связан с возрастом животного. В самом деле, старение, по-видимому, нарушает сборку высоко активных 26S протеосом, делая предпочтительным формирование слабо активных 20S протеосом, событие, которое связано с заметным снижением локомоторной способности и уровней АТФ130.
Поэтому очевидно, что существует множество стратегий по использованию убиквитиновой сети во время развития. Новые находки, включая недавнее сообщение, что чувствительность клеток может быть тонко настроена с помощью противостоящих активностей из E3-DUB энзимов, как это было показано для сигнального пути WNT у D. melanogaster131, показывающего, что нам пока известны лишь наметки того, как убиквитинирование используется для достижения пространственной организации в развитии.

Conclusion and perspectives


Even though many of the basic principles of ubiquitylation are well understood, we are far from completely comprehending the full functional extent of ubiquitin-mediated events in specific biological processes. As the immediate access to free ubiquitin at any given location in the cell is a prerequisite for ubiquitylation, there is a need for spatial control of ubiquitin signalling. In this Review, we have discussed some examples in which ubiquitin signalling is spatially controlled; other examples, not discussed owing to space limitations, include regulation of parkin-mediated mitophagy by the protein kinase PTEN-induced putative kinase (PINK)132, 133, and localization of ubiquitin signalling cascades regulating antiviral innate immunity in peroxisomes134.
Future studies will need to focus on increasing our understanding of the dynamics of the ubiquitin network in its physiological context and to clarify how diverse ubiquitin signals are generated and decoded by UBDs in the highly crowded micromilieu of the cell. We are now starting to grasp the link between specific E2–E3 pairs and the formation of distinct ubiquitin chains, but pinpointing which pairs are physiologically relevant and clarifying the importance of ubiquitin chain length in biological settings still requires further research. Related to this subject, it will also be interesting to dissect the mechanisms of ubiquitin editing and investigate whether this phenomenon is restricted to the proteasome and the NF-κB pathway or whether it is a general strategy used for the spatiotemporal regulation of ubiquitin signalling networks.
The ubiquitin system has been found to have integral roles in most cellular events and is therefore an important therapeutic target, for example for the development of treatments against cancer and neurodegenerative disorders, as well as inflammatory and infectious diseases135, 136. A better understanding of the spatiotemporal regulation of the ubiquitin network may allow us to target such proteins at specific subcellular structures, leading to the development of more selective therapeutics and minimization of unwanted side effects136.

FURTHER INFORMATION http://www.biochem2.com/default.html
Сайт создан в системе uCoz