Висцеральная энтодерма (VE) это простой эпителий, который формирует наружный слой эмбриона мыши на стадии яйцевого цилиндра. Передняя висцеральная энтодерма (AVE), специализированный субнабор VE клеток, ответственная за спецификацию переднего паттерна. Клетки AVE обнаруживают стереотипическое миграторное поведение внутри VE, которое отвечает за правильную ориентацию передне-задней оси. Эпителиальная целостность VE поддерживается во время всего хода миграции AVE, которая осуществляется за счет интеркаляции AVE и др. VE клеток. Несмотря на непрерывность эпителиального слоя, VE характеризуется наличием двух регионов, которые драматически отличаются своим поведением, один обнаруживает сильные клеточные перемещения и интеркаляции (в нем мигрирует AVE) и др., который статичен, с относительно незначительными перемещениями и перемешиванием клеток. Мало известно о клеточных перестройках, которые приспосабливают и влияют на устойчивое направленное движение субнаборов клеток (таких как AVE) внутри эпителия, подобного VE. Это исследование использовало комплексный подход для выяснения клеточных движений в эпителии. Использовали эмбрионов дикого типа и мутантные, у которых миграция AVE аномальна или арестована, мы показали, что миграция AVE специфически связана с изменениями в упаковке клеток в VE и с увеличением образований в виде мультиклеточных розеток (пять или более клеток, соединенные в одной точке). Чтобы проверить роль розеток во время миграции AVE, мы разработали математическую модель клеточных движений в VE. Для этого мы использовали vertex-based модель, в применении к элипсоидной поверхности, чтобы воспроизвести реалистическую геометрию яйцевого цилиндра мыши. Потенциал образования розеток включается вместе с др. различными преобразованиями соединений. Моделирование подтвердило, что в то время как розетки несущественны для миграции AVE, они являются критическими для упорядочивания этой миграции у эмбрионов. Наши модели согласуются с результатами на трансгенных эмбрионов, у которых нарушена передача сигналов Planar Cell Polarity (PCP). Такие эмбрионы имеют достоверно сниженное количество розеток, измененную эпителиальную упаковку и обнаруживают аномалии миграции AVE. Наши результаты показали, что образование многоклеточных розеток в VE мышей зависит от нормальной передачи сигналов PCP. Итак, наша модель и экспериментальные наблюдения подтверждают, что розетки в VE эпителии образуются не пассивно, а в ответ на миграцию AVE. Вместо этого они представляют собой PCP-зависимые перестройки клеток, которые действуют, чтобы амортизировать неустойчивость клеточной упаковки в VE с помощью миграции AVE, позволяя клеткам AVE мигрировать упорядоченным образом.

Эпителии выполняют структурные и функциональные роли во время эмбрионального развития и у взрослых. Их организованная, когезивная природа делает их идеальными для выстилки структур и действия в качестве селективных барьеров. Эпителии обнаруживают четкую апикально-базальную полярность, при этом их апикальный домен характеризуется соединительными комплексами, которые формируют плотные соединения, служащие в качестве барьеров току субстанций между клетками. Кроме того, слипчивые соединения расширяются в непрерывный поясок вокруг клеток и обеспечивают структурную целостность эпителия. Множество функций ассоциировано с эпителием во время развития, роста, болезни, а репарация необходима. чтобы он был высоко динамичным и в тоже самое время надежно поддерживать структурную целостность. Большинство морфогенетических процессов во время развития поэтому использует обширное ремоделирование эпителиальной ткани: морфогенез ветвления в развивающихся почках, легких и молочных железах; образование сенсорных органов и ганглиев из эпителиальных плакод; и образование нервной трубки, это лишь некоторые из примеров (rev.[1]-[5]).

Висцеральная энтодерма (VE) мыши является примером простого эпителия с критической ролью в развитии. Она покрывает эпибласт и внеэмбриональную эктодерму (ExE) мышиного эмбриона на стадии яйцевого цилиндра. Поскольку плод происходит преимущественно из эпибласта, то существуют клетки VE, которые ответственны за спецификацию переднего паттерна в эпибласте. Пердняя висцеральная энтодерма (AVE), это специализированный субнабор клеток VE, отвечающий за правильную ориентации передне-задней оси в эмбрионе мыши (rev.[6]-[9]). Приблизительно на 5^1/2день после спаривания (dpc), клетки на дистальном кончике VE дифференцируются, чтобы сформировать самостоятельную субпопуляцию AVE, характеризующуюся экспрессией генетических маркеров, таких как Hex, Lefty1 и Cer-1 [10]-[12]. AVE мигрирует проксимально однонаправленным способом и затем резко останавливается на соединении между эпибластом и ExE [13]. Начиная с этого положения AVE индуцирует передний паттерн в подлежащем эпибласте за счет ограничения экспрессии задних маркеров на противоположной стороне бокала эпибласта [6],[14]. У мутантов, таких как Nodal^Δ600/LacZ and Cripto^-/-, AVE корректно индуцируется на дистальном кончике яйцевого цилиндра, но неспособен мигрировать, приводя, в конце концов, к тому, что задние маркеры локализуются в эпибласте неправильно. Такие эмбрионы обнаруживают тяжелые дефекты гаструляции и неспособны к дальнейшему развитию [15],[16].

Движущие силы для миграции AVE остаются неясными. Dkk1, секретируемый ингибитор передачи сигналов Wnt, экспрессируется непосредственно впереди мигрирующих AVE клеток, как было установлено, действует в качестве ведущего сигнала для AVE [17]. Относительно высокий уровень клеточной пролиферации в задней части VE, как полагают, обеспечивает инициальное смещение AVE клеток в направлении кпереди и возможно управляет их направленной миграцией [12], однако сравнительно недавние результаты предположили, что скорость пролиферации в задней части VE не выше. чем в др. регионах VE и поэтому вряд ли участвует в перемещении клеток AVE [18]. Time-lapse микроскопия эмбрионов, несущих трансген Hex-GFP, который маркирует клетки AVE, показала, что они активно мигрируют в течение периода в 4-5 ч и чрезвычайно динамичны, обнаруживают сильную активность по образованию выпячиваний в направлении движения [13]. Как только клетки AVE достигают границы ExE, они резко ослабляют проксимальное движение и вместо этого начинают двигаться вбок вдоль границы, как будто натолкнулись на барьер миграции. Во время этого латерального перемещения клетки AVE обнаруживают мало или не обнаруживают выпячиваний [13],[19].

Недавние сообщения показали, что VE сохраняет целостность эпителия во время миграции AVE [19],[20]. Маркеры плотных и слипчивых соединений ZO-1 и E-cadherin присутствуют постоянно вдоль всех клеточных границ всего VE на всех стадиях миграции. Кроме того, клетки AVE должны двигаться внутри плоскости эпителия скорее, чем на верхушках др. VE клеток, поскольку VE остается простым эпителием толщиной только в один слой клеток [13]. Поэтому кажется необходимым, чтобы клетки AVE осуществляли свой путь через VE не нарушая целостности эпителия. Это было подтверждено с помощью time-lapse исследований, которые показали, что клетки AVE мигрируют с помощью интеркаляции [19],[20].

Наши time-lapse исследования не-AVE клеток VE показали, что клетки непосредственно вперди (более проксимально относительно) мигрирующего AVE обнаруживают сходные изменения во время миграции AVE [20]. Более того, подобно клеткам AVE, эти клетки также были неспособны пересекать границу с ExE. VE клетки, лежащие поверх ExE (ExE-VE) обнаруживали драматически отличающееся поведение по сравнению с VE клетками, лежащими поверх эпибласта (Epi-VE). В то время как Epi-VE обнаруживали мощные перемещения и интркаляции клеток, напротив ExE-VE были относительно статичными и обнаруживали очень незначительные перемешивания клеток [20]. Барьер для миграции AVE, по-видимому, является областью VE (ExE-VE), которая не переносит клеточных перестроек, необходимых для миграции AVE.

Эти две области VE также обнаруживают различия в локализации молекулярных моторов F-actin и Myosin IIA и сигнальных молекул Planar Cell Polarity (PCP) Dishevelled-2 (Dvl-2) и Vangl2 [20]. Передача сигналов PCP координирует поляризацию и перестройки клеток поперек полей клеток во многих отличающихся контекстах, таких как компаундные глаза и крылья Drosophila и нервная трубка млекопитающих (rev. [21]-[23]). Морфогенетические движения клеток в эпителиальном контексте активно исследовали в крыловых дисках и зародышевом диске Drosophila. Движения конвергентного удлинения в зародышевом диске вызываются за счет ремоделирования соединений, которые приводят к изменениям T1-соседи [24] и к образованию и распаду многоклеточных розеток (five or more cells meeting at a point, Box 1) [25]. Удлинение зародышевого диска также характеризуется увеличением анизотропии клеток, первоначально регулярно упакованных клеток, становящихся всё более беспорядочными в отношении своей упаковки и формы [26].

Box 1. Operational Definitions

Rosettes: groups or five or more cells within a simple epithelium that share a common central vertex.

Epithelial disequilibrium: an epithelial state characterized by anisotropy of cell shapes, irregular cell packing, and reduction in the proportion of hexagonal cells. Disordered AVE migration: migration that results in a pattern of Hex-GFP AVE cells at 5.5 dpc that deviates from the stereotypic arrangement of a contained, coherent, bilaterally symmetrical patch of cells that does not extend onto the extra-embryonic ectoderm. Such deviations include whorl-like arrangements, AVE cells extending onto the extra-embryonic ectoderm, and AVE cells scattered and having a dispersed appearance. These phenotypes are not mutually exclusive and can occur together in the same embryo.

Эпителиальные ткани, включая висцеральную энтодерму, напоминают двумерные сети из многоугольников [27],[28]. Модель Vertex, согласно которой каждая клетка представлена многоугольником с ограниченным набором свойств, поэтому часто используется, чтобы смоделировать эффекты на тканевом уровне сил и важных клеточных процессов, таких как рост, пролиферация и перестройка соединений. Rauzi et al., напр., использовали модель vertex, чтобы показать, что элонгация ткани может управляться с помощью анизотропии кортикального натяжения в комбинации с простыми перестройками соединений [29]. Aegerter-Wilmsen et al. тем временем показали, что они способны воспроизвести полигональные распределения в крыловых имагинальных дисках дрозофилы, включая механические обратные связи в качестве регулятора клеточного роста [30]. Некоторые др. авт. использовали vertex модели, чтобы привнести ключевую информацию в др. биологические феномены [31]-[34].

Используя комбинацию математического моделирования и экспериментальных наблюдений, мы опробовали как широкие движения клеточной интеркаляции, наблюдаемые в Epi-VE, могут влиять на миграцию AVE. Путем исследования эмбрионов на разных стадиях миграции AVE и мутантных эмбрионов, у которых не происходит, мы показали, что миграция AVE специфически связана с изменениями в упаковке клеток в VE и с увеличением многоклеточных розеток. Чтобы исследовать роль розеток во время миграции AVE, мы разработали математическую модель, которая модулирует клеточные движения в VE. Эта модель расширяет предыдущую vertex модель за счет внесения элипсоидной поверхности, чтобы предоставить более реалистичную геометрию мышиного эмбриона. Мы также включали новый тип перестройки соединений, за счет позволения близким vertices соединяться вместе, воспроизводя тем самым формирование розеток. Модели, в которых допускается образование розеток, сильно напоминают экспериментально наблюдаемое миграторное поведение AVE. Однако модели, в которых образование розеток не допускается, обнаруживают аномальную беспорядочную миграцию AVE (Box 1), указывающую, что поскольку розетки не важны для миграции AVE, они важны для аккуратности этой миграции, действительно наблюдаемой у эмбрионов. Эти модели сильно воспроизводят результаты мутантных эмбрионов, у которых передача сигналов PCP нарушена и которые обнаруживают достоверно сниженное количество розеток. Клетки AVE всё ещё способны мигрировать кперди у этих мутантов, но делают это аномально рассееным, беспорядочным образом. Наша модель и экспериментальные наблюдения вместе приводят нас к предположению, что в VE мышей многоклеточные розетки не управляют клеточной миграцией, а скорее амортизируют нарушения клеточной упаковки, возникающие во время миграции AVE, позволяя тем самым AVE мигрировать упорядоченным образом.

Cellular Packing within the Visceral Endoderm Changes with AVE Migration

Чтобы охарактеризовать более детально изменения клеточной укладки в VE, которые сопровождают и возможно влияют на миграцию AV, мы делали видимыми апикальные границы VE с помощью окрашивания фиксированных эмбрионов на маркер плотных соединений ZO-1. Мы захватывали 3-D конфокальное изображение объемов всего эмбриона и затем оценивали непрозрачность стеков изображений. Это позволяло толковать объём всего эмбриона, так что форма индивидуальных клеток поверхности VE и соединений, образуемых между ними, могла быть изучена в контексте цилиндрического эмбриона как целого. Эти эксперименты проведены с Hex-GFP трансгенными эмбрионами [35], у которых AVE маркировался флюоресценцией GFP.

У эмбрионов, у которых AVE ещё не начинал миграцию, клетки были в основном регулярными по своим контурам по всему VE. Напротив, у эмбрионов, у которых AVE мигрировал кпереди, Epi-VE клетки обнаруживали существенную вариабельность формы и нерегулярную упаковку, тогда как ExE-VE клетки оставались относительно регулярными по форме и упаковке (Figure 1A). Это указывает, что наблюдаемые неправильности клеточной формы могут быть связаны с перестройками клеток в Epi-VE, которые сопровождают миграцию AVE.

Чтобы количественно оценить различия в форме клеток в Epi-VE и ExE-VE на разных стадиях миграции AVE, мы подсчитывали соседей для каждой из клеток VE, измеряя число сторон или число многоугольников клеток [30]. Используя толкование непрозрачности фиксированных эмбрионов, мы вручную идентифицировали каждую VE клетку, отмечая находится она в Epi-VE или ExE-VE и количества клеток, которые имели общие края с ней. Гексогональный план клеток (среднее количество углов приближалось к 6) рассматривался как предпочтительный или равновесный для упаковки клеток в эпителии, а отклонения от него указывали на увеличение потери равновесия (Box 1) [26],[28].

Мы сгруппировали эмбрионы на 4 разные стадии миграции AVE, используя флюоресценцию Hex-GFP, чтобы определить, индуцирован ли AVE и в какой степени он мигрирует. "Pre-AVE" эмбрионы это те, у которых AVE ещё не индуцирован. "Distal" эмбрионы имеют индуцированный AVE на дистальном кончике, но он ещё не начал мигрировать. В "migrating" эмбрионах AVE находится в процессе миграции, а у "anterior" эмбрионов AVE достиг границы ExE-VE (проксимальной границы миграции) и начал распространятся латерально.

Figure 2. The VE contains multi-cellular rosettes.

(A) A ZO-1 stained embryo in which cells are coloured in to illustrate the presence of junctions where three, four, or five cells meet at a point. (B) Rosettes are formed by five or more cells meeting at a point. A variety of rosettes are shown, including two that share some cells (last panel).

Мы сравнивали количества многоугольников в ExE-VE и Epi-VE на каждой стадии и установили, что у "pre-AVE" и "distal" эмбрионов различия между средними количествами многоугольников (polygon) в этих двух регионах были недостоверны (p>0.07, Student's t test). Однако у "migrating" и "anterior" эмбрионов среднее количество многоугольников в Epi-VE было достоверно ниже, чем в соотв. ExE-VE (p<0.002, Student's t test) (Figure 1B).

Мы сравнили количества многоугольников на разных стадиях и нашли, что отсутствуют достоверные отличия в средних в ExE-VE на всех 4-х стадиях (p = 0.25, ANOVA). Однако обнаруживаются достоверные отличия в средних количествах многоугольников между Epi-VE 4-х стадий (p = 0.0007, ANOVA). При парных сравнениях средние количества многоугольников Epi-VE у "migrating" и "anterior" эмбрионов были достоверно ниже, чем таковые в Epi-VE у "distal" эмбрионов (p = 0.02, Student's t test) (Figure 1B').

Мы затем определяли частоту количеств разных многоугольников в Epi-VE и ExE-VE на 4-х стадиях развития. Как и в случает среднего числа многоугольников у "pre-AVE" и "distal" эмбрионов распределение количества многоугольников в Epi-VE не отличалось достоверно от такового в соотв. ExE-VE (p>0.4, Kolmogorov-Smirnov test) (Figure S1A and B). Напротив в "migrating" и "anterior" эмбрионах распределение количеств многоугольников в Epi-VE было достоверно отличным от такового в соотв. ExE-VE (p<0.02, Kolmogorov-Smirnov test), с относительно более высокой пропорцией четырехсторонних клеток (Figure S1C and D).

Мы сравнивали частоты количеств многоугольников в Epi-VE на 4-х стадиях и установили, что она не отличается достоверно между "pre-AVE" и "distal" эмбрионами (p = 0.5, Kolmogorov-Smirnov test) (Figure S2A). Однако как и в случае среднего числа многоугольников, частоты количеств многоугольников в Epi-VE как "migrating", так и "anterior" эмбрионов были достоверно отличны от таковых в Epi-VE у "distal" эмбрионов (p<0.05, Kolmogorov-Smirnov test) (Figure S2B, C, and H). Epi-VE у "migrating" и "anterior" эмбрионов обнаруживают увеличение пропорции четырехсторонних клеток за счет 5- и 6-сторонних клеток по сравнению с "distal" эмбрионами (Figure S2H), это может объяснить достоверное снижение среднего количества углов клеток в Epi-VE на этих стадиях.

Эти изменения мы наблюдали в упаковке клеток в VE расположенной в регионе, которым ограничивается миграция AVE ( Epi-VE), и на стадиях, во время которых клетки AVE мигрируют ("migrating" и "anterior"). Чтобы оценить, являются ли изменения в упаковке Epi-VE клеток связаны специфически с миграцией AVE (напр., относительно онтогенетических стадий эмбриона), мы исследовали Nodal^Δ600/LacZ and Cripto^-/- эмбрионов, у которых AVE правильно специфицируется, но неспособен мигрировать. Эмбрионы, сравнимые со стадией "anterior" эмбрионов дикого типа по размеру (p = 0.41, ANOVA) и форме (Figure S3) мы вычленяли на 5.75 dpc и определяли количества многоугольников.

Мы установили, что упаковка VE клеток как у Nodal^Δ600/LacZ, так и Cripto^-/- эмбрионов была более сходна с таковой у "distal" эмбрионов, чем с таковой у "anterior" эмбрионов. В противоположность "anterior" эмбрионам (но одинаково с "distal" эмбрионами), ни Nodal^Δ600/LacZ, ни Cripto^-/- эмбрионы не обнаруживали достоверных отличий в среднем количестве многоугольников между Epi-VE и соотв. ExE-VE (p>0.18, Student's t test) (Figure 1B). Частоты количеств многоугольников в этих двух регионах были также сходными (p>0.21, Kolmogorov-Smirnov test) (Figure S1E and F). Когда сравнивали с Epi-VE "anterior" эмбрионов, то Epi-VE соотв. стадии Nodal^Δ600/LacZ и Cripto^-/- эмбрионов обнаруживали достоверные отличия в среднем числе многоугольников (p<0.02, Student's t test) (Figure 1B') и в частотах количества многоугольников (p<0.03, Kolmogorov-Smirnov test) (Figure S2F, G, and H). Оба мут анта имели более низкую пропорцию четырехсторонних клеток и более высокую пропорцию 6-стороних клеток по сравнению с "migrating" и "anterior" эмбрионами (Figure S2H). Все эти данные подчеркивают специфическуют связь между AVE миграцией и изменениями в клеточной упаковке в Epi-VE...

Multi-Cellular Rosettes in the VE Increase in Number During AVE Migration

Rosettes Form by Cell Intercalation in the Epi-VE

Mathematical Modelling of AVE Migration

Rosettes Facilitate Coherent AVE Migration in Simulations of Migration

Rosette Formation Requires PCP Signalling

Discussion

Increase in Cell Packing Disequilibrium during AVE Migration

Перед миграцией AVE распределение количества углов клеток сравнимо в Epi-VE и ExE-VE, с пиком между 5 и 6 сторонами. Это распределение отличается от равновесного распределения, описанного Gibson et al. для разных эпителиев метазоа, которые имеют четкий пик для 6-сторонних клеток [28]. Одним из возможных объяснений этого отличия является то. что поскольку эпителии, рассматриваемые Gibson et al. все были довольно плоскими (Drosophila крыловой имагинальный диск, эпидермис хвоста Xenopus и наружный эпидермис Hydra), мышиный VE чрезвычайно сильно искривлен в среднем менее 20 по окружности приблизительно в 300 микрон. Это, по-видимому, накладывает иные ограничения на упаковку клеток в VE при сравнении с др. эпителиями.

Во время стадий миграции AVE среденее число углов снижается и распределение многоугольников сдвигается в направлении трех- и четырехугольных клеток, но только в Epi-VE (Figure 1B, B', and Figure S2H). Напротив в ExE-VE не обнаруживается заметного уменьшения среднего количества углов. Это согласуется с time-lapse данными, которые показывают, что Epi-VE и ExE-VE отличаются по своему поведению, первый подвергается большому количеству клеточного перемешивания одновременно с непрерывным изменением формы, тогда как последний относительно статичен [20]. Специфическая связь между миграцией AVE и изменениями в топологии эпителия подкрепляется с помощью Nodal^Δ600/LacZ и Cripto^-/- эмбрионов, у которых AVE неспособен мигрировать и в котором среднее количество углов в Epi-VE остается близким к таковому у эмбрионов дикого типа, у которых AVE не начал миграцию (Figure 1B and B').

Уменьшение среднего количества углов клеток также наблюдалось в Epi-VE культивируемых эмбрионов, где тот же самый набор VE клеток отслеживался во время миграции AVE. Это указывает на то, что уменьшение среднего числа углов обусловлено, по крайней мере частично, динамическими изменениями упаковки существующих VE клеток, участвующих на временной шкале 4 часов скорее, чем, напр., новых клеток с немногими краями клеток, возникающими в процессе деления. Снова изменение количества углов клеток ограничивается клетками Epi-VE, в соответствии с этим существует регион, который обладает лабильным поведением и которым миграция AVE клеток ограничена [20]. Эти находки подтверждают, что во время миграции AVE эпителий Epi-VE находится в состоянии повышенной неустойчивости (disequilibrium) в отношении клеточной упаковки.

Rosettes Aid in the Orderly Migration of the AVE

Мы обнаруживаем многоклеточные розетки в Epi-VE, поразительную конформацию клеток, которая существенно отклоняется от гексагональной упаковки, рассматриваемой как равновесная организация клеток эпителиев. В зародышевом диске Drosophila розетки, как было установлено, являются преходящими промежуточными образованиями широкого масштаба дальнодействующих скоординированных клеточных движений конвергентного удлинения [25]. Однако, отсутствуют движения конвергентного удлинения в VE мышей, а появляющиеся розетки, по-видимому, выполняют др. роль в данном контексте.

Достоверное увеличение розеток во время миграции AVE у эмбрионов дикого типа и уменьшение розеток у мутантов с неспособностью миграции AVE подчеркивают специфическую роль розеток в миграции AVE (Figure 3A). Это далее было подтверждено путем наблюдения, что розетки преимущественно обнаруживаются в Epi-VE, области the VE, которой ограничена мирация AVE. Однако, розетки не ограничены передним регионом Epi-VE, но более или менее случайно разбросаны по всему Epi-VE (Figure 3B), с единственным минимумом розеток (8%) в регионах, включающих какие-либо Hex-GFP позитивные AVE клетки. Это подтверждает, что розетки не участвуют специфически в управлении перемещениями AVE клеток или в детерминации направления, в котором они мигрируют, но играют более общую роль в Epi-VE во время миграции AVE.

Наша математическая модель предсказывает, что розетки важны для упорядоченной миграции, с которой клетки AVE мигрируют как взаимосвязанная (coherent) группа. Когда модели работают с небольшим числом розеток, то миграция AVE всё-таки происходит, но аномальным диспергированным образом. Только когда розеткам дозволяется формироваться, то миграция AVE делается более упорядоченной и сильно напоминает таковую у настоящих эмбрионов. Это подтверждается экспериментами с использованием ROSA26Lyn-Celsr1 мутантных эмбрионов, у которых нарушена передача сигналов PCP [20] и образуется достоверно меньше розеток. Такие эмбрионы обнаруживают миграцию AVE, но аномально беспорядочным образом. Розетки в VE мышей, следовательно, не важны для управления миграцией AVE (в смысле. что, как известно, они вносят вклад в конвергентное удлинение в зародышевом диске Drosophila ), но, по-видимому, выполняют подчиненную роль в модуляции миграции AVE, ток что она происходит стереотипическим упорядоченным образом.

AVE клетки, как было установлено, мигрируют в ответ на направляющие сигналы от Dkk1 [17]. AVE клетки мигрируют внутри интактного эпителиального слоя путем интеркаляции клеток [19],[20]. Не только AVE клетки обнаруживают подобное интеркаляционное поведение, но и также др. окружающие клетки в Epi-VE [20]. Это подтверждает, что интеркаляция среди AVE и не-AVE клеток в Epi-VE нуждается в координации, что позволяет AVE клеткам "negotiate" свой путь через поле Epi-VE клеток, чтобы достичь проспективной передней части. Наши time-lapse эксперименты показали, что розетки формируются в результате клеточной интеркаляции и что большинство клеток, участвующих в розетках, как полагают, в Epi-VE не являются AVE клетками. Передача сигналов PCP активна в Epi-VE и влияет на миграцию AVE [20]. Если передача сигналов PCP нарушена, обнаруживается достоверно меньше розеток, хотя AVE всё ещё мигрирует (хотя аномально), подтверждая, что образование розеток не является пассивной реакцией iна миграцию AVE, а активно зависит от передачи сигналов PCP.

Мы интерпретировали эти результаты, чтобы предложить следующую рабочую модель миграции AVE. Хотя AVE клетки мигрируют в ответ на внешние сигналы наведения, и поскольку они мигрируют через интактный эпителий, то эти движения осуществляются посредством клеточной интеркаляции, которая скоординирована между мигрирующими AVE клетками и окружающими не-AVE клетками. Мы полагаем, что роль передачи сигналов PCP в Epi-VE координирует эту интеркаляцию, по крайней мере, частично, посредством образования розеток. Мы полагаем, что облегчение надлежащим образом миграции AVE за счет буферизации увеличивает неустойчивость клеточной упаковки в Epi-VE, что сопровождается направленным перемещением AVE клеток. В соответствии с этим мнением, после миграции AVE среднее количество углов клеток у эмбрионов с нарушенной передачей сигналов PCP достоверно ниже, чем на эквивалентной стадии в Epi-VE эмбрионов дикого типа, это указывает на повышение эпителиальной неустойчивости (disequilibrium) в отсутствие розеток.

Как образование розеток может буфферизировать неустойчивость клеточной упаковки в Epi-VE? Одна возможность заключается в том, что это позволяет не-AVE клеткам образовывать группы совместно и вести себя как сигнальные единицы, которые каким-то образом облегчают AVE клеткам миграцию через VE эпителий. Хотя мы наблюдали несколько розеток, образующихся в экспериментах time-lapse, мы не наблюдали какого-либо распада розеток. Это указывает на то, что или однажды сформированные они довольно статичны или что они распадаются на др. временной шкале, чем та на которой они образуются. Плотность розеток у 6.5 dpc эмбрионов (приблизительно 20 ч после миграции AVE) достоверно ниже, чем у "anterior" эмбрионов, но это обусловлено достоверным увеличением размера эмбриона между этими двумя стадиями скорее, чем снижением числа розеток. В целом 6.5 dpc эмбрионы имеют достоверно более высокое среднее количество розеток на эмбрион по сравнению с "anterior" эмбрионами (Figure S4), согласуется с этим и то, что розетки, сформированные во время миграции AVE могут накапливаться скорее, чем распадаться. Детальное исследование динамики розеток поможет понять, как в точности розетки помогают упорядоченной миграции AVE клеток, каковы механистические основы их образования и как они устраняются. Недавние разработки технологий высокого разрешения, low photo-damaging imaging, такие как микроскопия тонких листков [39],[40] теперь позволяют осуществлять мониторинг клеточных движений на поверхности цилиндрического эмбриона в расширенной временной шкале и может помочь в решении этих вопросов.

Modelling Cell Movements in Epithelia

В противоположность движениям конвергентного удлинения, когда все клетки подвергаются скоординированной медио-латеральной интеркаляции, ведущей к удлинению ткани, во время миграции AVE субнабор клеток мигрирует направлено внутри более крупного поля клеток, которое подвергается клеточным перестройкам без существенных изменений в общей форме эпителия. Поскольку VE организован как цилиндр, то представлена соотв. модель для изучения клеточных движений в др. эпителиях на удлиняющейся искривленной поверхности, такой как зачатки легких, уретрические зачатки или развивающиеся ворсинки кишечника.

Наша математическая модель клеточных движений в VE, в комбинации с экспериментальными вмешательствами, предоставляет мощный инструмент для изучения направленных клеточных движений внутри эпителия. Она строится на простых предположениях, объединенные силы, действующие на клетки, клеточные деления, направленное движение субнабора клеток, поведенческий "barrier" миграции и способность клеток перестраиваться, чтобы формировать розетки. Хотя клетки в нашей модели имеют объем и высоту, они не полностью 3-D, в том смысле, что силы действуют только на апикальную поверхность и не учитывается тот факт, что соседние клетки могут иметь др. высоту. Поскольку были получены дальнейшие биологические данные, 3-D vertex модели, такие как у Honda et al. [41] могут стать желательными для изучения клеточной динамики эпителиев, таких как VE. Однако, представление ткани как 2-D слоя, как это мы делаем сегодня, безусловно информативно для изучения роли розеток, образования "полумесяца", когда клетки, расположенные впереди AVE, противостоят ExE-VE, уменьшения среднего количества углов клеток во время миграции и аномально широкой миграции AVE клеток, когда розеткам не позволяют сформироваться. Эти возникающие поведения усиливают потенциал нашей модели как инструмента для исследования клеточной миграции в VE и др. эпителиях.