Как специфические гены и сигналы действуют на первоначально идентичные клетки, чтобы генерировать разные ткани тела, остается центральным вопросом генетики развития. Рыбки данио являются удобной модельной системой, для подхода к этому вопросу из-за оптической прозрачности эмбрионов, позволяющей непосредственно наблюдать изображения формирующихся тканей, прослеживать индивидуальные клетки в мириадах различных генетических контекстов. Миотомы рыбок данио, компартменты эмбриона, которые дают скелетные мышцы, подразделены на ряд специфических типов клеток-одним из которых являются , adaxial клетки, дающие исключительно мышцы "slow twitch" класса. Адаксиальные клетки дают два типа медленно сокращающихся мышц, мышечные пионерские клетки и не-мышечные пионерские медленные клетки, отличающиеся экспрессией генов и разным клеточным поведением. Здесь мы использовали слежение клонов у живых эмбрионов и манипуляции с разными генетическими путями, чтобы продемонстрировать, что адаксиальные клетки наделяют клеточной судьбой "эквивалентную группу", которая специфицируется, используя разные сигнальные пути, которые оперируют в разных измерениях.

Механизмы, которые используются для генерации индивидуальных типов клеток из набора с эквивалентной судьбой предшественников остаются основным экспериментальным фокусом биологии развития. Исследования систем беспозвоночных определили концепцию эквивалентных групп, где небольшие кластеры из клонов родственных клеток детерминированы за счет комбинации индуктивных и внутренне присущих сигналов, чтобы воспринять индивидуальные судьбы [1]-[6]. Эта концепция сталкивается со многими трудностями, когда применяется к сложной трехмерной ткани, такой как те, что служат типичным образцом для развития позвоночных, где прямые клональные взаимоотношения множественных клеток остаются плохо определены и усложненный морфогенез многих тканей мешает определению моделей эквивалентности.

Рыбки данио вообще-то предоставляют один из наиболее трактуемых контекстов, в котором проверка концепции детерминации судьбы клеток у эмбрионов позвоночных может быть исследована в реальном времени внутри оптически прозрачных эмбрионов. Один клон рыбок данио, который был исследован довольно детально это эмбриональный миотом. Как и у всех позвоночных большинство скелетных мышц у рыбок данио формируется из клеток предшественников, присутствующих в сомитах, которые возникают за счет сегментации параксиальной мезодермы в ростро-каудальном направлении по сторонам нервной трубки и хорды вдоль основной оси тела эмбриона. Этот процесс, обозначаемый как миогенез, дает отличающиеся медленно и быстро сокращающиеся мышечные популяции, которые отличаются скоростью сокращений, метаболической активностью и иннервацией двигательными нейронами. У рыбок данио расположение и возникновение этих двух разных клеточных популяций топографически разделено [7], [8]. Ранняя дифференцировка клеток медленных мышц возникает из определенного субнабора пресомитных мезодермальных клеток, наз. адаксиальными клетками, которые в конце гаструляции располагаются медиально напротив хорды [8]. Эти предшественники первоначально воспринимают псевдо эпителиальную морфологию, но вскоре после их включения в формирующиеся сомиты, подвергаются стереотипическим морфогенетическим изменениям клеточной формы, двигаясь от их столбчатой формы к плоской и прослаивающей, принимая треугольную форму, которая после дальнейшей дифференцировки дает одиночные адаксиальные клетки, распространяющиеся от одной границы сомита к др. Эти клетки коллективно уплощаются медио-латерально, чтобы сформировать набор удлиняющихся миоцитов, которые соединяют ту часть сомита, которая располагается напротив хорды [9].

В конечном итоге адаксиальные клетки дают два разных подтипа волокон медленных мышц: superficial slow-twitch muscle fibers (SSFs) и muscle pioneer cells (MPs). SSFs и MPs обладают разными морфологическими, молекулярными и функциональными свойствами. После того, как они подвергаются изменениям инициальной клеточной формы, описанной выше, SSFs мигрируют из своей позиции средней линии, ассоциированной с хордой, чтобы пересечь всю протяженность формирующегося миотома и оказаться лежащим на его наиболее латеральной поверхности. Здесь SSF предшественники завершают свою дифференцировку, чтобы сформировать монослой приблизительно из 20 медленно сокращающихся мышечных волокон. Напротив, MPs (2 - 6 на сомит) не мигрируют от срединной линии и являются первыми клетками миотома рыбок данио, которые дифференцируются, давая медленно сокращающиеся мышечные волокна, непосредственно соседствующие с хордой [10]. Все медленные волокна экспрессируют медленную изоформу slow isoforms of myosin heavy-chain (SMyHC), а также гомеодоменовый белок Prox1 и являются одноядерными клетками [11]. MPs, кроме того, экспрессируют высокие уровни гомеодомен содержащих Engrailed белков [12], [13]. В противовес медленным предшественникам, дифференцирующиеся в быстрые предшественники возникают из латеральной части сомита и сливаясь формируют многоядерные волокна, после миграции SSF, и отличаются свой экспрессией быстрых MyHC. Субнабор этих волокон, известных как medial fast fibers (MFFs) также экспрессирует Engrailed на более низких уровнях, чем MPs [14]. Время детерминации судеб этих разных типов клеток был исследован с помощью строгих in vivo трансплантаций. Путем взаимного обмена между медленными и быстрыми мышечными предшественниками в специфические моменты своего развития было продемонстрировано во время гаструляции медленные и быстрые предшественники уже пространственно разделены, они остаются недетерминированными к своей окончательной судьбе вплоть до тех пор, пока они не вступят в сегментную пластинку. Более того, подразделение адаксиального компартмента на MP и не MP клеточные судьбы происходит в сходный период развития, при этом MP оказываются детерминированы необратимо в задней части сегментной пластинки во время раннего формирования сомитов [7].

У позвоночных спецификация и дифференцировка сомитов в специфические типы клеток находится под действием индуктивных сигналов от самих сомитов или от окружающей их ткани (rev. [15], [16]). В случае миогенеза у рыбок данио, наиболее хорошо изученными индуктивными сигналами, контролирующими миогенез, является семейство Hedgehog (HH) секретируемых гликопротеинов, которые испускаются эмбриональной срединной линией. Многочисленные исследования в последние две декады продемонстрировали, что HH необходим и достаточен для индукции судьбы медленно сокращающихся мышц. В самом деле, анализ мутантов с потерей функции генов пути HH и использование ингибитора пути HH cyclopamine продемонстрировали, что время и уровни передачи сигналов HH являются критическими для формирования разных мышечных характеристик, включая MP клетки, которые нуждаются в высочайшем уровне передачи сигналов HH для своего образования [14], [17]-[19]. Однако, даже при избыточной экспрессии HH для индукции избыточного количества MP клеток, этого оказалось недостаточно, чтобы превратить дорсальные и вентральные крайние члены миотома в MP клетки [20], [21] это указывает на то, что др. сигналы д. индуцировать MP в области срединной линии или репрессировать MP дифференцировку в дорсальных и вентральных мышечных клетках [21].

Дальнейшим осложнением этого анализа является то, что они неспособны объяснить, как симметрия компартмента адаксиальных клеток первоначально нарушается, чтобы породить дихотомию судеб MP и SFF клеток внутри эквивалентных наборов клеток. Т.к. адаксиальные клетки лежат по бокам хорды и донной пластинки нервной трубки, источника секреции пептида HH, все адаксиальные клетки первоначально подвергаются действию одного и того же уровня секретируемых HH пептидов. Поэтому неясно, как разные уровни HH могут действовать, чтобы генерировать судьбу MP клеток внутри субнабора адаксиальных клеток и было предположено, что дополнительные сигналы должны влиять на предопределение судьбы адаксиальных клеток. Недавнее исследование пролило свет на природу др. секретируемых сигналов, которые могут действовать, чтобы повлиять на формирование мышечных клеток. Некоторые исследования показали, что манипуляции с передачей сигналов BMP могут менять количества MP клеток [21], [22]. Более того, Smad5, нижестоящий эффектор передачи сигналов BMP, как было установлено, активируется в дорсальных и вентральных адаксиальных клетках и отсутствует внутри центральной области сомита [22], [23]. Кроме того, сайты связывания Smad, как было установлено, регулируют активность промотора eng2a, ген eng экспрессируется в самых ранних предшественниках MP [12], [21]-[23]. Итак, эти исследования позволили предположить, что передача сигналов BMP может влиять на количества разных типов клеток внутри эмбрионального миотома рыбок данио, но в точности, как это осуществляется пока не установлено механистически.

В данном исследовании мы использовали комбинацию получения изображений вживую, ретроспективное и показательное картирование судеб, молекулярные и генетические исследования, чтобы продемонстрировать, что MP и SSF предшественники возникают из разных регионов вдоль передне-задней (AP) и дорсо-вентральной (DV) осей компартмента адаксиальных клеток. Однозначно, что эта регионализация контролируется действием разных путей сигнальной трансдукции, которые действуют специфически, чтобы управлять спецификацией в разных осевых измерениях. Мы продемонстрировали, что sprouty4-обусловленное ингибирование передачи сигналов FGF индуцирует судьбу клеток MP в наиболее передних адаксиальных клетках каждого сомита и что radar-обусловленная передача сигналов BMP ограничивает эту судьбу срединой DV оси. Наши результаты показывают, что передачи сигналов HH, FGF и BMP действуют синергично, чтобы детерминировать клеточные судьбы внутри эквивалентной группы адаксиальных клеток.

Superficial slow twitch muscle and muscle pioneer precursors arise from distinct locations within the adaxial compartment

FGF signaling controls the AP positioning of muscle pioneer precursors

FGF signaling patterns the adaxial cells independently from HH signaling

Sprouty4 controls muscle pioneer fate specification through FGF signal inhibition

Radar-mediated Bmp signaling coordinates MP and SSF fate specification synergistically with FGF signaling

FGF and BMP signaling independently coordinate specification of adaxial cells in the AP and DV planes

Discussion

A fate map for the HH-dependent adaxial cell compartment

В начале сегментации все адаксиальные клетки являются столбчатой формы подобными эпителию предшественниками, которые располагаются медиально вдоль хорды и не обнаруживают морфологической асимметрии. С помощью инициально предпринятого анализ карт судеб всего формирующегося миотома мы определили компартмент адаксиальных клеток как группу клеток с эквивалентной судьбой, которая предопределяет две специфические клеточные судьбы медленно сокращающихся мышц, MPs и SSFs. Далее механистически мы определили, как эти предшественники индуцируются, чтобы давать две отличающиеся популяции. Адаксиальные клетки дифференцируются асинхронно внутри вновь сформированного сомита, при этом клетки, соседствующие с передней границей сомита, располагаются в средней точке DV оси сомита, они первыми начинают морфогенетические и дифференцированные движения [9]. Эта морфогенетическая асимметрия зеркально отражается на молекулярном уровне, когда те же самые клетки подвергаются преждевременной дифференцировке, то одновременно инициируют экспрессию специфичного для MP маркерного гена eng2a. Этот анализ подтверждает, что эти клетки являются предшественниками MP клеток. Чтобы исследовать этот вопрос непосредственно мы построили карту судеб адаксиального компартмента и нашли, что каждый тип волокон медленных мышц (SSF и MP) возникает из специфического региона массива адаксиальных клеток. Так, передние адаксиальные клетки в средней точке DV оси сомита дают MP внутри срединной линии, а не-MP предшественники адаксиальные клетки идут на формирование SSF палисада на боковой поверхности миотома в прямом топографическом отражении своего положения в премиграторном адаксиальном компартменте. Эти данные показывают, что как дорсо-вентральные, так и передне-задние качественные особенности д. быть предопределены скоординировано внутри группы эквивалентности адаксиальных клеток для корректной детерминации клеточных судеб.

Предыдущий анализ показал, что передача сигналов HH необходима для спецификации адаксиальных клеток перед началом сегментации и что уровни HH влияют на судьбу этих клеток [7], [14], [18]. Однако в отсутствие передачи сигналов HH клетки с явственной морфологией всё ещё образуются по соседству с хордой, демонстрируя, что не не все аспекты морфогенеза адаксиальных клеток контролируются с помощью сигнальной трансдукции HH [7]. В отсутствие активации сигнала HH, активируется профиль, характерный для быстро сокращающихся мышечных генов в этих клетках вместо генов, характерных для клона медленных мышц. Соотв., эти клетки дифференцируются как экспрессирующие быстрый MyHC, эти клетки случайным образом рассеиваются по всему миотому [7]. Несмотря на способность передачи сигналов HH контролировать детерминацию судеб медленных мышц, три HH лиганда, экспрессируемые в эмбриональной срединной линии (ehh/ihhb, shh/shha, twhh/shhb) [12], [20], [46], [47] не ограничены передне-задним направлением и нет каких-либо указаний, что HH гены мишени асимметрично активируются внутри формирующегося компартмента адаксиальных клеток или в передне-заднем или дорсо-вентральном направлении. Более того, не было найдено также изменчивости по длине первичных ресничек в адаксиальных клетках, также и модуляции экспрессии генов мишеней для HH в адаксиальных клетках. Т.о., модель вовлечения разных регуляторов клеточных судеб необходимо привлечь для концептуальной генерации судеб MP из наиболее передних клеток по дорсо-вентральной срединной линии эквивалентной группы адаксиальных клеток.

A lack of FGF signaling in anterior adaxial cells induces MP fate

Многие исследования изучали роль передачи сигналов FGF во время миогенеза in vitro, при этом было показано, что она способствует пролиферации клеток и репрессирует дифференцировку миобластов. Было показано, что ранние предшественники миобластов нуждаются в FGF для того, чтобы затем экспрессировать свой миогенный фенотип [48], [49]. Однако несмотря на эти обширные исследования in vitro точная функция Fgf в активации или репрессии мышечной дифференцировки in vivo противоречива и, по-видимому, часто противоречит простой репрессирующей роли, выявляемой in vitro [50]. Напр., Fgf8-обеспечиваемая передача сигналов у рыбок данио, как было установлено, управляет терминальной дифференцировкой быстро сокращающихся, но не медленно сокращающихся мышечных волокон и одновременно контролирует также пролиферацию слоя внешних клеточных предшественников, эквивалентных дермомиотому амниот [25], [51]. У эмбрионов амниот передача сигналов FGF участвует в миогенезе in vivo, способствуя как пролиферации клеток предшественников [52] так и их дифференцировке [53], [54]. У эмбрионов кур большинство, если не все, реплицирующиеся миобласты присутствуют внутри скелетных мышечных масс конечностей, они экспрессируют высокие уровни FGF рецептора FREK/FGFR4 , а ингибирование FgfR4 ведет к драматической потере мышц конечностей [54], [55]. Напротив, избыточная экспрессия FGF в сомитах эмбрионов кур ведет к мышечной дифференцировке, подтверждая, что как и у рыбок данио в латеральной части миотома миогенная дифференцировка позитивно контролируется с помощью передачи сигналов FGF [25], [54]. Это согласуется с наблюдениями у мышей, у которых эктопическая экспрессия клеточно автономного негативного регулятора передачи сигналов FGF sprouty2 в миогенных предшественниках ингибирует их дифференцировку [53].

Здесь мы также показали, что путь FGF играет роль в формировании мышц, но он стоит ниже зависимого от HH процесса спецификации медленно сокращающихся волокон. FGF передача сигналов является асимметрично активируемой в адаксиальных клетках. В частности, внутри передних адаксиальных клеток она сильно редуцирована, подчеркивая полное ингибирование специфических FGF генов мишеней. Мы показали, используя комбинацию генетических и фармакологических подходов, что подавление пути FGF способствует образованию MP за счет SSFs внутри компартмента адаксиальных клеток. Это, по-видимому, не управляется за счет ограничения экспрессии FGF лигандов, поскольку FGF кодирующие гены, Fgf8a и Fgf17, оба расположены в передней части сомита [25]. Скорее передача сигналов FGF в передних адаксиальных клетках ингибируется с помощью клеточно автономного негативного регулятора каскада передачи сигналов FGF, spry4 [30]. Экспрессия spry4 индуцируется с помощью передачи сигналов FGF и, как было установлено, участвует в негативной петле обратной связи на FGF пути в ряде контекстов (это показано здесь и [27], [31]). Непосредственная роль spry4 в формировании MP продемонстрирована данными, которые показывают, что эктопическая экспрессия spry4 в адаксиальных клетках индуцирует MPs, тогда как его инактивация у spry4 мутантных эмбрионов ингибирует эти судьбы. Следовательно, наши результаты подтверждают модель, согласно которой spry4 активируется внутри передней части компартмента адаксиальных клеток в ответ на высокие уровни FGF лигандов по соседству, это в конечном итоге супрессирует передачу сигналов FGF внутри этих клеток и тем самым нарушает эквивалентность в передне-заднем направлении. Эта роль, по-видимому, аналогична той, которую выполняет передача сигналов FGF во время органогенеза скорее, чем та, что выявлена выше для миогенеза, где судьба различных стволовых клеток и клеток предшественников разделяется за счет активации или ингибирования передачи сигналов FGF в органах столь отличных, как печень и поджелудочная железа [56], ухо [57], [58] и зубы [59] часто в сочетании с противоположными сигналами, детерминирующими клеточные судьбы, включая передачу сигналов BMP.

BMP signaling determines dorso-ventral identity of the adaxial cell equivalence group

Поскольку передача сигналов FGF ограничивает судьбу адаксиальных клеток наиболее передними клетками миотома, то необходим второй сигнал для ограничения позиции этих клеток в дорсо-вентральном направлении. Недавнее исследование продемонстрировало, что нижестоящий эффектор передачи сигналов BMP, p-Smad5 специфически ограничивает дорсальные и вентральные адаксиальные клетки, и отсутствует в клетках дорсо-вентральной срединной линии миотома [22], [23]. Более того, некоторые предыдущие исследования показали, что манипуляции с передачей сигналов BMP могут влиять на количество позитивных по engrailed MPs [21], [43]. В самом деле, эктопическая экспрессия Dorsalin-1 эмбрионов кур, члена BMP-подобного семейства, в хорде рыбок данио ингибирует развитие MP [21]. недавние исследования показали, что ингибирование BMP за счет использования низкомолекулярного ингибитора Dorsomorphin, или morpholinos против BMP рецептора bmpr1ba, приводит к увеличению MPs [22], [23]. Однако в точности, как BMP влияет на образование этих подтипов мышц остается неясным. Здесь мы показали, что судьбы адаксиальных клеток специфицируется по DV оси с помощью radar-обусловленной передачи сигналов BMP. Это утверждение подкрепляется несколькими линиями доказательств. Во-первых, линия трансгенного репортера, специфичного для передачи сигналов BMP показывает, что в начале сегментации передача сигналов BMP активна в большинстве дорсальных и вентральных адаксиальных клеток, но отсутствует в средней точке DV формирующегося миотома. Этот регион низкой BMP активности коррелирует с локализацией спецификации MP предшественников, что специфически установлено с помощью анализа картирования судеб. Во-вторых, передача сигналов BMP обеспечивается с помощью gdf6a/radar в адаксиальных клетках, а нокдаун активности BMP модифицирует судьбу мышечных предшественников в адаксиальном компартменте и способствует образованию MP зависимым от дозы способом.

Предыдущий анализ активности передачи сигналов BMP во время формирования мышц у амниот предоставил доказательства, что она негативно регулирует миогенную программу [60], [61] её роль, по-видимому, также важна для контроля пролиферации и начала миогенеза внутри слоя наружных клеток предшественников миотома рыбок данио [62]. Однако в контекста адаксиальных клеток она, по-видимому, не влияет на пролиферацию этих предшественников, время вступления этих клеток в миогенез или дифференцировку самих адаксиальных клеток. Наш клональный анализ специфически иллюстрирует, что она изменяет судьбу этого компартмента предшественников.

The activities of the HH, FGF, and BMP signaling pathways specify MP identity

В данном исследовании мы показали, что в противовес сигнальной трансдукции HH передача сигналов FGF и BMP не оказывает влияния на судьбу медленных мышц, но вместо этого регулирует принятие решений адаксиальными клетками предшественниками стать или SSF или MP клетками. В самом деле, как указывалось выше, активация этих сигнальных путей способствует образованию SSF, тогда как их снижение или отсутствие способствует образованию MP. Модуляция сигналов FGF или BMP не влияет на передачу сигналов HH и поэтому последствия их нокдауна на адаксиальную судьбу являются аддитивными (this study and [22]). Сходным образом манипуляции с уровнем передачи сигналов HH (мутации в пути передачи сигналов HH или воздействие cyclopamine) не затрагивают паттерна экспрессии phospho-Smad 5, показывая, что передача сигналов HH не влияет на клеточную судьбу косвенно через передачу сигналов BMP [22], [23]. Т.о., FGF и BMP сигналы действуют независимо от и синергично с др. др., чтобы контролировать дихотомию SSF/MP клеточных судеб. Интересно, что действие FGF и BMP необходимо для индукции специфической мышечной клеточной судьбы, предшественников Pax7-позитивных сателлитных клеток в анимальной шапочке Xenopus [63]. Это подтверждает, что синергичное действие BMP и FGF может оперировать, чтобы специфицировать др. типы мышечных клеток.

Поскольку передача сигналов HH и BMP, как было установлено, координируют в детерминации судьбы клеток нервной трубки эмбрионов кур [64] и передача сигналов HH, BMP и FGF коллективно участвуют в спецификации многочисленных типов клеток у позвоночных и беспозвоночных, большинство этих исследований не исследовало судьбу индивидуальных клеток в реальном времени. Онтогенетический пример адаксиальных клеток позволяет метить одиночные клетки и прослеживать детерминацию их судьбы в генетически определенной группе эквивалентных клеток в живом организме. Поэтому мы верим, что наше исследование позволяет предположить, что адаксиальные клетки рыбок данио могут предоставлять пример эквивалентной группы клеточных судеб у позвоночных, точно также как у Drosophila нейроэктодерма, парасегменты и имагинальные диски и у C. elegans вульва [1]-[6], которые предоставляют изящное клеточное и генетическое решение по получению детального знания механизмов клеточной спецификации внутри систем беспозвоночных.

Наши результаты также демонстрируют интегрированную сигнальную среду, которая координирует спецификацию судеб мышечных клеток внутри компартмента адаксиальных клеток. Пул адаксиальных клеток инициально специфицируется в регион сомита, соседствующий с хордой за счет сигнальной трансдукции HH от эмбриональной срединной линии. Это вместе с региональным ингибированием FGF в наиболее передних адаксиальных клетках и отсутствием передачи сигналов BMP в средней точке DV сомита, создает 3-Dimensional сеть сигналов, которые ограничивают судьбу MP наиболее передними клетками внутри специфической группы эквивалентных клеток в развивающемся миотоме (Figure 9). Эти сигналы действуют независимо др. от др., чтобы детерминировать судьбу и уникальную спецификацию MP, контролируемую с помощью действия разных путей сигнальной трансдукции, которые действуют специфически, чтобы управлять спецификацией в разных аксиальных измерениях. Это по существу Cartesian система детерминации клеточных судеб до некоторой степени напоминает ту, которая разворачивается во время развития вентрального нервного тяжа Drosophila , где сложная серия паттерн-формирующих генов создает градиенты вдоль DV и AP осей, чтобы индуцировать специфические детерминирующие судьбы гены внутри индивидуальных нейробластов внутри слоёв нейроэктодермы [3], [4], [5]. Однако в случае адаксиальных клеток нет доказательств роли латерального ингибирования, которое в вентральной нейроэктодерме дрозофилы необходимо для экспрессии индивидуальных пронейральных генов и адаптации специфических судеб [4], [5]. Более того, наши результаты показали, что индивидуальные секретируемые сигналы действуют в специфических измерениях внутри этой декартовой системы координат скорее, чем кооперативным или действительно исключительным способом, чтобы специфицировать клеточные судьбы, превалирующим способом, с помощью которого клетки детерминируются в системах позвоночных.

Figure 9. Model of the synergic action of FGF and BMP signaling on adaxial cell specification. The diagram represents the adaxial compartment in the zebrafish somite, adjacent to the notochord (n), at the beginning of segmentation. The anterior-posterior (A/P) and dorsal-dentral (D/V) axes are shown. The adaxial cell pool is initially specified by HH signal transduction from the embryonic axial structure. Spry4-mediated regional inhibition of FGF restricts the MP fate to the most anterior adaxial cells. By contrast, the absence of Radar-mediated-BMP signaling at the dorso-ventral mid-point of the somite restricts MP fate at the dorso-ventral mid-point of the myotome. The combination of the three signals forms a 3-D patterning system that coordinates the specification of adaxial cells into muscle pioneer cells and superficial slow fibers.