Во время эмбрионального развития эндотелиальные клетки (ECs) собираются в древообразные тубулярные сети из кровеносных сосудов, которые в конечном счете обеспечивают транспорт жидкостей, питательных веществ, циркулирующих клеток, гормонов и снабжают почти все ткани по всему телу позвоночных (Fig. 1). Созрев сосудистая система состоит из сложной иерархической системы артерий, артериол, капилляров, венул и вен, которые способствует циркуляции оксигенированной крови между сердцем, легкими и тканями мишенями. Несмотря на сложность сосудистой системы, в действительности все кровеносные сосуды, которые образуются во время развития и роста возникают благодаря отрастанию новых капилляров от уже существующих сосудов, в результате процесса ангиогенеза. Более того, дисбаланс в ангиогенезе вносит вклад в патогенез многочисленных болезненных состояний1. Напр., недостаточность ангиогенеза является принципиальным фактором, ограничивающим восстановление ткани при ишемической болезни, тогда как стимуляция ангиогенеза раковыми клетками способствует образованию новых сосудов в опухоли, её росту и прогрессированию с помощью метастазов. Клинические успехи при манипулировании патологическим ангиогенезом, механизмами, контролирующими этот процесс, привлекают большое внимание к исследованиям сосудов в последнее время1.
Мы ограничим нашу дискуссию недавними разработками, которые изменили наше мнение о ранних морфогенетических событиях в ангиогенезе. Ангиогенез представляет собой пример для многих важных биологических процессов, таки как ветвление ткани, направленная клеточная миграция и образование просвета, каждый из которых выполняет далеко идущие роли в морфогенезе многих др. систем органов.
Vascular development and angiogenesis
Формирование de novo эмбриональных кровеносных сосудов (vasculogenesis) использует дифференцировку, миграцию и слияние эндотелиальных предшественников (ангиобластов), производных мезодермы, чтобы создавать примордиальную сосудистую сеть1, 2 (Fig. 1). Непосредственно после васкулогенной сборки кровеносных сосудов, ECs подвергаются спецификации или в артериальную или венозную судьбу в ответ на комбинацию гемодинамических стимулов и лежащих в основе генетических факторов2, 3. Напр., Notch-обусловленная экспрессия hairy- and enhancer of split-related with YRPW motif (HEY) генов basic helix-loop-helix транскрипционных факторов, HEY1 и HEY2, способствует дифференцировке артерий7, 8. Напротив orphan nuclear receptor COUP transcription factor 2 может репрессировать передачу сигналов Notch, чтобы способствовать дифференцировке в вены9. Последующее ангиогенное ремоделирование этих артериальных и венозных тканей и экстенсивная экспансия примитивной сети ведет к образованию сложной функциональной сосудистой системы1, 2. Позднее в развитии сосуды, которые возникают с помощью ангиогенеза могут также воспринимать разные сосудистые, ложе-специфические функциональные специализации в ответ на локальные, продуцируемые тканью сигналы2, 3 (Fig. 1). Кроме того, венозный эндотелий дает слепо оканчивающуюся сеть (т.е., закрытую с одного конца) из лимфатических сосудов, которые собирают и возвращают лимфу обратно в сосудистую сеть4. Т.о., ECs обнаруживают удивительную пластичность давать сосуды с разными функциональными, морфологическими и молекулярными признаками3. Более того, субнабор 'haemogenic' артериального эндотелия генерирует дефинитивные гематопоэтические стволовые клетки, которые дают начало взрослой гематопоэтической системе10. Следовательно, морфогенез сосудов не только дает зрелую сосудистую сеть, но и также влияет на образование и функцию разного ранга жизненно важных тканей.
Cellular mechanisms of angiogenesis. Образование кровеносных сосудов с помощью ангиогенеза это сложный многоступенчатый процесс, который очень нуждается в тонком контроле и координации поведения EC (Fig. 2). В стабильных сосудах ECs обычно образуют булыжник-подобный монослой из неактивных клеток, которые выстилают поверхность просвета сосудистых трубок11. Этот пассивный фенотип поддерживается до тех пор, пока ECs не получат про-ангиогенные сигналы, которые вызывают фундаментальные изменения их поведения. В ответ на ангиогенные сигналы ECs теряют свои межклеточные соединительные контакты, активируют протеазы. которые деградируют окружающую базальную мембрану и приобретают чрезвычайно инвазивное и подвижное поведение, чтобы начать ответвление нового кровеносного сосуда1, 2 (Fig. 2b). Напр., нарушение передачи сигналов angiopoietin 1 (ANG1) посредством TIE2 (также известного как TEK) рецепторной Tyr киназы с помощью антагонистаANG2, как полагают, дестабилизирует сосуды и играет ключевую роль во время раннего ангиогенного ремоделирования сосудов (this is covered in another review12). Важно, что ECs, которые воспринимают ангиогенные стимулы, отбираются лишь в небольшой пропорции, чтобы давать новое ответвление сосуда. Эти эндотелиальные 'tip cells' (TCs) испускают многочисленные динамичные филоподиальные выпячивания, которые ощущают и реагируют на притягивающие или отталкивающие сигналы наведения в их непосредственном микроокружении13, 14. Следовательно, TCs обладают многими морфологическими и функциональными сходствами с ростовыми конусами нейронов, которые наводят аксоны15. Напротив, ECs , которые следуют за TCs ('stalk cells' (SCs)), менее подвижны, но важны для поддержания удлинения отрастающего сосуда, создавая тело нового капилляра и поддерживая связь с родительским сосудом. Более того, SCs, как полагаю, устанавливают просвет в вырастающем сосуде2, 16, 17 (Fig. 2c). Такое подразделение отрастающих ECs на ведущие TCs и следующие за ними SCs очень похоже на иерархическую организацию эпителиальных TCs и SCs во время морфогенеза ветвления трахей у Drosophila melanogaster18.
Начавшись ответвление EC продолжается четко направляемым способом вплоть до того, пока TCs не придут в соприкосновение с соседними сосудами и не создадут анастомоз, это ведет к слиянию контактирующих сосудов (Fig. 2c). При контакте с ECs, TCs теряют свой подвижный фенотип, генерируют соединения между EC-EC и сливаются с реципиентным сосудом, чтобы сформировать непрерывный незакупоренный (или patent) просвет, который делает возможным кровоток. хотя наше понимание процессов анастомоза довольно ограничено, ясно, что др. типы клеток также могут влиять на слияние сосудов. В частности, определенные популяции макрофагов могут действовать как клеточные шапероны, которые способствуют анастомозу сосудов
19. Более того, использование др. дополнительных клеток является критическим фактором в последующем созревании этих образующихся сосудов. Факторы, такие как platelet-derived growth factor B (PDGFB) и transforming growth factor-β1 (TGFβ1), рекрутируют муральные клетки (перициты и сосудистые гладкомышечные клетки) в развивающуюся сосудистую сеть, это стабилизирует стенки сосудов
2, 5, 6 (Box 1). Более того, отложение базальной мембраны на поверхности, противоположной просвету и укрепление межклеточных соединений супрессирует поведение отрастания EC и восстанавливает зрелый молчащий фенотип (Fig. 2d). Последующие раунды ангиогенеза, затем делают возможной дальнейшую экспансию сосудистой сети. Кроме того, intussusceptive инсерция столбиков ткани в просвет кровеносного сосуда способствует расщеплению сосудов и обеспечивает дополнительное ремоделирование уже существующей сосудистой сети
20. Однако, молекулярный механизм intussusceptive ангиогенеза остается неясным. Одновременно е обрезание ненужных сосудов делает возможным общее ремоделирование этой активно растущей сети в зрелое сосудистое русло.
Box 1 | Endothelial cell-mural cell interactions
VEGF stimulates angiogenic sprouting. Несколько главных сигнальных путей контролируют поведение EC во время ангиогенного отрастания, включая передачу сигналов TIE2 и Notch (Fig. 3a), это обеспечивается передачей сигналов рецепторов наведения аксонов, которые экспрессируются в ECs (Fig. 3b). Однако, секретируемый фактор роста vascular endothelial growth factor A (VEGFA; также известный как vascular permeability factor (VPF)) является принципиальным мастером регулятором отрастания новых кровеносных сосудов во время развития, роста и болезней21-23 (Fig. 3a). VEGFA является наиболее охарактеризованным членом семейства гомодимерных гликопротеинов, которое включает placental growth factor (PLGF), VEGFB, VEGFC и VEGFD21-23. Во время ангиогенеза VEGFA соединяется с соотв. рецепторной Tyr киназой, VEGF receptor-2 (VEGFR2; также известным как KDR и FLK1), и активирует множественные нижестоящие пути путем передачи сигналов промежуточных медиаторов, таких как mitogen-activated protein kinases (MAPKs), phosphoinositide 3-kinases (PI3Ks), AKT, phospholipase Cγ и малые GTPases21-23. Как результат, передача сигналов VEGF способствует пролиферации EC, испусканию филоподий, деградации внеклеточного матрикса и хемотаксису2, 14. Следовательно, передача сигналов VEGFA индуцирует подвижное и инвазивное поведение, которое управляет отрастанием TC и активирует ангиогенное переключение14 (Fig. 4a). Экспрессия VEGFA, в основном, позитивно регулируется с помощью гипоксии, т.о. ангиогенная реакция быстро инициируется в ответ на дефицит кислорода в ткани во время развития, роста и болезни24. Соотв., гетерозиготные Vegfa+/- мыши обнаруживают тяжелые сосудистые дефекты и характеризуются летальностью от гаплонедостаточности25, 26. Сходным образом, ранняя эмбриональная летальность и недостаточность сборки сосудов наблюдается у Vegfr2-нулевых мышей27.
Альтернативный сплайсинг транскриптов VEGFA дает ряд белковых вариантов, которые обладают разными функциями и биодоступностью во время морфогеназа кровеносных сосудов1, 2, 28. Напр., heparan sulphate-связывающая изоформа VEGFA165 (VEGFA164 у мыши) ассоциирована с матриксом и формирует градиенты, которые способствуют выпусканию филоподий, направленной миграции ECs и ответвлению кровеносных сосудов29. Напротив, VEGFA121 (VEGFA120 у мышей) неспособен связывать heparan sulphate, он свободно диффундирует и влияет на пролиферацию EC, но не на миграцию29. Недавно было показано, что передача сигналов VEGFR2, выявляемая с помощью ассоциированного с матриксом VEGFA, также отличается от таковой, индуцируемой растворимой изоформой30. Более того, VEGFA сплайс-варианты с измененным С-концами (b изоформы) обнаруживают существенно сниженную способность активировать VEGFR2 (Refs 28, 31). Следовательно, крепкая пространственная регуляция продукции разных изоформ VEGFA является ключевой контрольной точкой во время морфогенеза кровеносных сосудов.
Помимо VEGFR2, VEGFA соединяется с родственной рецепторной Tyr киназой VEGFR1 (кодируемой FLT1) (Fig. 3a), которая обладает более высоким сродством к VEGFA, чем к VEGFR2, но обладает слабой Tyr киназной активностью. Поэтому VEGFR1 рассматривается как рецептор ловушка, который противодействует передаче про-ангиогенных сигналов32. Более того, альтернативный сплайсинг VEGFR1 генерирует секретируемую и каталитически неактивную изоформу (растворимый VEGFR1 (sVEGFR1), которая действует как сливная яма для свободного VEGFA. Поэтому нокаут Flt1 ассоциирует с избыточным ростом EC, аномальным ангиогенезом и эмбриональной летальностью у мышей32-34. Сходным образом, нокдаун flt1 усиливает ангиогенное поведение EC у рыбок данио35. Кроме того, экспрессия Flt1 в не-EC клеточных типах также может непосредственно влиять на ангиогенез. Напр., недавние данные показали, что передача сигналов WNT, индуцированная экспрессией Flt1 в ретинальных миелоидных клетках, супрессирует ангиогенез в сетчатке мыши36. Др. члены семейства VEGF, такие как PLGF и VEGFB, избирательно связывают VEGFR1; однако их функциональная роль во время развития сосудов неясна.
VEGFC ещё один детерминант сосудистого развития. VEGFC соединяется со своим рецептором VEGFR3 (кодируемым FLT4) (Fig. 3a), и как известно играет ключевую роль во время лимфангиогенеза
4. Однако, передача сигналов VEGFR3 также позитивно регулирует ангиогенез
37. В частности, VEGFR3 экспрессируется на высоком уровне в TCs и необходима для врастания EC у мышей и рыбок данио
37, 38. Более того, недавно было установлено, что VEGFC способствует сборке гетеродимеров VEGFR2-VEGFR3, которые встречаются с высокой частотой в TCs и позитивно влияют на ангиогенное разрастание
39. Следовательно, правильная пространственно-временная экспрессия VEGFR3 всё больше рассматривается как важный детерминант функции TC.
Mechanisms of TC and SC selection
Ангиогенез нуждается в иерархической организации отрастающих (sprouting) клеток в ведущие TCs и подтягиваемые SCs. Эта координация миграторного поведения клеток является ключевым аспектом морфогенеза ветвления ткани во многих системах18. Но почему только некоторые ECs избираются как TCs в ответ на передачу сигналов VEGFA? В последние годы наше понимание молекулярных механизмов выбора TC существенно возросло в результате разработки in vivo моделей отрастания кровеносных сосудов. В частности, исследование организации и поведения TC и SC во время ретинального ангиогенеза у мышей и врастания межсегментных сосудов (ISV) у рыбок данио, позволило вычленить пути, участвующие на уровне одиночной клетки in vivo. Эти исследования выявили удивительную консервацию механизмов, контролирующих ангиогенез у видов позвоночных.
Notch signalling controls TC and SC fate. Передача сигналов Notch эволюционно законсервированный путь, который выполняет хорошо известную роль в детерминации клеточных судеб у всех метазоа40. Связывание лиганда понуждает Notch рецептор к расщеплению (с помощью ADAM10 (a disintegrin and metalloprotease 10), ADAM17 и presenilins) и к высвобождению внутриклеточного фрагмента (известного как Notch intracellular domain (NICD)) (Fig. 3a), который действует как ключевой регулятор транскрипции во время спецификации клеточных судеб. ECs экспрессируют множественные Notch рецепторы (NOTCH1, NOTCH3 и NOTCH4) и трансмембранные Notch лиганды (Delta-like 1 (DLL1), DLL4, Jagged 1 and Jagged 2) (Fig. 3a), а недавние исследования продемонстрировали, что передача сигналов Notch играет критическую роль в выборе судеб TC и SC во время ангиогенеза40, 41. Исследования на мышах и рыбках данио показали, что экспрессия Dll4 и dll4, соотв., в TCs активирует Notch в соседних SCs, чтобы латерально ингибровать TC судьбу и поддержать иерархическую организацию выростов ECs38, 42-47 (Fig. 4a). Передача сигналов VEGFA-VEGFR2 способствует экспрессии DLL4 в TCs (Fig. 4b). Поэтому ECs, обладающие наивысшим уровнем передачи сигналов VEGF будут отбираться как TCs, тогда как в соседних клетках судьба TC репрессируется. Соотв., снижение передачи сигналов DLL4-Notch in vivo сопровождается избыточным образованием TC, расширенной экспрессией ассоциированных с TC генов (таких как FLT4, uncoordinated 5 homologue B (UNC5B) и PDGFB), повышенной пролиферацией EC, неконтролируемым разрастанием и неупорядоченным ветвлением сосудов38, 42-45. Более того, элегантное исследование мозаичных рыбок данио выявило, что ECs, экспрессирующие постоянно активную форму Notch, исключаются из TC позиции отрастающих сосудов38. Кроме того, нарушение расщепления Notch путем EC-специфического нокаута ADAM10 также способствует повышенному разрастанию EC48. Роль передачи сигналов DLL4-Notch в супрессии спецификации TC не только критическая для физиологического образования кровеносных сосудов, но и также для контроля опухолевого ангиогенеза. Опухоли очень сильно снабжаются кровеносными сосудами в ответ на антителами обусловленную редукцию DLL4-Notch взаимодействий, но сосуды слабо проводимы и мало функциональны, это ведет к гипоксии опухолей и снижению роста46, 47. Следовательно, DLL4 может рассматриваться как многообещающая мишень для противоопухолевого лечения. Однако недавние доказательства показали, что хроническое блокирование DLL4, вызывающее опухолевые сосуды, может препятствовать этому эффекту49.
Передача сигналов DLL4-Notch эффективно супрессирует TC судьбу путем негативной регуляции передачи сигналов VEGFR. В частности, активация Notch ингибирует функцию VEGFR2 и блокирует экспрессию FLT4 в SCs и соотв. делает их менее чувствительными к VEGF-обеспечиваемым TC-индуцирующим сигналам38, 44-46, 50 (Fig. 4b). Напр., экспрессия flt4 у рыбок данио обычно ограничивается эндотелиальными TCs, но расширяется на весь SC домен в отсутствие передачи сигналов Notch и как следствие повышенное образование TC38. Соотв. эктопическая экспрессия flt4 приводит к фенотипу с усиленным отрастанием сосудов, наблюдаемому у эмбрионов рыбок данио с дефицитом передачи сигналов Notch37, 38, 45. Однако недавнее исследование на рыбках данио позволило предположить, что Dll4 супрессирует Vegfc-индуцированную функцию Vegfr3, но не влияет на экспрессию Vegfr3's кодируемого гена, flt4, указывая на дополнительную роль др. Notch лигандов в транскрипционном контроле flt4 (Ref. 51). Напротив, передача сигналов Notch позитивно регулирует экспрессию FLT152 (Fig. 4b). В этом контексте, VEGFR1, скорее всего, действует как негативный детерминант TC поведения, путем действия в качестве рецептора ловушки VEGFA , чтобы в дальнейшем предупредить VEGFA-обеспечиваемую спецификацию TC. В соответствии с этой концепцией, нокдаун flt1 у рыбок данио способствует повышенному образованию TC и избыточному ветвлению сосудов35. Интересно, что недавние данные показали, что ECs могут осуществлять быстрый переход между позициями TC и SC во время ангиогенного разрастания in vitro и во время разрастания кровеносных сосудов в голове рыбок данио53. Следовательно, TC и SC судьбы могут быть до некоторой степени пластичными скорее, чем жестко фиксированными. Соотв. разрастающиеся ECs постоянно перетасовываются и конкурируют за TC позицию за счет динамической регулировки своих уровней VEGFR2 в противовес экспрессии FLT153. Более того, экспрессия sFLT1 в ECs, соседствующими с TCs, как было установлено, действует как пространственный сигнал, который направляет новое ангиогенное отрастание прочь от родительского сосуда54. Следовательно, помимо контроля передачи сигналов VEGF, путь DLL4-Notch может косвенно влиять на локальное наведении отрастающих сосудов.
Контроль TC спецификации с помощью передачи сигналов DLL4-Notch обладает удивительным сходством с молекулярными механизмами ветвления эпителиальных трахей у D. melanogaster. Подобно роль передачи сигналов VEGF в образовании эндотелиальных TC, трахейные TCs специфицируются с помощью fibroblast growth factor (FGF) лиганда Branchless (BNL). Более того, в этой системе передача сигналов Notch посредством лиганда Delta ограничивает избыточное образование эпителиальных TC путем репрессии экспрессии рецептора для BNL, breathless (btl), в SCs. Следовательно, Notch-обусловленное латеральное ингибирование экспрессии рецепторной Tyr киназы контролирует правильные количества, позицию и поведение специфицированных TC во время морфогенеза ветвления ткани во множественных системах.
В то время как DLL4-обеспечиваемя передача сигналов Notch негативно регулирует выбор TC, SC-ограниченная экспрессия др. Notch лиганда, Jagged 1, способствует формированию TC и ангиогенезу55 (Fig. 4b). В вырастающих ECs, внеклеточный домен Notch пост-трансляционно гликозилируется с помощью из семейства Fringe glycosyltransferases. Эта модификация сахаром усиливает передачу сигналов Notch посредством DLL4, но репрессирует передачу сигналов посредством Jagged 1. Следовательно, Jagged 1-Notch взаимодействия не индуцируют продуктивной Notch передачи сигналов. Согласно этой модели, SC-ограниченный Jagged 1 конкурирует с DLL4 за связывание Notch рецепторов на TCs и эффективно супрессирует TC Notch передачу сигналов. Соотв., формирование TC и сосудистое разрастание сильно повреждается в сосудах сетчатки у EC-specific Jagged 1-нокаутных мышей. Напротив, образование TC усиливается после избыточности функции EC-специфического Jagged 1. Эти находки указывают на то, что разные Notch лиганды выполняют противоположные роли в контроле выбора TC и ангиогенного разрастания, это может иметь важное значение для морфогенеза ветвления ткани в др. системах.
Emerging players in TC and SC fate decisions. Удивительное сходство между ангиогенезом и ветвлением трахей у D. melanogaster открывает имеющуюся возможность, что др. известные детерминанты эпителиального отрастания могут контролировать морфогенез кровеносных сосудов. В самом деле, недавние исследования подчеркивают эту эволюционную консервацию путем идентификации критической роли ETS-родственого фактора translocation ETS leukaemia (TEL; также известного как ETV6) в ангиогенном разрастании56. TEL является ортологом у млекопитающих репрессора транскрипции D. melanogaster YAN, который негативно регулируется с помощью передачи сигналов BTL и является важным для ветвления трахей57, 58. В ECs, TEL взаимодействует с корепрессором C-terminal-binding protein (CtBP), чтобы репрессировать экспрессию антагонистов разрастания (таких как DLL4 и Sprouty homologue 4 (SPRY4)) перед VEGF-управляемым образованием TC и ангиогенезом56 (Fig. 4b). Соотв., отрастание EC in vitro испытаниях и во время ангиогенеза рыбок данио нарушается после TEL или tel нокдауна, соотв., это коррелирует с повышенной экспрессией DLL4. Эти находки указывают, что дальнейшие исследования, использующие уроки, полученные на др. системах, помогут нашему пониманию морфогенеза кровеносных сосудов.
Как обсуждалось выше, приобретение судьбы и поведения TC и SC использует тщательный пространственно-временной контроль экспрессии генов, специфичных для типов EC. Следовательно, недавний сравнительный анализ транскриптомов TCs и SCs у дикого типа в противовес Dll4-дефицитным ретинальным ECs мышей предоставил нам знание относительно молекулярного контроля ангиогенного разрастания59, 60. В частности, эти исследования показали ключевую роль CXC chemokine receptor 4 (CXCR4) в поведении TC59 и APJ endogenous ligand (APELIN) guanine-nucleotide-binding protein (G protein)-coupled receptor APJ в функции SC60. Отсюда дальнейший функциональный анализ в TC и SC экспрессирующихся генов, идентифицированных в этих и р. исследованиях, может предоставить дополнительную важную информацию.
Недавние исследования ангиогенеза также пролили свет на фундаментальные механизмы, которые контролируют передачу сигналов Notch в разных клеточных контекстах. Напр., исследования с использованием мышей, избыточно экспрессирующих β-catenin в ECs, показали, что путь WNT-β-catenin позитивно регулирует экспрессию Dll4 в сосудистой системе61 (Fig. 4b). Соотв., избыточная функция β-catenin индуцирует передачу сигналов Notch в эндотелии и нарушает ветвление EC, хотя роль этого пути в выборе TC неясна. Параллельно, взаимодействия DLL4-Notch могут обеспечивать обратную связь, чтобы активировать передачу сигналов WNT в SCs, которая поддерживает межклеточные EC-EC связи62. Передача сигналов Notch способствует стабильности сосудов путем индукции экспрессии WNT регуляторного гена Notch-regulated ankyrin repeat-containing protein (NRARP). NRARP ограничивает активность Notch и стимулирует lymphoid enhancer-binding factor 1 (LEF1)- и β-catenin-зависимую передачу сигналов WNT, чтобы стабилизировать SCs и предупредить ретракцию EC (Fig. 4b). Как результат, потеря Nrarp у мышей или nrarpa и/или nrarpb у рыбок данио вызывает регрессию эктопических сосудов и снижает WNT-обеспечиваемую стабильность сосудов62. Следовательно, функциональное взаимодействие между передачей сигналов Notch и WNT является критическим для развития сосудов.
Поразительно, недавнее исследование NAD
+-зависимой деацетилазы sirtuin 1 (SIRT1) показало, что ацетилирование NICD снижает его оборот, т ем самым усиливает передачу сигналов Notch
63 (Fig. 4b). SIRT1 деацетилирует NICD в ECs, чтобы противодействовать их ацетилированием обеспечиваемой стабилизации. Соотв., нокдаун
Sirt1 у мышей (который усиливает DLL4-обеспечиваемую передачу сигналов Notch) и sirt1 у рыбок данио нарушает разрастание EC и нарушает ветвление сосудов. Интересно, что повышенная экспрессия SIRT1 в SCs указывает на то, что репрессия передачи сигналов Notch может играть ключевую роль в биологии SC помимо её известной роли в выборе TC. Наиболее важно, что эти исследования определили SIRT1 как потенциальный генеральный регулятор передачи сигналов Notch, который может оказывать важное влияние на выбор клетками судьбы во многих тканях.
Vascular lumen morphogenesis
Во время ангиогенного разрастания все функциональные кровеносные сосуды должны сформировать функциональный сосудистый просвет, для обеспечения кровотока. Поскольку молекулярные пути, контролирующие морфогенез эпителиального просвета, интенсивно исследуются64, прогресс в направлении определения механизмов формирования сосудистых трубок медленный. В самом деле, сегодня как несколько лет назад наше понимание формирования просвета сосудов в основном базируется почти исключительно на исследованиях in vitro, использующих подход трехмерного тубулогенеза. Хотя исследования in vitro показали изобилие знаний относительно потенциальных игроков в этом процессе (включая integrins, CDC42, SRC, RAC1, p21-activated kinase 2 (PAK2), PAK4, RAF, partitioning defective 3 (PAR3; also known as PARD3), PAR6 и atypical protein kinase C)16, трудно подтвердить эти наблюдения in vivo. Недавние исследования на мышах и рыбках данио пролили новый свет на клеточные и молекулярные механизмы морфогенеза сосудистого просвета, подтвердив многие ранние наблюдения in vitro и добавив новую важную информацию. В частности, стало ясно, что образование просвета в большинстве многоклеточных сосудов использует переход через ряд дискретных фаз.
Establishing EC polarity. Перед образованием трубки кровеносные сосуды состоят из многоклеточных палочек из ECs, которые взаимосвязаны с помощью униформных межклеточных EC-EC соединений и имеют также установленную апикально-базальную полярность (Fig. 5a). PAR3 является критическим детерминантом клеточной полярности, которая, как известно, влияет на формирование эпителиального просвета и участвует в формировании сосудистых трубок in vitro16. Первая фаза морфогенеза просвета кровеносного сосуда, по-видимому, использует PAR3-обеспечиваемое приобретение EC апикально-базальной полярности и латеральное перераспределение белков соединений (включая zonula occludens 1 (ZO1), claudin 5, CD99 и vascular endothelial cadherin (VE-cadherin)) с апикальной поверхности EC на периферию сосудистого тяжа65, 66 (Fig. 5a). Важно, что ?1 integrin-matrix взаимодействия на базальной поверхности EC устанавливают полярность EC in vivo путем регулировки экспрессии PAR3 и локализации на базальной поверхности EC65. Кроме того, недавние доказательства указывают, что RAS-interacting protein 1 (RASIP1) и его партнер по связыванию RHOA GTPase-activating protein 29 (ARHGAP29) также влияют на морфогенез просвета у мышей66. Специфичная для сосудов экспрессия RASIP1 регулирует активность RHO GTPase и также сдвигает белки соединений латерально путем активирования integrins (включая ?1 integrin) и контроля локализации PAR3. Следовательно, правильное приобретение апико-базальной полярности и пространственное перераспределение EC-EC соединений инициирует формирование просвета.
Recruiting key proteins to the site of lumen formation. Как только устанавливается EC полярность, CD34 и podocalyxin (PODXL) (гликопротеины, которые экспрессируются в сосудистом эндотелии) рекрутируются на апикальные мембраны, они первоначально находятся в точках контакта между соседними ECs65-67 (Fig. 5b). Как ?1 интегрин, так и VE-cadherin (но не RASIP1) регулируют накопление PODXL на апикальной поверхности, это может быть важным для образования просвета in vivo65-67. После своего перераспределения, PODXL рекрутирует др. апикальные белки (moesin и filamentous actin (F-actin)) как только начинает формироваться сосудистый просвет67. Подобно тому, что происходит с PODXL и VE-cadherin, накопление на апикальной поверхности moesin может контролировать морфогенез просвета и, по-видимому, действует путем рекрутирования F-actin67, 68. Следовательно, приобретение апико-базальной полярности, по-видимому, действует, частично, чтобы секвестрировать ключевые компоненты аппарата тубулогенеза в месте образования просвета.
Lumenal expansion. Увеличение просвета кровеносных сосудов, скорее всего, происходит в результате ряда механизмов (Fig. 5c). Напр., передача сигналов VEGFA способствует рекрутированию немышечного myosin II на апикальную поверхность, подтверждая тем самым, что контрактильность actomyosin может индуцировать изменения формы, что помогает формировать просвет
67. Более того, тот факт, что RASIP1 супрессирует контрактильность actomyosin может указывать на то, что необходим тонкий баланс для эффективного образования трубок
66. Напротив, кровеносные сосуды, лишенные beta1 integrin гена не образуют просвета, но накапливают большие количества внутриклеточных пузырьков, указывает на то. что везикулярный трафик также может вносить вклад в экспансию просвета
65. Кроме того, интерпретация исследований живых объектов, образования ISV трубок у рыбок данио, указывает на то, что сборка просвета EC за счет соединения и слияния внутриклеточных вакуолей
17. Это обсуждается в недавних исследованиях, указывая, что ISV просвет образуется в основном внеклеточно
69, в соответствии с исследованиями на мышах
65-67. Важно, что роль
?1 интегрина в тубулогенезе ограничивается артериальным эндотелием, а венозные сосуды д. использовать альтернативные механизмы
65. В соответствии с этими наблюдениями, первые эмбриональные артериальные и венозные сосуды у рыбок данио формируют просвет за счет очень отличающихся механизмов
70. Очень вероятно, что целый диапазон механизмов тубулогенеза используется в разных клеточных конспектах, указывая, что нам известна только часть из этих сложных процессов.
Axon guidance signals and angiogenesis
Эндотелиальные TCs обладают многими сходными морфологическими и функциональными свойствами с ростовыми конусами аксонов15. Напр., как мигрирующие TCs, так и ростовые конусы представлены подвижными структурами ведения, которые выпускают динамические филопоидальные выпячивания и отвечают на привлекающие и отталкивающие сигналы. Недавние доказательства показали, что ECs и нейроны рекрутируются также в разных общих механизмах, чтобы контролировать направленную миграцию и формирование паттерна сложных сосудистых и нервных сетей.
Netrins in angiogenesis. Netrins являются семейством секретируемых наводящих молекул, которые связаны с внеклеточным матриксом и могут вызывать или привлекающие или отталкивающие эффекты на ведение аксонов71. Напр., соединение netrin с членами семейства рецепторов deleted in colorectal cancer (DCC) является привлекательным, тогда как соединение с членами семейства рецепторов UNC5 способствует отталкиванию аксонов15, 72. Из netrin рецепторов, экспрессия UNC5B является специфичной для сосудов и ограничивается артериальными ECs и TCs в вырастающих капиллярах45, 73 (Fig. 3b). Важно, что сосудистая сеть у Unc5b-нокаутных мышей исключительно разветвлена, а TCs, лишенные Unc5b, обнаруживают неконтролируемое испускание филоподий73. Следовательно, подобно роли UNC5 рецепторов в нейронах, UNC5B обычно репрессирует подвижное поведение ECs. Соотв., стимуляция UNC5B с помощью netrin 1 способствует ретракции филоподий TC и блокирует вырастание новых сосудов73, 74. Напротив, netrins могут также обладать про-ангиогенной ролью, поскольку локальное высвобождение netrin 1 или netrin 4 способствует терапевтическому ангиогенезу75. Эти кажущиеся противоречащими наблюдения, что netrin 1 действует как анти- , так и про-ангиогенный фактор, может быть объяснено недавними доказательствами, указывающими на то, что UNC5B является EC зависимым рецептором, который стимулирует апоптоз в отсутствие лиганда76. Соотв., netrin 1 может усиливать разрастание EC, ингибируя про-апоптический эффект несвязанного UNC5B76. Однако как эндогенные netrins запускают передачу сигналов UNC5B in vivo остается неясным, исходя из того, что netrin 1-нокаутные мыши не имеют сосудистых дефектов77.
ROBO receptors in angiogenesis. Белки Slit из др. семейства секретируемых молекул, важны для наведения и они отталкивают ростовые конусы аксонов после соединения с Roundabout (ROBO) рецепторами. Из 4-х известных ROBO генов (ROBO1, ROBO2, ROBO3 и ROBO4) млекопитающих, ROBO4 (также известен как Magic roundabout) избирательно экспрессируется в ECs78 (Fig. 3b). Исследования ROBO4 у мышей и Robo4 у рыбок данио указывают на то, что этот белок поддерживает стабильность сосудов и ингибирует ангиогенез, противодействуя VEGF-обеспечиваемой передаче сигналов79-83. Принимая во внимание, что ROBO4 концентрируется в эндотелиальных SCs80, эти находки могут указывать на то, что передача сигналов ROBO4-Slit негативно регулирует передачу сигналов VEGF, чтобы репрессировать TC поведение в SCs. Однако неясно, регулирует ли взаимодействие ROBO4 с Slit лигандами функцию ROBO4 in vivo. Напр., Slit 2, как было установлено, ко-иммунопреципитируется с ROBO4 (Ref. 84); однако, соединение Slit 2 с ROBO4 не обнаруживается при Biacore методе связывания85. Более того, структурный анализ показывает, что ROBO4 лишен остатков, которые существенны для соединения ROBO-Slit15. Важно, что недавние данные показали, что ROBO4 неожиданно соединяется с и активирует UNC5B в ECs82. Эти находки указывают на то, что ROBO4 функция может не регулироваться с помощью Slit 2, но может участвовать во взаимодействии двух неродственных рецепторов наведения.
Semaphorins in angiogenesis. Секретируемые или закрепленные на мембране члены семейства наводящих молекул semaphorin также играют ключевую роль во время ведения аксонов и формирования сосудистого паттерна86 (Fig. 3b). Ассоциированные с мембраной semaphorins влияют на подвижность клеток путем связывания plexin семейства трансмембранных рецепторов, тогда как секретируемый класс III semaphorins (от semaphorin 3A (SEMA3A) до SEMA3G) обычно взаимодействует с neuropilin (NRP) семейством трансмембранных ко-рецепторов15. Одним из исключений является SEMA3E, который способствует передаче сигналов посредством EC-обогащающего рецептора, plexin D1 (Ref. 87). EC-специфический нокдаун plexin D1 у мышей нарушает формирование сосудистого паттерна, усиливает разрастание EC и ассоциирует с неонатальной гибелью88. Более того, преждевременное ISV разрастание наблюдается у plexin D1 мутантов рыбок данио, out of bounds (obd)89. Следовательно, передача сигналов semaphorin-plexin D1 играет эволюционно законсервированную роль в качестве отталкивающих сигналов ведения во время ангиогенеза. Однако недавние доказательства показали, что передача сигналов SEMA3E-plexin D1 негативно регулирует передачу сигналов DLL4-Notch, что может указывать на дополнительную роль этого пути во время выбора TC судьбы в сосудах сетчатки мыши90.
NRP co-receptors in angiogenesis. NRP корецепторы (NRP1 и NRP2) играют ключевую роль в ведении аксонов после связывания класса III semaphorins15, 91.Кроме того, NRPs модулируют ангиогенные разрастания после связывания VEGFA165 (VEGFA164 у мышей), но не VEGFA121 (VEGFA120 у мышей)2, 91, 92 (Fig. 3b). NRPs образуют комплексы с различными VEGFRs и усиливают VEGFR-обеспечиваемую передачу сигналов после связывания VEGFA. Следовательно, NRPs важны для развития сосудов, а нокаутные Nrp1 мыши обнаруживают нарушения ремоделирования EC и ветвления сосудов во время развития93, 94. Однако сосудистые дефекты у Nrp1-нулевых мышей в целом относительно легкие, это указывает на то, что NRP-обеспечиваемая передача сигналов VEGF не играет ключевую роль во время спецификации и разрастания TC.
EPHs in angiogenesis. Ephrin рецепторы (EPHs) являются трансмембранными рецепторными Tyr киназами, которые соединяются и активируются белками клеточной поверхности, наз. ephrins95. EPH-ephrin прямо направленная и обратно направленная передача сигналов давно известна как важная для развития нервов и сосудов; однако клеточные и молекулярные механизмы, лежащие в основе функции EPH-ephrin в сосудистой системе in vivo, только начинают раскрываться. Ephrin B2 и соотв. ему рецептор EPHB4 играют ключевую роль во время морфогенеза кровеносных сосудов и привлекают большое внимание благодаря своей удивительно ограниченной экспрессии в артериях и венах, соотв.95 (Fig. 3b). Напр., имеющиеся данные указывают на то, что ephrin B2 может непосредственно взаимодействовать с VEGFRs, чтобы регулировать передачу сигналов VEGF96, 97, как обсуждалось выше. Кроме того, в недавнем исследовании на рыбках данио показано, что b2a-Ephb4a взаимодействия регулируют расхождение и рассортировку артериальных и венозных EC предшественников в дискретные первичные артериальные и венозные сосуды во время раннего развития70. В этом процессе, Vegfa-индуцированная экспрессия ephrin b2a в артериальных предшественниках блокирует вентральную миграцию этих клеток, чтобы исключить их из первичных венозных сосудов. Напротив, экспрессия ephb4a в венозных предшественниках делает возможной вентральную миграцию венозных предшественников и способствует исключению из первичных эмбриональных артерий. Следовательно, ephrin b2- и Ephb4-обеспечиваемый направляющий контроль миграции EC контролирует сегрегацию на артерии и вены и генерацию раздельных параллельных сосудов. Более того, эти результаты подтверждают более ранние наблюдения, что передача сигналов ephrin B2-EPHB4 регулирует калибр артериальных и венозных сосудов у мышей98. Однако необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, действительно ли этот путь действует как главный механизм регуляции образования первичных сосудов или, напротив, действует скорее как КПП (checkpoint), чтобы супрессировать перемешивание артериальных и венозных сосудов.
Эти находки четко демонстрируют, что ECs отвечают на множественные нейрональные сигналы во время развития сосудов. Сходным образом, растут доказательства, чо сигналы наведения сосудов также могут влиять на развитие нервов. Напр., недавно было показано, что передача сигналов VEGFR3 контролирует нейрогенез у мышей
99. Более того, испускание сигналов, производимых нервами, которые влияют на взаимодействия между нервами и сосудами (таких как thrombospondin type I domain-containing 7A (THSD7A)) может также играть ключевую роль в регуляции ангиогенеза
100. Будущие исследования функционального перекрывания между сосудистыми и нервными путями смогут пролить свет на механизмы, контролирующие развитие обеих систем.
Fine-tuning angiogenesis
Исследования сосудов последние 20 лет оказались успешными в идентификации многих ключевых молекулярных путей, контролирующих ангиогенез. Однако недавние исследования начали определять пост-транскрипционные и пост-трансляционные механизмы, которые приводят в порядок реакции, обеспечиваемые известными ангиогенными путями. Поэтому современные исследования выявили удивительный уровень сложности контроля передачи про-ангиогенных сигналов, как обсуждалось выше.
Post-transcriptional control of angiogenesis. MicroRNAs (miRNAs) являются крупным семейством малых (~22 п.н.) некодирующих однонитчатых РНК, которые рассматриваются как ключевые пост-транскрипционные регуляторы экспрессии генов101. miRNAs действуют путем связывания комплементарных последовательностей внутри мРНК мишеней, это блокирует трансляцию или способствует деградации связанной мРНК. Недавно было установлено, что определенные miRNAs являются критическими детерминантами поведения EC во время ангиогенеза101 (Fig. 6a). Напр., модуляция передачи сигналов VEGF во время развития с помощью EC-ограниченной miRNA miR-126 является важной для нормального ангиогенеза у мышей и рыбок данио102-104. miR-126 располагается в интроне 7 эндотелиального гена epidermal growth factor-like 7 (EGFL7). Экспрессия miR-126 позитивно влияет на VEGF-индуцированную передачу сигналов за счет пост-транскрипционной репрессии SPRED1 (Sprouty-related EVH1 domain-containing 1) и PI3K regulatory subunit 2 (PIK3R2; также известного как p85β), которые являются негативными регуляторами передачи сигналов MAPK и PI3K, соотв.102-104. Соотв. усиление экспрессии SPRED1 и PIK3R2 после нокдауна miR-126 блокирует VEGF-индуцируемую передачу сигналов MAPK и PI3K. В результате ангиогенез и целостность сосудов нарушаются у мышей или рыбок данио, дефицитных по miR-126, давая ломкие и протекающие сосуды, часто дающие кровоизлияния.
Недавние результаты у рыбок данио показали, что модуляция оси miR-126-Spred1 может даже делать возможной интеграцию механических сигналов от внеклеточного окружения, чтобы контролировать морфогенез кровеносных сосудов105 (Fig. 6a). В ответ на кровоток чувствительный к механическим воздействиям транскрипционный фактор Kruppel-like factor 2a (Klf2a) способствует экспрессии miR-126 в отрастающих сосудах аортальных дуг. Следовательно, miR-126-обеспечиваемое усиление передачи сигналов VEGF является важным для ангиогенеза сосудов аортальных дуг, индуцируемого кровотоком. Следовательно, эти находки проливают свет на механизмы механической чувствительности, которые интегрируют кровоток и передачу сигналов VEGFR во время ремоделирования развивающейся сосудистой сети.
Др. сосудистые miRNAs, по-видимому, играют важную роль во время патологического ангиогенеза106, 107. Экспрессия miR-132 в ECs способствует ангиогенезу путем воздействия на RAS-specific GAP p120 (p120RASGAP), известный негативный регулятор активности RAS106 (Fig. 6a). Следовательно, miR-132 активирует RAS, чтобы способствовать пролиферации EC, формированию трубок и ангиогенезу in vivo. Соотв. экспрессия miR-132 в отрастающих ECs действует как ангиогенный переключатель, который способствует образованию сосудов и росту опухолей. Напротив, экспрессия в EC miR-92a, по-видимому, блокирует отрастание новых кровеносных сосудов, репрессируя экспрессию про-ангиогенных белков, таких как α5 integrin107. Соотв., ингибирование miR-92a усиливает терапевтический ангиогенез и неоваскуляризацию ишемических тканей у мышей. Интересно, что потенциальной мишенью для miR-92a является SIRT1, указывая тем самым, что miR-92a может супрессировать SIRT1-обеспечиваемое деацетилирование NICD и ингибировать ангиогенез путем стабилизации передачи анти-ангиогенных Notch сигналов63. Однако прямая связь между miR-92a и передачей сигналов Notch не описана.
Post-translational control of VEGFR signalling. Интернализация связанного с лигандом VEGFR-2 в эндосомные компартменты необходима, чтобы пролонгировать величину и продолжительность нижестоящей передачи про-ангиогенных сигналов in vitro108. В ряде недавних исследований подтверждено, что тонкий пространственный контроль доставки VEGFR является также критической контрольной точкой ангиогенеза in vivo (Fig. 6b). Напр., synectin-myosin VI-зависимая доставка VEGFR2-содержащих эндосом перемещает VEGF-активированные рецепторы прочь из плазматической мембраны109. Такое пространственное перераспределение VEGFR2 блокирует дефосфорилирование активных рецепторов с помощью protein Tyr phosphatase 1B (PTP1B; также известной как PTPN1) в плазматической мембране. Следовательно, synectin-myosin VI-обеспечиваемое поддержание передачи сигналов VEGFR2 влияет на многие VEGF-регулируемые процессы in vivo. Затем два недавних исследования также установили критическую роль молекул ведения нейронов ephrin B2 в этом процессе96, 97. Экспрессия ephrin B2 в ECs неожиданно способствует интернализации VEGFRs (VEGFR2 и VEGFR3) и передаче их сигналов из эндосом, что существенно для удлинения TC филоподий. Следовательно, потеря экспрессии ephrin B2 и ephrin b2a у мышей и рыбок данио, соотв., нарушает образование TC, блокирует образование отростков из EC и нарушает ангиогенез96, 97.
В дополнение к интернализации рецепторов, усиленный рециклинг подвергшихся эндоцитозу VEGFR2, по-видимому, играет важную роль в ангиогенезе
in vivo (Fig. 6b). В частности недавние результаты продемонстрировали участие αvβ3 integrin в RAB4A-обеспечиваемом рециклинге VEGFR2 в плазматической мембране ECs
110. Соотв. фармакологическое усиление этого механизма блокирует VEGF-индуцированную лизосомную деградацию VEGFR2 и усиливает миграцию EC и ангиогенез
in vitro и in vivo. Более того, RAB-обеспечиваемый мембранный трафик др. сигнальных компонентов (таких как RHOA и SYX (также известного как PLEKHG5)) также может играть ключевую роль в ангиогенном разрастании
111. Новые детерминантов интернализации и рециклинга VEGFR появятся в ближайшие годы, а ключевым вопросом станет смогут ли (и как) эти механизмы модулироваться в зависимости от типа клеток во время ангиогенеза. Напр., смогут ли эти про-ангиогенные механизмы избирательно рекрутироваться с помощью TCs во время разрастания?
Perspectives
In recent years, our understanding of the molecular mechanisms that control and coordinate diverse EC behaviours during blood vessel morphogenesis has expanded remarkably. In particular, the development of advanced vertebrate model systems has allowed the field to address fundamental vascular questions in vivo at a spatiotemporal resolution never before possible. Studies exploiting these tools have greatly enriched our knowledge of key aspects of blood vessel assembly, such as the mechanisms of TC selection and vascular lumen morphogenesis. However, our understanding of many processes is still in its infancy. For example, the molecular machinery that terminates EC sprouting and stimulates vessel anastomosis remains largely a mystery. Moreover, the cell-type-specific mechanisms regulating venous vascular tube formation remain unknown. Importantly, glaring gaps still exist in our knowledge of the sprouting process itself. For example, are endothelial SCs also specified during angiogenesis or do they just passively trail migrating TCs? Likewise, the plasticity of the TC and SC fates needs to be investigated further. Furthermore, the precise spatiotemporal dynamics of TC and SC Notch signalling during EC sprouting is unclear. As recent studies have demonstrated, blood vessel morphogenesis represents a paradigm for many fundamental processes common to other biological systems3, 18. Hence, future studies addressing the questions raised above should reveal important mechanistic insights that can be readily translated into other systems.
The therapeutic targeting of blood vessel morphogenesis remains a predominant strategy for tackling the diverse range of diseases that are driven by pathological angiogenesis1. Considering the critical role of the DLL4–Notch–VEGF signalling axis in angiogenic sprouting38, 42-47, much of the current clinical research is focused on modulating this pathway1. However, it is clear that there is still vast therapeutic demand and scope for identifying new determinants of blood vessel formation. In particular, a better molecular understanding of currently under-explored processes, such as lumen morphogenesis and SC formation, will pave the way for novel targets that may ultimately translate into more effective therapies.
