Механизмы, регулирующие плюрипотентность, самообновление и дифференцировку стволовых клеток далеки от полного понимания и мало известно о генах, участвующих в этих сложных процессах. Микромассивы для профилирования генной экспрессии по всему геному являются важными инструментами исследований по идентификации потенциальных биомаркеров и генов кандидатов для идентификации болезней и др. биологических процессов (Hemberger et al., 2001, Kim et al., 2001, Tanaka et al., 2000). В данной работе мы осуществили профилирование экспрессии по всему геному MES3, хорошо известной линии эмбриональных стволовых клеток мышей. Качество недифференцированных стволовых клеток, культивируемых в нашей лаб. было подтверждено с помощью оценки экспрессии маркеров, экспрессируемых недифференцированными стволовыми клетками (Furusawa et al., 2004, Jeong et al., 2007, Zhao et al., 2005). Анализ генной экспрессии идентифицировал 5807 генов как дифференциально экспрессируемых ~2-кратным отличием в MES3 клетках в противовес взрослым клеткам. Среди них 3664 генов усиливало свою активность, включая 611 с 3-кратным увеличением Klf5 (Ramalho-Santos et al., 2002), Klf9 (Ramalho-Santos et al., 2002), Smn1 (Liu et al., 2007), Ttf1 (Ivanova et al., 2002, Kelly and Rizzino, 2000), Sall1 (Sato et al., 2003) и FoxD3 (Abeyta et al., 2004, Sperger et al., 2003); (2) сДНК репарацией/ДНК и РНК-связанные гены, напр., Dnmt3a (Tanaka et al., 2002), Msh2 (Ramalho-Santos et al., 2002), Hdac2 (Bhattacharya et al., 2004), Ddx21 и Npm1 (Bhattacharya et al., 2004); (Tanaka et al.) (3) клеточного цикла/клеточной передачи сигналов/клеточного роста/клеточных процессов гены, напр., Ccdn1 (Abeyta et al., 2004, Ivanova et al., 2002, Kelly and Rizzino, 2000, Ramalho-Santos et al., 2002, Sato et al., 2003), Ccne1 (Ivanova et al., 2002, Kelly and Rizzino, 2000, Ramalho-Santos et al., 2002), Ccne2, Mcm3 (Sato et al., 2003), (Bowman et al., 2006, Rao and Stice, 2004, Venezia et al., 2004), Galanin (Bhattacharya et al., 2004), Calumenin (Bhattacharya et al., 2004), Pitx2 (Bhattacharya et al., 2004, Ramalho-Santos et al., 2002, Rao and Stice, 2004) и Pttg1 (Bhattacharya et al., 2004); (4) Метаболических путей гены, напр., Mthfd2 (Bhattacharya et al., 2004, Rao and Stice, 2004), Tk1 (Bhattacharya et al., 2004, Rao and Stice, 2004), Serpinh1 (Bhattacharya et al., 2004), Cct8 (Bhattacharya et al., 2004) and Tubb4 [42]; (5) Факторов роста/Рецепторов гены, напр., Epha1 (Sperger et al., 2003); (6) Клеточной адгезии/Мембранных белков, напр., Lamr1 (Bhattacharya et al., 2004, Ivanova et al., 2002, Kelly and Rizzino, 2000, Rao and Stice, 2004), Itga6 (Abeyta et al., 2004, Ivanova et al., 2002, Ramalho-Santos et al., 2002, Rao and Stice, 2004) Anxa2 (Kimura et al., 2001); и (7) Разнообразные гены, напр., Ppic (Abeyta et al., 2004, Ivanova et al., 2002, Ramalho-Santos et al., 2002, Rao and Stice, 2004), Laptmb4 (Abeyta et al., 2004, Ivanova et al., 2002, Ramalho-Santos et al., 2002, Rao and Stice, 2004) и Arcn1 (Abeyta et al., 2004, Ivanova et al., 2002, Ramalho-Santos et al., 2002, Rao and Stice, 2004). В то время как многие известные маркеры ES клеток были обнаружены в нашем массиве, др., которые более высоко экспрессируются в линии MES3 клеток, чем во взрослых клетках, не были описаны в предыдущих исследованиях генной экспрессии др. мышиных и человеческих mESC линий. Базируясь на этих результатах, было предположено, что детальный анализ этих генов и известных ESC маркеров может выявить новые факторы, участвующие в поддержании состояния плюрипотентности и самообновления. Однако результаты необходимо интерпретировать с осторожностью, поскольку профилирование экспрессии ES клеток выявляет большой процент неохарактеризованных генов.

Экспрессия генов при дифференцировке EBs из MES3 клеток была отслежена по массивам генной экспрессии на мРНК, изолированным из 3- и 7-дневных EBs. Существенно больше генов экспрессировалось во время раннего развития ESCs, чем в клетках взрослых. Как и ожидалось, большинство mESC маркеров подавлялось во время инициального периода дифференцировки и было достоверно sub-expressed у 3- и 7-дневных EBs. Будучи сравнен с клетками взрослых тканей, анализ экспрессии генов из 3-дневных EBs выявил 8105 дифференциально экспрессируемых гена: 6065 усиливало свою активность и 2040 подавляемых генов. Паттерн генной экспрессии у 7-дневных EB мРНК был сходен с таковым из 3-дневных EBs. Выявлено 9198 дифференциально экспрессируемых генов в 7-дневных EBs, из которых 6995 достоверно усиливали свою активность и 2243 достоверно подавлялись. Общее направление профиля экспрессии было активация как у 3- так и 7-дневных EBs (в противовес клеткам взрослой ткани и при использовании ESC в недифференцированном состоянии качестве сравнения). Тот факт, что большинство генов с достоверным изменением экспрессии было активировано, может помочь в выявлении генов кандидатов, участвующих в лежащих в основе сигнальных путях, которые контролируют раннюю дифференцировку и созревание mESCs. Однако важно отметить, что EBs состоят из многих типов клеток, это может отражать более высокий паттерн генной экспрессии по сравнению с mESCs.

3-дневные EB клетки содержат гены, связанные с контролем роста и клеточного цикла; Mcm5 ген, которые регулирует рост клеток и участвует в M/G1 и G2/M checkpoints клеточного цикла и в сборке пре-репликативных комплексов (Kimura et al., 2001); Ccnd2, связанный с контролем клеточного цикла и передачей сигналов P53 (более, чем в 5-раз более высокая экспрессия) (Furusawa et al., 2006); Prim1, связанный с S/G1 checkpoint клеточного цикла и инициаций репликации ДНК (более, чем в 5-раз более высокая экспрессия); Fst, связанный с клеточной пролиферацией и ростом (Skottman et al., 2006); Txndc1, который участвует в индукции клеточного роста и пролиферации посредством ингибирования апоптоза (>5-раз более высокая экспрессия) (Harkness et al., 2008); и Tk1, связанный с метаболизмом нуклеотидов и репликацией ДНК. Класс из трех родственных генов, Lama1, Lamb1-1 и Lamc1, был также активирован с началом дифференцировки. Эти гены являются рецепторами внеклеточного матрикса, непосредственно связанными в локальной клеточной адгезией и процессами клеточных коммуникаций, они кодируют laminin-111 (Li et al., 2004, Li et al., 2001), участвующий в развитии эктодермы (Miner et al., 2004, Scheele et al., 2005). Col4a2, др. рецепторо внеклеточного матрикса, также активировался, также как и некоторые гены, ассоциированные с : метаболизмом аминокислот, напр., Txndc12, Wars, Srm, Plod1 и Plod2; метаболизмом углеводов и/или липидов, напр.,, Hs3st1, Hexa, Ggta1, Gale, Pla2g12b и Asah1; и каскады комплимента и коагуляции, напр., F3 и Tfpi.

Набор из 2040 генов, которые подавлялись у 3-дневных EBs включает гены, связанные с биосинтезом аминокислот и/или метаболизмом пуринов (Abp1, Nt5c1b и hpb1), гены, необходимые для утилизации углеводов (ldhc, Plcz1 и Acsm1) и гены. связанные с метаболизмом липидов и стероидов (Hsd3b4, Cyp17a1, Cyp4b1, Cyp2e1, Cyp2f2 и Cyp2d26). Анализ микромассивов также выявил достоверную инактивацию класса родственных генов Spata3, Spata4, Spata16, Spata19, Spata20, Cst8, Cst12, Cst13, Svs5, Spag9, Spag4l, Tnp1 и Tesp1, которые ассоциированы со сперматогенезом, апоптозом клеток при сперматогенезе, тестикулярной функцией и развитием сперматоцитов. Интересно, что мы также открыли строгое подавление экспрессии Hils1 и H1fnt генов, которые важны для ядерной конденсации во время сперматогенеза (более, чем 6-кратное изменение) благодаря участию в замещении гистонов протаминами (Sup. Table 3). Fig. 4B представляет гистограмму GO terms достоверно избыточно презентирующимися в 3-дневных EBs.

Субнабор из наиболее достоверно активируемых генов в 7-дневных EBs включает гены, участвующие в метаболизме аминокислот (Plod1 и Plod 2), локальной клеточной адгезии и клеточных коммуникациях (Lama1, Lamb1-1 и Lamc1), в метаболизме углеводов и/или липидов (Hexa, Ggta1, Gale and Asah1) и каскады комплемента и каогуляции (F3 and Tfpi). Интересно, что только немногие гены обнаруживают более высокую экспрессию, чем в 3-дневных EBs, указывая тем самым, что процессы пролиферации и роста запускаются во время формирования 3-дневных EBs и остаются активными на 7 день спонтанной дифференцировки. В самом деле, наши результаты по микромассивам показывают, что некоторые гены усиливают или завершают действие ранее активированных генов. Так, Mcm5 остается активированным у EBs на 7-день, тогда как Mcm2, Mcm3 и Mcm4 усиливают свою активность. Mcm2, Mcm3 и Mcm4 принадлежат тому же самому классу генов, что и Mcm5,т.e., семейство Mcm генов участвует в инициации репликации посредством рекрутирования белков, связанных с репликацией ДНК. Мы могут , следовательно, предположить, что сначала Mcm5, а затем Mcm2, Mcm3 и Mcm4 являются ключевыми генами, способствующими клеточной пролиферации во время ранних стадий дифференцировки ESCs в EBs. Как и ожидалось, мы установили, что усиление активности некоторых др. генов, связанных с клеточным циклом и пролиферацией, включая cyclin D2 (ccnd2) и cell division cycle 6 (cdc6), ответственны за загрузку Mcm белков на ДНК во время репликации ДНК. Мы также установили строгое усиление активности генов, связанных с клеточным ростом. пролиферацией и дифференцировкой: Adamts9 ген, ассоциированный с контролем формы органов во время раннего развития (Clark et al., 2000); Cts1 и Ctgf, гены, участвующие в миграции клеток и рекрутировании мезенхимных стволовых клеток (Luo et al., 2004); Pik3cb ген из семейства ErbB receptor tyrosine kinases (RTKs) участвует в сигнальных путях, регулирующих различные биологические реакции, включая пролиферацию, дифференцировку, подвижность и жизнеспособность клеток (Citri and Yarden, 2006); Ncl, основной крупный ядрышковый белок растущих эукариотических клеток, ассоциированный с индукцией деконденсации хроматина путем соединения с гистоном H1 (Erard et al., 1988); и Loxl2, связанный с биогенезом соединительной ткани (Smith-Mungo and Kagan, 1998). Мы также установили некоторые типичные маркеры недифференцированности, такие как Fbxo15 и Lin28. Сходства, обнаруженные в профилях генной экспрессии 3- и 7-дневных EBs показывают. что анализ экспрессии генов в коротки промежуток дифференцировки необходим, чтобы охарактеризовать молекулярные механизмы, лежащие в основе плюрипотентности и самообновления ESC. Наши результаты находятся в согласии с теми, что представлены Palmqvist et al., где он и продемонстрировали, что основные изменения в экспрессии генов происходят в первые 24 ч спонтанной дифференцировки.

Поскольку методы, касающиеся стволовых клеток, как было установлено, обнаруживают низкий уровень доли подтверждения и воспроизводимости (Evsikov and Solter, 2003, Fortunel et al., 2003, Ivanova et al., 2002), поэтому тестировали воспроизводимость результатов экспрессии генов на второй линии mESC, CGR8. Набор из 867 генов дифференциально и одинаково экспрессировался как в MES3, так и CGR8 mESC линиях, но не во взрослых клетках, а 1587 и 1791 генов дифференциально и одинаково экспрессировались в 3 и 7 дневных EBs, соотв., в обеих mESCs линиях, но не во взрослых клетках. Гены этих категорий включают разного типа коллагены или родственные белки (Col1a1, Col3a1 и Tgfbi) и др. компоненты внеклеточного матрикса (Matrin3 и Mmp3), белки, участвующие в развитии нервов и/или нейромышечном развитии (Pou3f1, Nrp1, Pmp22, Nlk1, Slit2, App, Alcam, Atho8, Prss12 и Gdap1l1), факторы каогуляции крови (F2r), транспортеры (Slc16a1 и Vldlr) и разнообразные регуляторные факторы. участвующие в развитии и морфогенезе тканей (Pou3f1, Tcf15, Meis1, Hmga2, Tbx2, Msx1, Msx2, Kdr, Capn6, Mdfi and Ptpn11).

Высокая изменчивость, обнаруженная в предыдущих исследованиях генной экспрессии в стволовых клетках могут быть результатом трудностей в стандартизации культуральных условий. Наиболее пригодным объяснением изменчивости является то. что идентичные культуральные условия могут оказывать разные эффекты на рост разных линий ES клеток. Мы выращивали наши линии клеток в одной и той же лаб. при идентичных культуральных условиях, это указывает на то. что наши находки могут отражать лежащие в основе биологические различия между линиями клеток скорее, чем различия в культуральных условиях.

In summary, our study provides gene expression profiling of two mouse stem cell lines at baseline state and during their differentiation towards EB formation. Our findings were similar to previous reports in human and mouse stem cells, demonstrating that our approach yields comparable results to those obtained using a different technique. However, we also identified numerous other genes not been previously reported, which may offer novel insights into the behaviour of mouse ESC, the maintenance of their undifferentiated state and the mechanisms underlying their pluripotency, self-renewal and early differentiation.