Экспрессия NKX2-1 и PAX8

Generation of functional thyroid from embryonic stem cells Francesco Antonica, Dominika Figini Kasprzyk, Robert Opitz, Michelina Iacovino, Xiao-Hui Liao, Alexandra Mihaela Dumitrescu, Samuel Refetoff, Kathelijne Peremans, Mario Manto, Michael Kyba & Sabine Costagliola Nature 491 (7422), 66–71 (01 November 2012) doi:10.1038/nature11525
Рисунки к статье См. также Morphogenetics of early thyroid development. Fagman H, Nilsson M. J Mol Endocrinol. 2011 Feb; 46(1):R33-42.	Первичная функция щитовидной железы заключается в метаболизме йодида для синтеза тироидных гормонов, которые являются критическими регуляторами роста, развития м метаболизма почти во всех тканях. До сих пор исследования щитовидной железы не выявили эффективной модельной системы стволовых клеток, которая бы позволяла воспроизводить in vitro молекулярные и морфогенетические события, регулирующие дифференцировку функциональных тироидных фолликулов. Здесь мы показали, что временная избыточная экспрессия транскрипционных факторов NKX2-1 и PAX8 достаточна для непосредственной дифференцировки эмбриональных стволовых клеток мышей в клетки тироидных фолликулов, которые организуются в трехмерные фолликулярные структуры после обработки thyrotropin. Эти возникшие in vitro фолликулы обнаруживают ощутимую активность по органофикации (organification) йодида. Важно, что при трансплантации in vivo мышам, лишенным щитовидной железы, эти флликулы восстанавливали уровни тироидного гормона в плазме и способствовали, последующему симптматическому восстановлению. Т.о., эмбриональные стволовые клетки мышей могут быть индуцированы к дифференцировке в клетки тироидных фолликулов in vitro и могут генерировать функциональную тироидную ткань. Щитовидная железа состоит из двух типов эндокринных клеток thyroid follicular cells (TFCs), которые продуцируют тироидные гормоны T3 и T4 и C-клеток, которые продуируют calcitonin¹. Во взрослой щитовидной железе TFCs организованы в фолликулярные структуры², в которых монослой поляризованных TFCs окружает просветный компартмент, заполненный коллоидной массой, содержащей предшественников тироидных гомонов, связанных с thyroglobulin³. Фолликулярная организация TFCs считается обязательной для эффективного биосинтеза гормона⁴. Было установлено, что NKX2-1 (ref. 5) и PAX8 (ref. 6) функция является жизненно важной для жизнеспособности TFC, дифференцировки² и функции во время тироидного органогенеза и в зрелой тироидной ткани¹. Во время тироидного органогенза начинается совместная экспрессия NKX2-1 (ref. 7) и PAX8 (ref. 8) в небольшой группе вентральной части энтодермальных клеток передней кишки, это первые молекулярные маркеры спецификации клеток в направлении судьбы TFC. Хотя NKX2-1 (ref. 7) и PAX8 (ref. 8) экспрессируются индивдуально в разных тканях и типах клеток, их совместная экспрессия ограничена клетками, детерминированными дифференцироваться в TFCs. Индуцированная избыточная экспрессия определенных транскрипционных факторов, как было установлено, оказывает направленное воздействие на дифференцировку эмбриональных стволовых клеток (ESCs) в специфические типы клеток^9–11. Несмотря на успаех этого экспериментального подхода для дифференцировки и репрограммирования клеток, протоколы, способствующие скоординированной самосборке дифференцированныхы клеток в определенные морфологические единицы с функциональными свойствами, напоминающими ораны и ткани in vivo^12–14 всё ещё редки. В данной работе мы исследовали избыточную экспрессию транскрипционных факторов NKX2-1 и PAX8 для индукции дифференцировки мышиных ESCs в TFCs и для последующего само-образования тироидных фолликулов. In vitro thyroid cell differentiation Поскольку факторы и сигнальные пути, вызывающие совместную экспрессию NKX2-1 и PAX8 пока неизвестны², поэтому мы создали рекомбинантные ESC линии (Fig. 1a and Supplementary Fig. 1a, c, e), в которых экспрессия этих транскрипционных факторов может быть временно индуцирована добавлением doxycycline (Dox; 1 mg ml²¹) в среду¹⁵ (Supplementary Fig. 1b, d, f). Такие генетические манипуляции не влияют на плюрипотентное состяние ESCs (Supplementary Fig. 1g). В нашем экспериментальном подходе индукция с помощью Dox факторов NKX2-1 и PAX8 инициировалась на 4-день культивирования ESC в висячих каплях, чтобы сделать возможной дифференцировку с эмбриоидные тела (Fig. 1b). Мы впервые использовали рекомбинантную линию ESC, в которое воздействие Dox индуцировало избыточную экспрессию NKX2-1 и PAX8 (Supplementary Fig. 1a, b). Спустя 3 дня после воздействия Dox (на дни 4, 5 и 6), выявлялась совместная экспрессия NKX2-1 и PAX8 с помощью флюоресценции почти во всех клетках, обработанных Dox, на 7-й день, но никогда в клетках, инкубированных в отсутствие Dox (Supplementary Fig. 2a). Чтобы определить действительно ли комбинированная активность NKX2-1 и PAX8 способствует дифференцировке TFC, мы сначала исследовали экспрессию различных маркеров TFC с помощью quantitative reverse transcriptase PCR (qRT–PCR). Выявлялась строгая экспрессия мРНК функциональных маркеров, включая thyroid-stimulating hormone (TSH) рецептор (Tshr), sodium/iodide symporter NIS (Slc5a5) и thyroglobulin (Tg) в течение 3-х дней воздействия Dox (Sup plementary Fig. 2b). Экспресия Foxe1, др. ключевого транскрипционного фактора для тироидного развития, также усилавалась (Supplementary Fig. 2b), а NKX2-11 FOXE11 клетки преобладали во всех клеточных культурах (Supplementary Fig. 2c). Интересно, что наш qRT–PCR анализ также демонстрирует сильное увеличение уровней эндогенных мРНК Nkx2-1 и Pax8 (Supplementary Fig. 2d), указывая на аутоиндукцию этих транскрипционных факторов. Итак, эти данные демонстрируют, что принудительная совместная экспрессия NKX2-1 и PAX8 действительно влияет на клеточные судьбы, вызывая дифференцировку в направлении TFC клона. Однако сборка обработанных Dox клеток в трехмерные агрегаты, напоминающие фолликулоподобные эпителиальные структуры, наблюдалась редко при этих условиях. Это верно и для культур клеток, использующих разные протоколы воздействия Dox, подтверждая, что дополнительные факторы могут быть необходимы для обеспечения морфогенеза флликулов. Поэтому мы пеересмотрели протокол воздействия на базе собственных критических наблюдений.

Первичная функция щитовидной железы заключается в метаболизме йодида для синтеза тироидных гормонов, которые являются критическими регуляторами роста, развития м метаболизма почти во всех тканях. До сих пор исследования щитовидной железы не выявили эффективной модельной системы стволовых клеток, которая бы позволяла воспроизводить in vitro молекулярные и морфогенетические события, регулирующие дифференцировку функциональных тироидных фолликулов. Здесь мы показали, что временная избыточная экспрессия транскрипционных факторов NKX2-1 и PAX8 достаточна для непосредственной дифференцировки эмбриональных стволовых клеток мышей в клетки тироидных фолликулов, которые организуются в трехмерные фолликулярные структуры после обработки thyrotropin. Эти возникшие in vitro фолликулы обнаруживают ощутимую активность по органофикации (organification) йодида. Важно, что при трансплантации in vivo мышам, лишенным щитовидной железы, эти флликулы восстанавливали уровни тироидного гормона в плазме и способствовали, последующему симптматическому восстановлению. Т.о., эмбриональные стволовые клетки мышей могут быть индуцированы к дифференцировке в клетки тироидных фолликулов in vitro и могут генерировать функциональную тироидную ткань.

Щитовидная железа состоит из двух типов эндокринных клеток thyroid follicular cells (TFCs), которые продуцируют тироидные гормоны T3 и T4 и C-клеток, которые продуируют calcitonin¹. Во взрослой щитовидной железе TFCs организованы в фолликулярные структуры², в которых монослой поляризованных TFCs окружает просветный компартмент, заполненный коллоидной массой, содержащей предшественников тироидных гомонов, связанных с thyroglobulin³. Фолликулярная организация TFCs считается обязательной для эффективного биосинтеза гормона⁴. Было установлено, что NKX2-1 (ref. 5) и PAX8 (ref. 6) функция является жизненно важной для жизнеспособности TFC, дифференцировки² и функции во время тироидного органогенеза и в зрелой тироидной ткани¹. Во время тироидного органогенза начинается совместная экспрессия NKX2-1 (ref. 7) и PAX8 (ref. 8) в небольшой группе вентральной части энтодермальных клеток передней кишки, это первые молекулярные маркеры спецификации клеток в направлении судьбы TFC. Хотя NKX2-1 (ref. 7) и PAX8 (ref. 8) экспрессируются индивдуально в разных тканях и типах клеток, их совместная экспрессия ограничена клетками, детерминированными дифференцироваться в TFCs. Индуцированная избыточная экспрессия определенных транскрипционных факторов, как было установлено, оказывает направленное воздействие на дифференцировку эмбриональных стволовых клеток (ESCs) в специфические типы клеток^9–11. Несмотря на успаех этого экспериментального подхода для дифференцировки и репрограммирования клеток, протоколы, способствующие скоординированной самосборке дифференцированныхы клеток в определенные морфологические единицы с функциональными свойствами, напоминающими ораны и ткани in vivo^12–14 всё ещё редки. В данной работе мы исследовали избыточную экспрессию транскрипционных факторов NKX2-1 и PAX8 для индукции дифференцировки мышиных ESCs в TFCs и для последующего само-образования тироидных фолликулов.

In vitro thyroid cell differentiation

Поскольку факторы и сигнальные пути, вызывающие совместную экспрессию NKX2-1 и PAX8 пока неизвестны², поэтому мы создали рекомбинантные ESC линии (Fig. 1a and Supplementary Fig. 1a, c, e), в которых экспрессия этих транскрипционных факторов может быть временно индуцирована добавлением doxycycline (Dox; 1 mg ml²¹) в среду¹⁵ (Supplementary Fig. 1b, d, f). Такие генетические манипуляции не влияют на плюрипотентное состяние ESCs (Supplementary Fig. 1g). В нашем экспериментальном подходе индукция с помощью Dox факторов NKX2-1 и PAX8 инициировалась на 4-день культивирования ESC в висячих каплях, чтобы сделать возможной дифференцировку с эмбриоидные тела (Fig. 1b). Мы впервые использовали рекомбинантную линию ESC, в которое воздействие Dox индуцировало избыточную экспрессию NKX2-1 и PAX8 (Supplementary Fig. 1a, b). Спустя 3 дня после воздействия Dox (на дни 4, 5 и 6), выявлялась совместная экспрессия NKX2-1 и PAX8 с помощью флюоресценции почти во всех клетках, обработанных Dox, на 7-й день, но никогда в клетках, инкубированных в отсутствие Dox (Supplementary Fig. 2a). Чтобы определить действительно ли комбинированная активность NKX2-1 и PAX8 способствует дифференцировке TFC, мы сначала исследовали экспрессию различных маркеров TFC с помощью quantitative reverse transcriptase PCR (qRT–PCR). Выявлялась строгая экспрессия мРНК функциональных маркеров, включая thyroid-stimulating hormone (TSH) рецептор (Tshr), sodium/iodide symporter NIS (Slc5a5) и thyroglobulin (Tg) в течение 3-х дней воздействия Dox (Sup plementary Fig. 2b). Экспресия Foxe1, др. ключевого транскрипционного фактора для тироидного развития, также усилавалась (Supplementary Fig. 2b), а NKX2-11 FOXE11 клетки преобладали во всех клеточных культурах (Supplementary Fig. 2c). Интересно, что наш qRT–PCR анализ также демонстрирует сильное увеличение уровней эндогенных мРНК Nkx2-1 и Pax8 (Supplementary Fig. 2d), указывая на аутоиндукцию этих транскрипционных факторов. Итак, эти данные демонстрируют, что принудительная совместная экспрессия NKX2-1 и PAX8 действительно влияет на клеточные судьбы, вызывая дифференцировку в направлении TFC клона. Однако сборка обработанных Dox клеток в трехмерные агрегаты, напоминающие фолликулоподобные эпителиальные структуры, наблюдалась редко при этих условиях. Это верно и для культур клеток, использующих разные протоколы воздействия Dox, подтверждая, что дополнительные факторы могут быть необходимы для обеспечения морфогенеза флликулов. Поэтому мы пеересмотрели протокол воздействия на базе собственных критических наблюдений.