Networking in development

Очерчивание сигнальных путей создает точку старта для понимания сложного развития животных. Ясно, что сигнальные пути организованы в упорядоченные сети, позволяющие осуществлять контекстуальные реакции на различные сигналы, которые управляют онтогенетическими событиями. Нарушение организации этих сетей ассоциирует с тяжелыми болезнями, такими как рак. Понимание молекулярных связей, которые лежат в основе сборки и функционирования таких сетей является критическим для разработки эффективной терапии сложных заболеваний.

Взаимодействия между путями могут осуществляться на многих уровнях. Простые межклеточные контакты приводят к активации внутриклеточных сигналов, которые модулируют сборку белковых комплексов. Клетки также обычно общаются посредством дальнодействующих сигналов, таких как секретируемые морфогены, которые взаимодействуют с рецепторами на удаленных клетках. Эти пути клеточных общений ведут к инициации белковых сигнальных путей, которые влияют на принятия решений о судьбе клеток, пролиферацию клеток, апоптоз, клеточную форму и/или клеточные движения^{1, 2 and 3}. Как клетки определяют отвечать ли и каким образом на внеклеточные стимулы, изучено плохо. Открытие и исследования пути Hippo, основного регулятора тканевого роста и размера органов, проливают некоторый свет на эти взаимоотношения. Путь Hippo взаимодействует непосредственно с несколькими сигнальными каскадами. directly with several signaling cascades.

The Hippo pathway

Генетический скрининг по поиску новых генов опухолевых супрессоров у Drosophila melanogaster первым выявил путь Hippo; его мутации сказывались на конечном росте тканей и помогли в определении фенотипической сигнатуры этого сигнального каскада. Первоначально три вышестоящих фактора были идентифицированы, включая Ste20-like kinase Hippo (Hpo), NDR-like kinase Warts (Wts) и адапторный белок Salvador (Sav) ^{4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10}. Впоследствии некоторые др. компоненты пути были установлены, включая Mob-as-tumor-suppressor (Mats) и наиболее выдающийся нижестоящий медиатор пути, транскрипционный регулятор Yorkie (Yki) [11]. Параллельно исследования на системах млекопитающих выявили важную роль гомологов млекопитающих белкам мух. Фактически, почти в то же самое время, когда был охарактеризован Wts , был идентифицирован YAP, гомолог Yki, в качестве первого белка, содержащего WW домен ^{12 and 13}, названный по сигнатуре остатков триптофана. Путь Hippo высоко консервативен у млекопитающих. Ste20-like киназы Mst1 и Mst2 (гомологи Hpo), с помощью адапторов Sav1 (также известен как WW45; гомолог Sav) и Mobkl1a и Mobkl1b (гомологов Mats), передают сигналы NDR-like киназам Lats1 и Lats2 (гомологам Wts) ^{14, 15 and 16}. Активные Lats1 и Lats2 последовательно фосфорилируют транскрипционные регуляторы TAZ (также известен как Wwtr1) и YAP (гомолог Yki) ^{17, 18 and 19}. Изучение клеточных культур млекопитающих показало, что фосфорилирование TAZ и YAP по ключевому остатку серина (Ser89 TAZ человека и Ser127 в YAP человека) способствует связыванию белков 14-3-3. Это событие вместе с фосфорилированием др. специфических остатков серина (Ser66, Ser117, Ser311 в TAZ человека [18] и Ser61, Ser109, Ser164, Ser381 в YAP человека [19]), приводит к цитоплазматическому секвестрированию TAZ и YAP и т. о., к ингибированию их транскрипционной регуляторной активности ^{18, 19, 20 and 21}. Генетика мух подтвердила эти наблюдения и показала, одной из критических ролей пути Hippo является фосфорилирование Yki и ограничение его транскрипционной активности ^{17, 22 and 23}.

Integrating Hippo pathway signals in the nucleus

Подобно большинству сигнальных каскадов прежде всего продукт каскада Hippo регулирует транскрипцию. TAZ и YAP (и Yki) не соединяются непосредственно с ДНК и поэтому д. рекрутироваться на ДНК с помощью транскрипционных факторов [24]. Некоторые из первых охарактеризованных партнеров по связыванию TAZ и YAP были Runt domain-содержащими Runx транскрипционные факторы ^{12, 25 and 26}. Члены семейства Runx играют ключевые роли в регуляции дифференцировки мезенхимных стволовых клеток во время формирования кости [27] , следовательно, регуляция активности Runx с помощью TAZ или YAP затрагивает дифференцировку мезенхимных стволовых клеток ^{28 and 29}.

Др. хорошо изученный субнабор транскрипционных факторов, контролируемый с помощью YAP это p53-родственное семейство p73 белков. Домен WW YAP соединяется с PPXY-содержащими членами семейства p73, тем самым способствуя их транскрипционной активности ^{20, 30 and 31.} YAP связывание также защищает p73 от ubiquitin-обеспечиваемой деградации путем предупреждения взаимодействия с WW-domain содержащими ubiquitin лигазами [32]. Итак, p73 и YAP воздействуют на ряд генов, включая PML, которые взаимодействуют с YAP, приводя к их sumoylation и стабилизации ^{30 and 33}. Это создает feed-forward ауторегуляторный circuit, который управляет апоптозом. Интересно, что поскольку генетические исследования на D. melanogaster предполагают, что Yki ингибирует апоптоз [11], а исследования p73 показывают, что YAP может также участвовать в передаче проапоптических сигналов [20]. Следовательно, очевидно, что путь Hippo может играть роль в обоих процессах, хотя временные и контекстуальные детерминанты для переключения между этими биологическим исходами остаются неизвестными.

Лучше всего описаны транскрипционные факторы, регулируемые с помощью TAZ and YAP, это семейства TEAD/TEF ДНК связывающих белков, которые у человека и мыши состоят из 4-х высоко гомологичных членов, которые широко экспрессируются в различных тканях [34]. TAZ и YAP строго связывают TEADs, чтобы способствовать их транскрипционной активности ^{35 and 36}. N-терминальный домен TAZ и YAP состоят из двух коротких спиралей и скрученной спиральной области, которая обернута вокруг immunoglobulin-подобного домена на C-конце TEADs ^{37, 38 and 39}. Аминокислотные замен7ы внутри связывающих последовательностей, такие как Ser94Ala в YAP человека или Ser51Ala в TAZ человека, нарушают взаимодействия с TEADs ^{40 and 41}. Семейство TEAD участвует в тканевой рост-регулирующей активности TAZ и YAP ^{41 and 42}. Гомолог TEAD у D. melanogaster, Scalloped, соединяется с Yki и обеспечивает способствующую росту активность Yki, указывая на консервацию его роли^{43, 44 and 45}. Существуют убедительные ассоциации между TEAD-обеспечиваемой пролиферацией клеток и TAZ и YAP. Избыточная экспрессия TAZ или YAP в линиях эпителиальных клеток, таких как MCF10Aклетки, приводит к приобретению онкогенных свойств, включая гиперпролиферацию, независимый от прикрепления рост и эпителиально-мезенхимный переход (EMT) ^{18 and 46}. Онкогенные свойства, ассоциированные с избыточной экспрессией TAZ или YAP связаны с активностью TEAD, поскольку нарушение связывания TEAD устраняет эти фенотипы^{40 and 41}. TAZ и YAP-зависимая регуляция активности TEAD также играет критические роли во время развития животных, включая регуляцию развития нервной трубки, хорды и сомитов [47]. Во время развития нервной трубки активность YAP-TEAD управляет экспрессией Pax3 для индукции нервного гребня [48], и также вносит вклад в поддержание популяции клеток нервных предшественников путем индукции пролиферации посредством регуляции cyclin D1, и ингибирования дифференцировки путем супрессии NeuroM [49].

Выявляется общие роли TAZ и YAP в регуляции популяции эмбриональных и соматических стволовых клеток и в решениях судеб клеток. TAZ выполняет критическую роль в регуляции дифференцировки мезенхимных стволовых клеток [28]. В этой роли, TAZ связывание с транскрипционным фактором Runx2 способствует спецификации в остеобластный клон, тогда как связывание TAZ с транскрипционным фактором PPARγ ингибирует адипогенез [28]. Недавние исследования in vivo в коже показали, что локализация в ядре YAP строго коррелирует с пролиферативным потенциалом однослойных базальных эпидермальных предшественников, при этом сдвиг YAP в цитоплазму сопровождается дифференцировкой волосяных фолликулов ^{50, 51 and 52}. Эктопическая экспрессия YAP увеличивает количество базовых эпидермальных предшественников и предупреждает их терминальную дифференцировку, приводя к образованию опухолей^{50 and 51}. Сходный сценарий существует в тонком кишечнике мыши, где избыточная экспрессия YAP ведет к экспансии недифференцированных клеток предшественников и в конечном итоге к кишечной дисплазии [53]. Интересно, что регуляция активности пути Wnt и Notch в этих клетках предшественниках нарушена, это указывает на интеграцию передачи сигналов Hippo с этими путями. Сходные результаты были получены на кишечнике и оптической доле D. melanogaster, при этом ядерный Yki способствовал экспансии популяций клеток предшественников^{54, 55, 56, 57 and 58}. В этих случаях генетические взаимоотношения между передачей сигналов Hippo и JAK-STAT очевидны, это указывает на дополнительный путь взаимодействия, который необходимо исследовать.

Очевидная роль TAZ и YAP в регуляции выбора клеточной судьбы может быть у преимплантационных эмбрионов мыши. Т.к. клетки на стадии морулы делятся, внутренние клетки становятся компактными с помощью наружных клеток [2]. локализация TAZ и YAP регулируется во время этого процесса, при этом наружные клетки содержат TAZ и YAP в ядре, тогда как внутренние клетки, которые формируют inner cell mass (ICM), содержат их в цитоплазме [59]. В наружных клетках ядерные TAZ и YAP связывают TEAD4, чтобы стимулировать экспрессию Cdx2, который специфицирует эти клетки в клон трофэктодермы [59]. Удаление TAZ и YAP у модельных мышей нарушает спецификацию клеточных судеб во время преимплантационного развития [59]. Делеция только YAP приводит к летальности приблизительно на день эмбриогенеза (E) E8.5 [37], а делеция TAZ к летальности перинатальных поздних нейронов с неполной пенетрантностью^{60, 61 and 62}. Это функциональное перекрывание между TAZ и YAP важно для управления ранних онтогенетических событий.

Ключевая роль также отведена TAZ и YAP в регуляции embryonic stem cell (ESC), это подчеркивает взаимоотношения между путем Hippo и передачей сигналов, инициируемой сверхсемейством transforming growth factor beta (TGF-β ). Плюрипотентность ESC человека, которая базируется на передаче сигналов TGF-β -Smad ^{63 and 64}, зависит от активности TAZ activity [65]. YAP выполняет сходную роль, контролируя состояние стволовых клеток ESCs мышей, а также процесс репрограммирования мышиных фибробластов в индуцированное плюрипотентное состояние (iPS) путем регуляции реакций bone morphogenetic protein (BMP)-Smad ^{66 and 67}. Это и др. исследования показали, что путь Hippo интимно связан с передачей сигналов TGF-β (Figure 1).

Figure 1. Cell density-mediated control of the Hippo pathway directs TGF-β signaling. (a) At low cell density the Hippo pathway kinases LATS1/2 are inactive, resulting in increased nuclear localization of TAZ/YAP. Upon TGF-β stimulation SMAD complexes form and bind to TAZ/YAP in the nucleus. TAZ/YAP retains SMAD complexes in the nucleus and facilities the recruitment of key transcriptional machinery to drive transcriptional events. (b) At high cell density, polarity-regulating proteins are recruited to sites of cell contact. The apically localized Crumbs polarity complex, as well as the adherens junction-localized protein a-catenin, form contacts with TAZ/YAP and facilitate their phosphorylation by active LATS1/2 kinases. Phosphorylation of TAZ/YAP mediates binding with 14-3-3 proteins, thereby resulting in their cytoplasmic localization. Following TGF-β stimulation, SMAD complexes bind to cytoplasmic TAZ/YAP and nuclear transcriptional events are inhibited.

Сверхсемейство белков TGF-β это группа секретируемых морфогенов, представленная TGF-β s, BMPs, activins и growth differentiation factors. Эти морфогены передают сигналы путем связывания serine-threonine киназных рецепторов, которые фосфорилируют регулируемые этими рецепторами Smad (R-Smad) белки. Разные R-Smads обеспечивают разные реакции; Smad2 и Smad3 опосредуют передачу сигналов TGF-β и activin, тогда как Smad1, Smad5 и Smad8 распространяют сигналы BMP. Фосфорилированные R-Smads соединяются с co-Smad, Smad4 и затем накапливаются в ядре, чтобы регулировать транскрипцию. Комплексы Smad сами по себе обладают низким сродством связывания ДНК; однако они могут находить специфические регуляторные элементы благодаря ассоциации с др. транскрипционными факторами, связывающимися с ДНК, чтобы мощно активировать транскрипцию ^{68, 69 and 70}.

Склонность R-Smads соединяться с TAZ выявлена в результате высокопроизводительного скрининга с целью идентификации новых регуляторов передачи сигналов TGF-β [65]. TAZ , как было установлено, ассоциирует с гетеромерными регулируемыми с помощью TGF-β комплексами R-Smad-Smad4 [65]. Позднее YAP, как было установлено, связывает регулируемые с помощью BMP Smad1/5/8 и регулируемые с помощью TGF-β Smad2/3 ^{66 and 71}. Взаимодействие TAZ и YAP с комплексами Smad ведет к их рекрутированию на TGF-β - или BMP-регулируемые энхансеры, где они управляют TGF-β - и BMP-регулируемыми транскрипционными событиями^{65 and 66} (Figure 1a). Нокдаун TAZ и/или YAP устраняет передачу сигналов, обеспечиваемую с помощью Smads ^{65, 66 and 71}. Интересно, что исследования нокдауна также установили, что Smads не способны накапливаться в ядре в ответ на TGF-β в отсутствие TAZ и/или YAP ^{65 and 71}. Т.о., TAZ и YAP обеспечивают TGF-β -вызываемое накопление в ядре Smad. Принимая во внимание, что Smads ассоциируют с рядом др. транскрипционных факторов, включая некоторые TAZ- и YAP-регулируемые факторы, такие как Runx и члены семейства, родственные p53^{72 and 73}, то возможно, что TAZ и YAP рекрутируют Smads, чтобы интегрировать TGF-β сигналы с функцией этих белков. Верно ли это для всех TAZ- и YAP-регулируемых факторов, включая TEADs, предстоит выяснить.

TAZ и YAP интегрируют аппарат регуляции транскрипции со Smads. Напр., Mediator комплекс, как полагают, участвует в регуляции TAZ/YAP-Smad, поскольку TAZ взаимодействует с компонентом Mediator ARC105, способным собирать активный транскрипционный аппарат [65]. Более того, YAP-Smad1 взаимодействие регулируется с помощью ассоциированной с Mediator киназы CDK8 и CDK9 [66], которые фосфорилируют линкерный домен Smad1, чтобы сделать доступным мотив PPXY и способствовать соединению с YAP WW доменами [66]. Сериновые остатки в линкерном домене Smad1 также способствуют взаимодействию с YAP [66], хотя взаимодействие Smad3-YAP не регулируется с помощью фосфорилирования линкерного домена [66], и взаимодействие TAZ-Smad2/3 обеспечивается с помощью региона в TAZ, который является C-терминальным к WW домены [65]. Это указывает на то, что TGF-β - и BMP-регулируемые Smads могут соединяться по разному с TAZ и YAP. Напротив, TAZ и YAP могут соединяться с Smads посредством множественных интрфейсов, которые могут по-разному регулироваться, чтобы облегчать разные молекулярные функции помимо транскрипционной активности. Напр., связывание YAP WW домена с PPXY мотивом Smad1 может предупреждать связывание WW домен содержащего Smurf и Nedd4L HECT доменовой ubiquitin лигазы, стабилизируя тем самым Smads [74].

Взаимоотношения между нижестоящими эффекторами пути Hippo и белками Smad законсервированы у D. melanogaster. Yki может соединяться с Mad, мушиным гомологом Smad1/5/8 ^{66 и 75}, а способствующая росту активность Yki действует синергично с Dpp-обусловленной активностью Mad (Dpp является гомологом BMP). In vivo доказательства указывают на кооперацию Mad и Yki-обеспечиваемой транскрипции, в частности в регуляции micro-RNA гена bantam ^{75 and 76}. Интересно, что передача сигналов Dpp морфогена может также влиять на экспрессию и локализацию компонентов пути передачи сигналов Fat-Hippo [77], указывая на регуляторные механизмы обратной связи. Т.о., существует сложная сеть между передачей сигналов TGF-β и медиаторами пути Hippo; для понимания этой сети необходимы дальнейшие исследования.

Путь Hippo регулирует также Wnt-индуцируемую передачу сигналов ^{77 and 78}, др. важный медиатор развития животных^{79, 80 and 81}. Wnt транскрипционные ответы в основном трансдуцируются с помощью β-catenin. В отсутствие Wnt лигандов, β-catenin становится нестабильным из-за обусловленной ubiquitin протеосомной деградации. После стимуляции Wnt деградация β-catenin комплекса ингибируется, приводя к накоплению в ядре β-catenin и активации экспрессии генов мишеней. Взаимодействие между Hippo и Wnt, частично, осуществляется в ядре на транскрипционном уровне (Figure 2), это выявляется при исследовании эффектов пути Hippo у мутантных мышей на развитие сердца [77]. Специфичный для сердечной мышцы обусловленный нокаут Sav или Lats2, или обусловленный двойной нокаут Mst1 и Mst2, увеличивает активность ядерного YAP и это способствует увеличению пролиферации кардиомиоцитов увеличению сердца в размерах. Определение профиля экспрессии у этих мутантов выявило повышенную Wnt signature, это подтверждает, что снижение активности пути Hippo способствует передаче сигналов Wnt/β-catenin. Соответственно, локализация в ядре β-catenin увеличивается у мутантов Sav mutants, а обусловленное удаление одного аллеля β-catenin супрессирует большинство из ассоциированных дефектов. YAP рекрутируется на сайты связывания TCF/LEF вместе с β-catenin, показывая, что YAP участвует посредством своей ядерной функции в передаче сигналов Wnt/β-catenin.

Figure 2. Crosstalk between the Hippo and Wnt/β-catenin pathways. High Hippo-pathway kinase activity leads to cytoplasmic localization of TAZ and YAP. Cytoplasmic TAZ binds to DVL, thereby inhibiting the Wnt-induced phosphorylation of DVL proteins. As a consequence, β-catenin levels and nuclear accumulation are inhibited, thus, keeping Wnt/β-catenin signaling low. Following the inhibition of Hippo pathway kinases TAZ and YAP accumulate in the nucleus, resulting in increased Wnt/β-catenin signaling. This is achieved by relieving the inhibitory role that TAZ has on DVL in the cytoplasm, and also by promoting nuclear interactions between YAP and β-catenin, which facilitates TEAD and TCF/LEF-mediated transcriptional synergy.

Cytoplasmic roles for TAZ and YAP

Некоторые исследования показали, что роль транскрипционных регуляторов TAZ и YAP имеет критический аспект их функции. Однако механизмы, ведущие к цитоплазматической локализации TAZ и YAP, могут способствовать дополнительным 'неканоническим' цитоплазматическим функциям этих белков. Согласно некоторым исследованиям эти цитоплазматические функции могут быть более важными, чем это предполагалось ранее.

Одной из ролей TAZ и YAP в цитоплазме является ингибирование TGF-β -регулируемых Smad сигналов. Одним из примеров является соединение YAP с ингибирующим Smad7 белком, который выполняет роль по снижению активности рецептора TGF-β [82]. Др. роль, связанная с цитоплазматическими TAZ и YAP, заключается в поддержании TGF-β -активируемых Smad комплексов в цитоплазме, тем самым ограничивая накопление Smad в ядре (Figure 1b). Эффекты плотности эпителиальных клеток на локализацию TAZ, YAP и Smads поразительны. При высокой плотности клеток Smad белки, вместе с TAZ и YAP, являются цитоплазматическими даже в присутствии экзогенного TGF-β лиганда [71]. Разрушение клеточных контактов или RNAi-обусловленный нокдаун Lats1 и Lats2 киназ, приводят к увеличению TAZ и YAP в ядре и соотв. к увеличению в ядре Smad комплексов [71], подтверждая, что эти белки находятся под одними и теми же контрольными механизмами.

Типичным примером эффектов плотности клеток на локализацию TAZ и YAP in vivo является ранние стадии развития эмбрионов мыши. Как упоминалось ранее, TAZ и YAP являются ядерными в клетках наружной трофэктодермы и цитоплазматическими в ICM ст. поздней морулы и у эмбрионов ст. бластоциста [59]. Локализация Smad2/3 у преимплантационных эмбрионов мыши коррелирует с локализацией TAZ и YAP и регулируется с помощью Lats киназ ^{59 and 71}. На поздней стадии пре-гаструлярные эмбрионы мыши, у которых передача сигналов TGF-β /Smad, как полагают, является центральным регулятором формирования паттерна эмбрионов [83], наблюдаются сходные корреляции между TAZ, YAP и Smad2 [71]. В частности, клетки, которые дают висцеральную энтодерму, имеют ядерные TAZ м YAP вместе с ядерной локализацией Smad2/3, тогда как клетки в соседнем эпибласте обнаруживают фосфорилированный и преимущественно цитоплазматическую локализацию YAP, одновременно со снижением ядерных Smad2/3. Т.о., активность пути Hippo может играть ключевую роль в формирования паттерна ранних эмбрионов мыши путем контроля компетентности клеток отвечать на TGF-β -обеспечиваемые сигналы. Интересно, принимая во внимание, что комплексы Smad в цитоплазме эпибласта находятся в своем фосфорилированном активном состоянии, то это может обеспечивать как память клеток на воздействие TGF-β лигандов, так и механизм индукции быстрых реакций Smad, такой как то, что необходим для гаструляции.

Др. цитоплазматические функции TAZ и YAP также описаны. Подобно взаимоотношению с передачей сигналов TGF-β, взаимодействие между путем Hippo и путем Wnt выявлено с помощью высокопроизводительного скрининга [84]. TAZ, как было установлено, обладает цитоплазматической ингибирующей ролью в передаче сигналов Wnt/β-catenin [78] (Figure 2). Wnt-индуцированная ядерная активность β-catenin увеличивается или при нокдауне TAZ, или при сдвиге локализации TAZ в ядро в результате вмешательства Lats киназ. Ингибирование передачи сигналов Wnt обусловлено альтерациями в фосфорилировании DVL. Белки DVL являются интегральными членами каскада пути Wnt, который функционирует выше в пути, чтобы регулировать комплекс деструкции β-catenin. TAZ соединяется с DVL белками, ингибируя тем самым фосфорилирование DVL с помощью casein kinase 1-delta и -epsilon киназ (CK1δ/ε), способствуя тем самым деградации β-catenin.

Др. потенциальной цитоплазматической функцией для TAZ является каркасная для SCF/β-TrCP ubiquitin лигазного комплекса [62]. TAZ обладает мотивом phosphodegron на своем C-конце, который действует, чтобы рекрутировать β-TrCP и способствовать ubiquitination и последующей протеосомной деградации проницаемого для кальция катионового канала protein polycystin 2 (PC2) [62]. Тот же самый phosphodegron также важен для регуляции TAZ и YAP, поскольку этот мотив фосфорилируется с помощью Lats1/2 киназ, подготавливая его для последующего фосфорилирования с помощью CK1δ/ε ^{85 and 86}. Этот второй раунд фосфорилирования с помощью CK1δ/ε способствует взаимодействию с SCF/β-TrCP, чтобы способствовать убиквитинированию TAZ и YAP, приводя к их протеосомной деградации.

TAZ также играет роль в регуляции образования первичной реснички. Первичные реснички являются органеллами, базирующимися на микротрубочках, которые отходят от клетки и, как полагают, функционируют в качестве сенсоров внеклеточной среды. Субпопуляция TAZ локализуется в первичных ресничках, а нокдаун TAZ вызывает уменьшение длины ресничек^{60 and 62}. В соответствии с этим, TAZ нокаутные мыши обнаруживают тяжелый поликистоз почек с цистозными регионами, обнаруживающими повышенные уровни передачи сигналов Wnt/β-catenin и нарушенную целостность ресничек^{60, 61 and 62}. TAZ регуляция стабильности PC2 может быть важной частью его функции в ресничках. Эта роль TAZ регулируется посредством взаимодействия с Nek1, которая является NIMA-родственной протеин киназой, важной для стабильности центросом и образования ресничек^{62 and 87}. Nek1 фосфорилирует TAZ, и это ингибирует TAZ-зависимую регуляцию стабильности PC2. С др. стороны, TAZ направляет Nek1 на ubiquitination и последующую деградацию. Вместе с тем взаимоотношение между TAZ и Nek1 создает механизм для тонкой настройки уровней PC2. Интересно, что ассоциированный с ресничками белок NPHP4 взаимодействует с LATS2, чтобы регулировать негативно путь Hippo [88], указывая, что TAZ, и возможно YAP, регуляция ресничек использует активность пути Hippo. TAZ и YAP могут также влиять на сигнальные события, которые связаны с ресничками. Напр., реснички, содержат Glis3 транскрипционный фактор, которые обнаруживает высокую степень гомологии с Hedgehog-регулируемыми Gli транскрипционными факторами, который регулируется с помощью TAZ [89]. Передача сигналов Hedgehog интимно связана с первичными ресничками [90], и, следовательно, могут существовать пока не открытые ассоциации между передачей сигналов Hedgehog и путем Hippo. Доказательства взаимосвязи между двумя путями получены на Hedgehog-ассоциированных медуллобластомах, которые базируются на ядерном YAP , чтобы распространять туморогенные сигналы [91]. Итак, первичные реснички могут функционировать в качестве центрального организующего центра для Hippo, Hedgehog, Wnt и др. сигнальных путей [90]. Однако понимание молекулярных механизмов, связанных с этими сигналами требует дальнейших исследований.

Regulators of the Hippo pathway

Внутриклеточная локализация TAZ и YAP оказывает огромное влияние на способность клеток пролиферировать и отвечать на внешние сигналы. Следовательно, понимание природы сигналов, которые воспринимают внешнее окружение и передают информацию пути Hippo, является важным. Первый трансмембранный белок, участвующий в качестве вышестоящего регулятора передачи сигналов Hippo, это атипичный cadherin Fat (Ft), генетический анализ на мухах подтвердил, что он функционирует в качестве одного (из многих) сигналов клеточной поверхности, который контролирует активность пути Hippo^92-95. Dachsous (Ds), др. атипичный cadherin, соединяется с внеклеточным доменом Ft, и вместе они регулируют активность пути Hippo^{92, 96 and 97}. Как Ft и Ds сигналы передаются пути Hippo расшифровано неполностью, но исследования предполагают, что они действуют , по крайней мере, частично посредством FERM доменового белка Expanded (Ex) ^{92, 93, 94, 95 and 98}. Гомологи Ex у млекопитающих, такие как FRMD6 (также известен как Willin), также, как полагают, регулируют активность пути Hippo, но понимание этих соединений нуждается в дальнейшем анализе [99]. Др. FERM доменовый белок, известный как Merlin (Mer), также связан с путем Hippo; у мух Mer и Ex взаимодействуют и локализуются в апикальном домене клеток и действуют перекрываясь, чтобы регулировать продукцию пути Hippo [100]. В одном исследовании было предположено, что Ex ингибирует накопление в ядре Yki частично путем непосредственного секвенирования Yki на мембране [101], тогда как др. исследование показало, что Mer и Ex способствуют фосфорилированию Wts и активности киназ [100]. Эта последняя функция может быть связана с ролью белка Kibra, который у мух связывает и Mer и Ex ^{102, 103 and 104}. Мушиная генетика помещает Kibra выше Hippo киназ и Kibra ассоциирует с и регулирует Wts и Lats2 [105]. Хотя существует ассоциация между Mer, Ex и Kibra, непосредственный механизм, с помощью которого этот комплекс белков осуществляет свои сигнальные функции не совсем ясен.

Мышиные модели также подтверждают роль Merlin в регуляции активности пути Hippo. Merlin, кодируется геном NF2, давно изучен благодаря мутации при нейрофиброматозе типа II, наследственном заболевании, которое приводит к развитию билатеральных вестибулярных schwannomas [106]. Делеция NF2 в печени мыши приводит к гепатоцеллюлярным карциномам и это может быть частично устранено делецией одной копии гена Yap [107]. Однако воздействует ли NF2 непосредственно на активность YAP оспаривается др. группой, которая связывает гепатоцеллюлярную карциному в NF2^-/- почках с аберрантной активностью epidermal growth factor receptor (EGFR) [108]. Вообще-то два события связаны, т.к. экспрессия YAP усиливает экспрессию EGFR лиганда amphiregulin, который способствует не клеточно-автономным событиям [109]. Интересно, что хотя молекулярные детали соединения путей Merlin и Hippo всё ещё не расшифрованы целиком, способ действия Merlin может быть установлен по недавно описанным взаимодействиям с Angiomotin (Amot) и Crumbs polarity-complex компонентами Pals1 и PatJ [110]. Эти взаимодействия, по-видимому, связаны с ролью Merlin в организации сборки α-catenin и Par3 соединительного комплекса[111], каждый из них важен для становления клеточной полярности.

Клеточная полярность обеспечивается комбинированным действием ряда белковых комплексов. Становление эпителиальной апикально-базальной полярности описано лучше всего на молекулярном уровне, существуют три основных регуляторных комплекса: Crumbs (представленный Crb1-3, Pals1, Mpdz, PatJ и Lin7c), Par (представленный Par6, Par3 и aPKC) и Scribble (представленный Scrib, Dlg и Llgl) ^{112 and 113}. Взаимодействия клеточной адгезии между трансмембранными cadherins, такими как E-cadherin, ведут к рекрутированию белков слипчивых соединений, таких как β-catenin и позднее, α-catenin, последний из них управляет реорганизацией актинового цитоскелета и инициирует образование плотных соединений и рекрутирование комплекса Par [114]. Доставка Par комплексов в плотные соединения, в свою очередь, это способствует апикальной локализации комплекса Crumbs и базальной локализации комплекса Scrib, это способствует апикально-базальной полярности [113].

Генетические исследования на D. melanogaster идентифицировали Crumbs, трансмембранный компонент комплекса Crumbs, в качестве регулятора активности пути Hippo^115-118. Эти исследования подтвердили, что Crumbs соединяется непосредственно с Ex, управляя локализацией Yki localization ^115-118. Работы на млекопитающих также показали, что комплекс Crumbs связан с регуляцией TAZ и YAP. Интересно, что компоненты Crumbs комплекса и ассоциированный белок Amot соединяется с TAZ и YAP ^{71, 119-121}. Вместе эти белки регулируют фосфорилирование и локализацию TAZ и YAP (Figure 1b). Кроме того, α-catenin ассоциирует также с YAP [51], подтверждая, что множественные белки, важные для становления полярности, вносят вклад в регуляцию медиаторов нижестоящего пути Hippo. Вмешательство межклеточной адгезии или нокаут Crb3, Pals1, Amot или α-catenin, приводит к снижению TAZ и/или YAP фосфорилирования и увеличению ядерной локализации и транскрипционной активности. Т.о., сборка комплекса Crumbs сопровождается апикально-базальной поляризацией клеток, предоставляет механизм восприятия клеточного контакта и плотности и передачи этой информации пути Hippo.

Локализация TAZ и YAP также связана с клеточной морфологией и с механическими сигналами, которые воздействуют на цитоскелет^122-124. Повышение клеточного натяжения способствует локализации TAZ и YAP в ядре, тогда как потеря клеточного напряжения увеличивает tunj цитоплазматическую локализацию^{122 and 124}. Наблюдения культур клеток млекопитающих и D. melanogaster показали, что уровни F-actin вносят вклад в регуляцию активности TAZ, YAP и Yki^122-124. Напр., нарушение регуляции actin-capping белкового αβ гетеродимера у D. melanogaster, которое приводит к аномальному накоплению апикального F-actin, ингибирует ядерную активность Yki [125]. Малыми молекулами обусловленное нарушение полимеризации актина в клетках млекопитающих также приводит к ингибированию активности в ядре TAZ и YAP^122-124. Однако, F-actin per se не может быть ключевым воздействующим фактором; вместо него ключом может быть обилие стрессовых волокон и активность Rho, которые регулируются с помощью механических сил и затем действуют как медиаторы локализации TAZ/YAP [122]. Некоторые из связанных с механическими силами эффекты на TAZ и YAP, как полагают, обеспечиваются посредством Hippo киназ^{123 and 124}, тогда как др. эффекты могут оказаться независимыми от этих киназ [122]. Хотя этот способ регуляции TAZ и YAP важен для регуляции дифференцировки мезенхимных стволовых клеток [122], всё ещё неясно, как механическими силами обеспечиваемая регуляция оказывает столь широко распространенную влияние на физиологические процессы.

Polarity, Hippo and cancer

Исследования показали, что ядерные активности TAZ и YAP способствуют онкогенному потенциалу клеток^{15 and 16}. Многочисленные исследования также установили связь между клеточной полярностью, началом и прогрессированием рака ^{126 and 127}. Фактически потеря клеточной полярности может быть не только следствием клеточной трансформации, но и также причиной. Следовательно, связь между путём Hippo и полярностью предоставляет потенциальное объяснение этим наблюдениям. Особенно интересно взаимоотношение между путем Hippo и передачей сигналов TGF-β. Давно известно, что во время ранних стадий рака TGF-β ингибирует ход клеточного цикла, тогда как на более поздних стадиях TGF-β способствует пролиферации, EMT и метастазированию^{128 and 129}. Поляризованные эпителиальные клетки обладают цитоплазматическими TAZ и YAP, и это ограничивает TGF-β -индуцируемую активность Smad [71]. Это согласуется с наблюдениями, что большинство эпителиальных клеток не подвергаются индуцированному с помощью TGF-β EMT [130]. Однако потеря комплексов Crumbs приводит к увеличению ядерных TAZ и YAP, повышению накопления в ядре Smad и усилению чувствительности к TGF-β лиганду [71]. Это приводит к изменению транскрипционной программы, управляемой с помощью Smad-зависимой активности, которая способствует EMT и трансформированному фенотипу [71]. В соответствии с этим потеря Crb3 в эпителиальных моделях in vivo способствует прогрессированию опухолей [131]. Т.о., статус активности пути Hippo может быть одним из различий, которое делает различной роль TGF-β на ранних в противовес поздним стадиям рака в контексте инициации и прогрессии опухоли .

Concluding remarks

The Hippo pathway appears to be an active participant at most levels of animal development and controls both cell-fate determination and tissue growth. The pathway is involved in complex signaling networks that are only beginning to be dissected. Despite the tremendous progress that has been made to date, many questions remain unanswered. For example, the mechanisms connecting upstream regulators with individual components of the pathway are largely unknown. There has also been progress with respect to characterization of the Hippo pathway in stem cell regulation, but the molecular details generally remain elusive. Because these questions have close ties to cancer progression and other human diseases, much work is needed before we can start to grasp fully the scope of the pathway and how extensively it is intertwined with morphogen signaling pathways. Fortunately, the study of the Hippo pathway is still at its infancy and there is much to discover. As time passes more researchers are taking note of its importance, and this will lead to novel approaches to study the pathway. Given its importance, the knowledge we gain will hopefully lead us to the development of therapies for diseases such as cancer, and tools to manipulate stem cells for the regeneration of tissues and organs.

Coordinating developmental signaling: novel roles for the Hippo pathway Xaralabos Varelas , Jeffrey L. Wrana Trends in Cell.Biol. Volume 22, Issue 2, February 2012, Pages 88–96

Coordinating developmental signaling: novel roles for the Hippo pathway
Xaralabos Varelas , Jeffrey L. Wrana
Trends in Cell.Biol. Volume 22, Issue 2, February 2012, Pages 88–96