Посещений:
ФОРМИРОВАНИЕ ЛЕВО-ПРАВОСТОРОННЕГО ПАТТЕРНА

Роль энтодермы кишки

Role of the Gut Endoderm in Relaying Left-Right Patterning in Mice
Manuel Viotti, Lei Niu, Song-Hai Shi, Anna-Katerina Hadjantonakis
PLoS Biol. (2012) 10(3): e1001276. doi:10.1371/journal.pbio.1001276

Establishment of left-right (LR) asymmetry occurs after gastrulation commences and utilizes a conserved cascade of events. In the mouse, LR symmetry is broken at a midline structure, the node, and involves signal relay to the lateral plate, where it results in asymmetric organ morphogenesis. How information transmits from the node to the distantly situated lateral plate remains unclear. Noting that embryos lacking Sox17 exhibit defects in both gut endoderm formation and LR patterning, we investigated a potential connection between these two processes. We observed an endoderm-specific absence of the critical gap junction component, Connexin43 (Cx43), in Sox17 mutants. Iontophoretic dye injection experiments revealed planar gap junction coupling across the gut endoderm in wild-type but not Sox17 mutant embryos. They also revealed uncoupling of left and right sides of the gut endoderm in an isolated domain of gap junction intercellular communication at the midline, which in principle could function as a barrier to communication between the left and right sides of the embryo. The role for gap junction communication in LR patterning was confirmed by pharmacological inhibition, which molecularly recapitulated the mutant phenotype. Collectively, our data demonstrate that Cx43-mediated communication across gap junctions within the gut endoderm serves as a mechanism for information relay between node and lateral plate in a process that is critical for the establishment of LR asymmetry in mice.


Рис.1.  |  Sox17 mutants fail to establish LR asymmetry.


Рис.2.  |  Sox17 mutants exhibit a failure in emVE dispersal.


Рис.2.  |  Sox17 mutants exhibit a failure in emVE dispersal.


Рис.3.  |  Sox17 is localized throughout gut endoderm cells, but absent from n


Рис.5.  |  Connexin43 is not localized in the gut endoderm of Sox17 mutants.


Рис.6.  |  Gap junction coupling across endoderm of wild-type but not Sox17 m


Рис.7.  |  Gap junction inhibition affects LR asymmetry establishment.


Рис.8.  |  Working model for role of gut endoderm in LR asymmetry establishm

Superficially, humans, like other vertebrates, are bilaterally symmetrical. Nonetheless, the internal configuration of visceral organs reveals a stereotypical asymmetry. For example, human hearts are generally located on the left and the liver on the right side within the body cavity. How this left-right asymmetry is established is an area of interest, for both intrinsic biological significance and its medical application. In the mouse, the initial event that breaks left-right symmetry occurs at the node, a specialized organ located in the midline of the developing embryo. Somehow this initial asymmetry leads to a cascade of events that results in the activation of a genetic circuit on the left side of the embryo, which then leads to asymmetric organ formation. Here we show that the laterality information that is generated at the node is transferred to the lateral extremity of the embryo across the gut endoderm, which is the precursor tissue of the respiratory and digestive tracts and associated organs such as lungs, liver, and pancreas. Sox17 mutant mouse embryos exhibit defects in gut endoderm formation and fail to establish left-right asymmetry. Analysis of the mutants reveals that gap junction coupling across the gut endoderm is the mechanism of left-right information relay from the midline site of symmetry breaking to the site of asymmetric organogenesis in mice. Становление основных осей эмбриона (передне-задней, дорсовентральной и лево-правосторонней) происходит во время гаструляции, морфогенетического процесса, который формирует первичные зародышевые слои (эктодерму, мезодерму и дефинитивную энтодерму). Молекулярному определению left-right (LR) оси предшествует становление явной асимметрии в этом измерении, общее свойство среди билатеральных животных. Несмотря на некоторые видоспецифические отличия, последовательность ключевых событий и участвующих стержневых компонентов в становлении LR асимметрии, по-видимому, законесрвировано среди позвоночных [1],[2].
Инициальные события, нарушающие LR симметрию , происходят в специализированных органах, расположенных на срединной линии эмбриона, это обычно узелок у мышей. Приблизительно на день эмбриогенеза (E) 7.75, эквивалентный стадии early head-fold (EHF), реснички, выступающие из задне-апикальной поверхности клеток узелка, начинаю вращаться, генерируя тем самым направленный ток жидкости внутри микроокружения узелка [3]. Или посредством интерпретации сил механического тока [4],[5] или асимметричного распределения сигналов [3],[6], ток в узелке, как полагают, запускает волну Ca2+ на левой стороне узелка [4], а также преимущественно слева асимметричную perinodal экспрессию Nodal [7]. На ст. E8.5, эквивалентной ст. ~4 сомитов, в результате асимметричного считывания этого события, нарушающего симметрию, происходит активация генетического каскада Nodal/Lefty2/Pitx2 внутри левой lateral plate mesoderm (LPM) [8]. Активация этих факторов необходима для асимметричного органогенеза [8]. Эмбриональная срединная линия, как полагают, действует как "midline barrier", удерживая сигналы, определяющие её соответствующие стороны, как благодаря её морфологической структуре, так и благодаря экспрессии специфических факторов [2].
Нерешенным вопросом в становлении LR асимметрии у эмбрионов мыши является механизм общения между местом срединной линии с нарушением симметрии и тканями латеральной пластинки, инициирующими асимметричных морфогенез. Благодаря своему расположению клетки, которые лежат между узелком и латеральной пластинкой, скорее всего, предоставляют собой среду для трансляции сигналов. Энтодерма кишки и параксиальная мезодрема являются привлекательными тканями кандидатами для обеспечения трансмиссии сигналов, поскольку они расположены пососедству как с узлом, так и латеральной пластинкой мезодермы. Более того, происходящие около узелков асимметричные события, включая высвобождение кальция и экспрессию Nodal, происходят в энтодермальных клетках, выстилающих узелок [4],[7],[9].
Используя изображения вживую и генетическое мечение, мы ранее установили, что энтодерма кишки мышиного эмбриона образуется за счет широко распространенной интеркаляции клеток дефинитивной энтодермы (DE), происходящей из эпибласта, в покрывающий висцеральную энтодерму (VE) эпителий [10]. При гаструляции, DE предшественники интеркалируют в дистально расположенный эмбриональный VE эпителий, также обозначаемый как emVE [11],[12], которая состоит из слоя поверхностных клеток эмбриона. Эта мультифокальная интеркаляция DE клеток ведет к широко распространенной дисперсии и разбавлению emVE клеток [13]. Как результат возникающая энтодермальная ткань кишки представлена клетками из двух разных источников: DE и emVE. Более того, мы отметили, что помимо своего рассеянного распределения внутри энтодермы кишки остаточные emVE клетки обнаруживают вторичное стереотипическое распределение таким образом, что они отсутствуют в, но собираются вокруг, узелка и срединной линии [10],[14],[15]. Даже несмотря на точную клеточную динамику, контролирующее смещение emVE в узле и срединной линии остается неизвестным, эти данные указывают на то, что латеральная дисперсия в будущую энтодерму кишки и смещение срединной линии в будущую хорду могут регулироваться независимо.
Sry-related HMG box транскрипционный фактор Sox17 является ключевым консервативным фактором, участвующим в формировании энтодермы у позвоночных [16]. Мыши, лишенные Sox17 обнаруживают истощение клеток DE, обладают аномальной кишечной трубкой и погибают на ст. приблизительно E10.5 [17]. Интересно, что Sox17 мутантные эмбрионы мыши также обнаруживают крупные морфологические признаки, обычно наблюдаемые у мутантов со становлением LR асимметрии, включая неспособность перехода от лордотической к плодной позиции, открытой стенке тела и кардиальным дефектам [17]-[19]. Мы полагаем, что детальный анализ Sox17 мутантов может предоставить дальнейшую информацию о дефектах энтодермы кишки и связан ли морфогенез энтодермы кишки с формированием LR паттерна.
Одним из способов коммуникаций внутри эпителия это посредством щелевых соединений. Мы идентифицировали Connexin43 (Cx43) в качестве основного составляющего щелевых соединений, экспрессируемого в энтодерме вскоре после широкого распространения emVE и завершения интеркаляции DE клеток, когда скорее всего происходи передача сигналов от узелка к LPM. У мутантов Sox17 мы отметили, что Cx43 отсутствует в энтодерме кишки. Мы продемонстрировали купирование щелевых соединений как на левой, так и на правой сторонах энтодермы кишки у эмбрионов дикого типа, но не Sox17 мутантов. Мы также наблюдали, что щелевые соединения, соединяющиеся в мезодерме, изолированы от энтодермы. Поскольку Cx43 локализуется внутри мезодермы одинаково у дикого типа и мутантных эмбрионов, то мы пришли к выводу, что LR сигналы д. распространяться внутри энтодермального эпителия. Наши исследования также выявили отсутствие купирования щелевых соединений между клетками срединной линии у эмбрионов дикого типа, что является первой функциональной визуализацией барьера средней линии у мышей.
Итак, наши наблюдения идентифицировали энтодерму кишки в качестве ключевой ткани, обеспечивающей коммуникации между узелком и LPM во время становления LR асимметрии у мышей. Мы продемонстрировали, что Cx43-обеспечиваемые щелевые соединения, купируюемые между клетками энтодермы, необходимы для корректного распространения в пространстве и времени сигналов асимметрии от узелка к LPM.

Discussion


Каскад событий устанавливает LR асимметрию у мышей. Центральный нерешенный вопрос в этом процессе это природа перехода между прорывом симметрии в срединной линии и тканями, осуществляющими асимметричный морфогенез в латеральной пластинке. Кстати, мутантные мыши, обладающие дефектами формирования LR паттерна, распадаются на три категории, исходя из их ожидаемого места функционирования гена: узелка, LPM и срединной линии [8]. Не описаны мутанты, затрагивающие LR асимметрию, действующие в энтодерме кишки, ткани , располагающейся между местом прорыва симметрии (узелок) и тканью эффектором асимметричного морфогенеза (латеральной пластинкой). Наше исследование выявило Cx43-обеспечиваемые коммуникации посредством щелевых соединений в эпителии энтодермы кишки в качестве механизма передачи информации между узелком и LPM в становлении LR асимметрии у мышей (for model, see Figure 8).

Figure 8. Working model for role of gut endoderm in LR asymmetry establishment.

Sox17 regulates morphogenesis of the gut endoderm, whose cellular interfaces contain Cx43-comprised gap junctions. After LR symmetry is broken in the node by rotating cilia, the resulting nodal flow induces left-biased asymmetries around the node. These asymmetries are transmitted via gap junction communication within the gut endoderm to the target tissue, the left LPM, where the Nodal/Lefty2/Pitx2 asymmetry cascade is activated.

Анализ каскада Nodal/Lefty/Pitx2 асимметрично экспрессируемых генов показал, что LR асимметрия устанавливается неправильно у Sox17 мутантов. Pitx2, ген, стоящий ниже в этом пути, никогда не обнаруживается в левой LPM мутантов Sox17. Интересно, что наши данные выявляют некоторую изменчивость в экспрессии генов асимметрии наивысшую в каскаде у эмбрионов, лишенных Sox17. Поскольку многие Sox17 мутанты не обнаруживают экспрессии Nodal и Lefty1/2 в LPM, др. обнаруживают пониженную и регионально ограниченную экспрессию этих генов в левой LPM. У эмбрионов дикого типа экспрессия Nodal в LPM стартует в небольшой области на уровне узелка и впоследствии распространяется кпереди и кзади внутри LPM [7]. Наблюдение пониженной экспрессии Nodal и Lefty1/2 в LPM некоторых Sox17 мутантных эмбрионов показывает, что находится активированным, подтверждая, что некоторые сигналы передаются от узелка к LPM.
Это открывает возможность, что минимальная дисперсия emVE клеток, наблюдаемая у некоторых мутантов, может оказаться достаточной для коммуникаций с помощью щелевых соединений. Эксперименты по отслеживанию связанной окраски свидетельствуют против возможности сцепления щелевых соединений у мутантов Sox17, поскольку Neurobiotin никогда не обнаруживался распространяющимся между клетками внутри энтодермы кишки мутантов Sox17. Тем не менее, поскольку это технически невыполнимо инъецировать каждую клетку в эпителии энтодермы кишки одного эмбриона, мы не можем исключить, что случайное сцепление щелевых соединений может происходить в минорной популяции энтодермальных клеток у некоторых Sox17 мутантов. Кроме того, др. коннексины могут частично компенсировать отсутствие Cx43 у Sox17 мутантов. Наше исследование профиля экспрессии идентифицировало Cx31, др. ген коннексина, экспрессирующийся на стадии EHF, хотя и на низких уровнях (Figure S3). Усиление активности компенсаторных коннексинов в энтодерме кишки Sox17 мутантов может обеспечить некоторые коммуникации между узелком и LPM, делая возможным передачу сигналов, достаточную для минимальной активации пути в левой LPM. Уровни сигнала могут быть недостаточно мощными, чтобы полностью активировать каскад и предупредить его от распространения внутри LPM. В самом деле, когда эмбрионы дикого типа культивировали в присутствии ингибиторов всех коннексинов, то мы наблюдали полную неспособность активировать экспрессию генов в LPM.
Наш анализ маркеров LR асимметрии также выявил присутствие эктопических участков экспрессии на обеих сторонах от срединной линии у Sox17 мутантов, с эктопически экспрессируемыми клетками, расположенными на поверхности эмбриона. Безусловно, мы никогда не наблюдали такой эктопической экспрессии у эмбрионов дикого типа, которых культивировали в присутствии ингибиторов щелевых соединений, которые мы добавляли на стадии HF, это указывает на то, что они возникают из дефекта, предшествующего появлению узелка и последующих событий становления LR асимметрии. В подтверждение этого анализ экспрессии на ст. EHF мутантов Sox17 уже выявил эктопическую экспрессию Nodal в энтодерме. На ст. PS эмбрионов дикого типа, Nodal экспрессируется во всей emVE и затем подавляется [11]. Это подавление может происходить некорректно у мутантов Sox17 возможно из-за того, что emVE не диспергированы. Эктопические участки Nodal впоследствии, скорее всего, индуцируют Lefty2 и Pitx2.

Aberrant Distribution of emVE in Sox17 Mutants During Gut Endoderm Morphogenesis


Даже если некоторые свойства были задокументированы [31], точное поведение клеток, которое управляет морфогенезом узелка и срединной линии, и в частности появлением клеток на поверхности эмбриона, еще предстоит выяснить. Было предположено, что группы клеток предшественников узелка возникают из APS и проникают в emVE эпителий на дистальном кончике оплодотворенного яйца [31]. Оказавшись на поверхности эмбриона когорта клеток узелка постепенно соединяется, чтобы сформировать одиночную ямку узелка [2], тем самым создается механизм для коллективного смещения клеток emVE со срединной линии.
Отсутствие Sox17 в узелке и срединной линии подтверждает, что этот транскрипционный фактор участвует косвенно в формировании узелка и срединной линии. Соотв., структуры узелка и срединной линии появляются на поверхности эмбриона у мутантов Sox17. Это подтверждает, что морфогенез энтодермы кишки и узелка/срединной линии являются разными процессами и что они оказываются не связанными в отсутствие Sox17.
Поэтому мы интерпретировали, что неспособность очистить все emVE клетки из области узелка у ряда мутантных эмбрионов в качестве вторичного дефекта, возникающего в результате неспособности к дисперсии emVE. Полностью происходящая из emVE энтодерма кишки может ограничивать клетки emVE срединной линией, тем самым мешать появлению предшественников узелка на поверхности эмбриона. Очевидно, что присутствие остаточных emVE клеток внутри узелка у мутантов не нарушает левостороннего nodal тока и последующую индукцию асимметричной экспрессии perinodal генов.

Linking the Gut Endoderm to LR Patterning


Наблюдение, что энтодерма кишки Sox17 мутантов лишена Cx43 puncta, привлекло наше внимание к щелевым соединениям в качестве потенциальной причины неспособности становления LR асимметрии. Ранее мы продемонстрировали, что динамика и широко распространенные перестройки межклеточных соединений происходят во время интеркаляции DE клеток в лежащий поверх слой emVE во время морфогенеза энтодермы кишки [10]. Перед началом гаструляции, Cx43 puncta были обнаружены на межклеточных интерфейсах в emVE у мутантов Sox17. Поскольку у мутантов Sox17 emVE не становится дисперсной и не нуждается в перестройке, чтобы приспособиться к интеркаляции DE клеток, поэтому мы ожидали, что Cx43 puncta будут сохраняться в мутантной энтодерме. Однако, Sox17 мутанты не обнаруживают Cx43 пор внутри энтодермы между стадиями no bud (OB) и EHF.
LR дефекты не были описаны у мутантов, лишенных Cx43. Исходное исследование охарактеризовало Cx43 нокаутную линию мышей, сообщив, что мутанты доживают доя рождения, помирая при рождении от дефектов сердца [32]. Более того, последующая работа выявила генетические, связанные в генетическим фоном, фенотипические различия, возникающие в результате условного (conditional) устранения Cx43 [33]. остается определить, обладают ли мутантные Cx43 животные свойствами, демонстрирующими неспособность к формированию LR паттерна, включая situs inversus или heterotaxia.
Даже если клетки, представляющие энтодерму кишки мутантов Sox17 имели почти исключительно emVE происхождение, то наши находки свидетельствуют, что они заканчивают инициальную ступень морфогенеза энтодермы кишки, путем подавления маркеров качественной особенности VE, как это делают emVE клетки у эмбрионов дикого типа перед их дисперсией [10]. Т.о., в отсутствии DE клеток внутри эпителия энтодермы кишки у мутантов Sox17, новая волна формирования щелевых соединений может не появиться. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, являются ли гены, кодирующие компоненты щелевых соединений непосредственными мишенями Sox17 или существующая неспособность ремоделирования эпителия, затрагивает локализацию Cx43. Во всяком случае, мы полагаем, что отсутствие Cx43 пор в энтодерме кишки вызывает неспособность к купированию щелевых соединения в тканях мутантов Sox17.

Gap Junction Coupling Across the Gut Endoderm


Наши находки показывают, что купирование щелевых соединений происходит между клетками энтодермы кишки и что этим способом распространяются коммуникационные сигналы на левой и правой сторонах эмбриона. Купирование щелевых соединений происходит через несколько клеточных диаметров, распространяясь от perinodal расположения к латеральной пластинке. Поскольку купирование происходит между клетками DE и emVE, то клетки из двух самостоятельных источников интеркалируют. чтобы сформировать гармонирующий эпителий, представляющий энтодерму кишки. Коммуникации посредством щелевых соединений в энтодерме кишки планарные и изолированные от окружающих тканей. Наблюдение, что энтодерма кишки способна к коммуникациям посредством щелевых соединений как на левой, так и на правой сторонах, подтверждает, что она действует как пассивная среда для передачи асимметричной LR информации. Это согласуется с тем фактом, что определенные мутанты, имеющие дефекты в LR асимметрии, по экспрессии генов в LPM могут быть правосторонними или билатеральными [8]. Если область узелка, как результат нарушенного нодального тока, диктует посылку сигналов асимметрии направо или в обоих направлениях, то беспристрастная энтодерма кишки покорно распространяет сигнал направо или в обе стороны. Более того, открытие отсутствия купирования щелевых соединений поперек срединной линии, также впервые предоставляет функциональную визуализацию барьера срединной лини у мышей. Важен тот факт, что некоторые Sox17 мутанты обнаруживают ограниченную экспрессию Nodal и Lefty1/2 в левой LPM, показывая, что LPM чувствительна к LR паттерн формирующими сигналам. Поэтому мы пришли к заключению, что дефекты LR асимметрии у Sox17 мутантов заключаются в нарушении распространения LR сигналов, в др. работе было продемонстрировано, что левая LPM мутантов Sox17 чувствительна к LR паттерн формирующим сигналам от клеток, источников Nodal (Y. Saijoh et al., unpublished work, personal communication).
Качественные особенности передаваемых сигналов неизвестны: сигнал, передающий информацию, д. продуцироваться вблизи узелка, передаваться через энтодерму кишки, который затем достигает интерфейса с LPM и д. запускать каскад Nodal/Lefty/Pitx2 . Одной из молекул, путешествующей через щелевые соединения, является кальций [34]-[36]. LR асимметричная локализация кальция описана у рыб [37], кур [38] и мышей [4],[39]. Модель двух ресничек становления лево-правосторонней асимметрии у мышей предполагает, что неподвижные механо-сенсорные perinodal реснички определяют ток и выявляют асимметричный приток ионов Ca2+ благодаря активности PKD, проницаемого для ионов кальция канала [4],[5],[40]. Интересно, что мутанты,неспособные индуцировать асимметричные уровни кальция, не экспрессируют генов LR асимметрии в LPM [4],[40]. Др. кандидатом является serotonin [41]. Serotonin, как было установлено, проходит через щелевые соединения [42], а нарушение передачи serotonergic сигналов ведет к аберрантному формированию LR паттерна у лягушек и кур [43],[44]. Скорее всего существуют и др. кандидаты и необходимы дальнейшие исследования для идентификации факторов, которые проходят через щелевые соединения энтодермы кишки, чтобы обеспечить становление LR асимметрии у мышей.