Дорсальная часть нервной трубки (NT), которая генерирует клетки нервного гребня (NC) и сомиты, происходящие из параксиальной мезодермы, это псевдостратифицированный эпителий, в котором клетки предшественники подвергаются interkinetic миграции ядер и возникают типичные паттерны клеточной пролиферации (Burstyn-Cohen & Kalcheim 2002; Ben-Yair et al. 2003; Spear & Erickson 2012). Эти эпителии являются временными, поскольку клетки предшественники прогрессивно отщепляются или полностью диссоциируют, чтобы превратиться в мезенхимные клетки. В дорсальной части NT на уровне туловища у птиц эти epithelial-to-mesenchymal transitions (EMT) и отслоения клеток являются прогрессирующими событиями, продолжающимися почти два последующих дня, в течение которых дорсальная часть NT сохраняет свою эпителиальную структуру (Krispin et al. 2010b). Напротив клетки краниальной части NC отслаиваются все вместе и регуляторные сети, контролирующие EMT на каждом уровне, чётко отличаются (rev. [Strobl-Mazzulla & Bronner 2012]). Сходные процессы происходят в дермомиотоме (DM), дорсальном остатке эпителиального сомита, который состоит из 4-х соприкасающихся губ и центральной пластинки. В то время как губы продуцируют миоциты в течение нескольких дней, оставшийся эпителий, центральная пластинка, полностью диссоциирует, чтобы дать начало дермису и митотическим предшественникам (Cinnamon et al. 2001; Ordahl et al. 2001; Ben-Yair & Kalcheim 2005; Delfini et al. 2009).

Дополнительным признаком,общим обеим системам, является существование миграции на длинные и короткие расстояния, которые сопровождают инициальный EMT. Напр., исследования, проведенные на эмбрионах птиц показали, что предшественники NC, которые формируют симпатические ганглии, мигрируют на дальние расстояния от дорсальной части NT в направлении дорсальной аорты и затем вдоль аорты на длину трех соседствующих сомитов рострально и каудально от их места выхода из NT (Fig. 1) (Yip 1986). Напротив, сенсорные предшественники dorsal root ganglia (DRG) мигрируют дорсовентрально на короткие расстояния, пока не достигнут зачатков DRG и также движутся продольно на длину примерно одного или половинки сомита, чтобы заполнить два соседних DRG в виде стереотипического паттерна (Fig. 1B) (Teillet et al. 1987). Сходным образом, вентролатеральная губа DM на плечевом и пояснично-кресцовом уровнях у разных видов подвергается диссоциации и Pax3/7-позитивные предшественники мигрируют далеко прочь в зачаток конечности, чтобы дать начало аппендикулярным мышцам (Buckingham et al. 2003). Кроме того, эндотелиальные клетки, происходящие из латеральной части DM из данного сомита колонизируют кровеносные сосуды вдоль, по крайней мере, двух сегментов (Ben-Yair & Kalcheim 2008). В отличие от рассмотренных случаев предшественники миотомных мышц или транслоцируются непосредственно из DM в соседний миотом и затем дифференцируются в одноядерные, мышечные волокна длиной в зачаток (Fig. 1B) (Kalcheim et al. 1999; Gros et al. 2004; Kalcheim & Ben-Yair 2005; Ben-Yair et al. 2011) или, как в случае пионерских миобластов у птиц, подвергаются Slit1/Robo2-зависимой каудально->ростральной миграции внутри одиночного сегмента, что сопровождается дифференцировкой в противоположном направлении (Halperin-Barlev & Kalcheim 2011). Сходным образом, у рыбок данио, происходит медленное перетаскивание мышечных клеток, происходящих их adaxial предшественников, которые, как было установлено, подвергаются N- и M-cadherin-зависимой миграции от медиальной части хорды в латеральный аспект миотома внутри того же самого сегмента (Cortes et al. 2003).

Figure 1. Development of neural crest (NC) and somite derivatives. (A) At embryonic day 2 (E2) in the trunk avian embryos, most NC progenitors still reside within the dorsal neurepithelium and the earliest progenitors (red) begin delaminating opposite epithelial somites. At this stage, the medial part of the epithelial somite contains pioneer myoblasts (green) about to delaminate (green arrow) when the somite dissociates. (B) At E2.5, upon somite dissociation and sclerotome (S) formation, NC cells migrate along various ventral pathways (red arrows). Some progenitors migrate adjacent to the neural tube (NT) to join outgrowing nerves where they will differentiate as Schwann cells. Others move toward the dorsal aorta (DA) either through the sclerotome or intersomitic clefts and once they reach this blood vessel they further migrate longitudinally along three consecutive segments in both rostral and caudal directions to generate sympathoadrenal (SA) derivatives. In addition, a short-range ventral migration from a length of tube equivalent to 1.5 somites produces the dorsal root ganglia (DRG). Note the preferential migration within the rostral (R) sclerotomal portion of each segment medial to the dermomyotome (DM), whereas the caudal (C) domain remains NC-free. In the DM, after sclerotome dissociation and formation of the primary myotome from pioneer myoblasts, cells translocate from all four lips and from the central sheet into the myotome to form the second wave of differentiated striated myocytes (green arrows). Note as well the delamination and migration of progenitors from the ventrolateral lip (VLL) to the cardinal vein (CV) where they will develop into endothelium and smooth muscle (red arrow in right panel). (C) At E3, ventral migration is completed and DRG, primary sympathetic ganglia and Schwann cell precursors reached their homing sites. At this stage, late emigrating NC cells migrate dorsolaterally, between ectoderm and dissociating DM both opposite rostral as well as caudal somite domains; in addition, they move in both rostral and caudal directions (green arrows). This late migratory wave generates exclusively melanocytes (M) of the skin. Note a second population of melanocyte progenitors, which, starting at E5, will derive from Schwann cell progenitors lining the spinal nerves (dashed green arrow). In the somite, the central DM sheet dissociates and cells either translocate to the myotome (Myo) to form the third wave of mitotic muscle progenitors or toward the ectoderm to form the epaxial dermis (D) (green and blue arrows, respectively). N, notochord.

Итак, NC и предшественники в дорсальной части сомита обладают многими общими признаками как в эпителиальном, так и мезенхимном состоянии. Несмотря на это, наблюдаются разнородности паттернов EMT и миграторного поведения внутри каждой из систем вдоль оси и на разных стадиях. Наиболее важной общей характеристикой вышеупомянутых эктодермальных и мезодермальных предшественников, соотв., является разнообразие производных в каждой системе. NC является источником нейронов, глии и Шванновских клеток периферической нервной системы (PNS) (сенсорной, симпатической, парасимпатической и энтерических ганглиев). Он также генерирует пигментные клетки кожи, хромаффинные клетки в надпочечнике, эктомезенхиму в голове и кардиальный тракт оттока (Bronner-Fraser 1993; Le Douarin & Kalcheim 1999). Дорсальная часть сомита является источником эпителия DM, который, в свою очередь, продуцирует epaxial и hypaxial мышцы тела, аппендикулярную мускулатуру, epaxial dermis, гладкие мышцы и эндотелий, выстилающий кровеносные сосуды (Christ & Scaal 2008) (Fig. 1). Эти множественные судьбы ставят само разумеющийся вопрос, состоит ли эпителий из нативных и гомогенных предшественников или, напротив, из уже клеток с ограниченными судьбами. В первом случае можно предположить, что решения о клеточных судьбах происходят во время миграции или на местах предназначения, в этом случае необходимы исследования, ответственных механизмов, оперирующих после EMT. В последнем случае исследования д. сконцентрироваться на механизмах, оперирующих с самим эпителием, который д. быть ответственен за возникновение ранней разнородности.

Lineage analysis of NC progenitors

Долгое время считалось, что на разных осевых уровнях клетки NC воспринимают разные судьбы и мигрируют по соотв. уникальным путям (Le Douarin & Kalcheim 1999). Напр., на уровнях ромбэнцефалона клетки NC преимущественно мигрируют вдоль дискретных дорсо-латеральных путей вентрально в эктодерму. Эти предшественники генерируют специфические сенсорные ганглии и пигмент, а также колонизируют фарингеальные дуги, чтобы дать косточки и хрящи (Kulesa & Gammill 2010; Minoux & Rijli 2010). Напротив, на уровнях туловища клетки NC сначала мигрируют вентрально, давая хромаффиные клетки, нейроны и глию ПНС, а позднее мигрируют дорсо-латерально, чтобы дать исключительно меланоциты.

Так, на уровнях вагуса (уровни сомитов 1-7) различия были выявлены в миграторных путях между ростральным регионом нерва вагуса (сомитные уровни 1-4) и каудальным вагусным доменом у птиц (сомитные уровни 5-7). В первом случае описаны, три последовательные волны клеточной миграции: инициальная волна была субэктодермальной, напоминающей поведение краниальной части NC. Предшественники перемещаются вдоль этого маршрута, в основном колонизируя фарингеальные дуги и сердце. Более поздний поток происходит дорсо-вентрально и, скорее всего, вносит вклад в нейральные производные, включая энтерическую иннервацию. Финальная волна является самостоятельным субэктодермальным потоком, который генерирует меланоциты. Однако на уровнях сомитов 5-7 временное разделение миграторных путей напоминает таковое в туловище, при этом первый генеральный путь в дорсовентральном направлении дает нервные производные, а более поздний дорсолатеральный путь продуцирует меланоциты. Следовательно, осевой уровень вагуса, как полагают, ведет себя как переходная зона между NC головы и тела (Kuo & Erickson 2010, 2011), феномен, имеющий важное эволюционное значение.

Более уточненная карта связи путей миграции NC с приобретенными финальными судьбами описана в туловище эмбрионов птиц и мышей (Serbedzija et al. 1989, 1990; Krispin et al. 2010b). У эмбрионов кур было установлено, что клетки NC колонизируют свои предопределенные домены стереотипическим вентрально-дорсальным порядком. Первые клетки, чтобы отслоиться мигрируют дальше всего, чтобы колонизировать симпатические зачатки, затем следуют Шванновские клетки, которые выстраиваются вдоль спинальных нервов. Позднее заселяется DRG домен, и, наконец, предшественники меланоцитов заселяют кожу (Serbedzija et al. 1989; Krispin et al. 2010b). Т.о., время миграции NC связано с продукцией специфических производных.

Возникает вопрос, может ли судьба клеток NC быть предсказана ранее миграторной стадии, т.е. ещё в предмиграторном домене дорсальной части NT. Чтобы выяснить этот вопрос, Krispin et al. (2010b) метили дорсальную срединную линию NT в последовательные промежутки времени. Дискретные субнаборы клеток были помечены с помощью фокальной электропортации GFP-DNA и с помощью непосредственных инъекций в одиночные клетки плазмид (Ben-Yair & Kalcheim 2010) (Fig. 2A). Согласно этим результатам с более массивным мечением клеток, самые ранние отслаивающиеся клетки генерируют SG , а более поздние дают меланоциты, в соответствии с ранее установленной последовательностью. Чтобы расширить этот подход авт. дискретно метили эпителиальные предшественники на разных дорсо-вентральных местах внутри дорсальной части NT на данной стадии. В этом примере дорсальные предшественники NT формировали вентральные производные и напротив вентральные эпителиальные предшественники генерировали меланоциты. Следовательно, дорсо-вентральное расположение клеток NC перед миграцией и их финальное расположение после достижения места предназначения связаны обратным образом. Более того, используя замедленную съемку, было показано, что одновременно с последовательной эмиграцией презумптивные клетки NC подвергаются вентрально-дорсальному перемещению, это указывает на то, что регион срединной линии NT действует как слив (sink) для упорядоченной ингрессии и выхода предшественников. Хотя оба подхода показали, что финальная локализация клеток, происходящих из NC, а, следовательно, и их судьбы могут быть предсказаны их относительным расположением внутри премиграторного домена и/или временем отсоединения и что оба эти параметра полностью эквивалентны. Следовательно, динамика пространственно-временного картирования производных NC туловища уже очевидна в дорсальной части NT (Krispin et al. 2010b). Более того, домен экспрессии маркеров премиграторного NC Snail2, Sox9 и Foxd3, как было установлено, первоначально широкий в дорсальной части нервной трубки и прогрессивно ограничивается дорсальной срединной линией (Krispin et al. 2010b). Параллельное исследование, в котором поведение NC отслеживалось с помощью time-lapse изображений на срезах культур, не полностью подтверждает этот феномен и вместо этого заявляет, что клетки NC туловища эмигрируют из любого региона дорсальной части нервной трубки, а не исключительно из дискретного дорсального региона, которые д. соответствовать Foxd3+ домену в относительно более позднее время, во время которого они осуществляли свои эксперименты (Ahlstrom & Erickson 2009). В этом исследовании культуры срезов могли потерять нормальное напряжение, присутствующее у эмбрионов, которое, по-видимому, необходимо для аккуратного отслеживания таких морфологических событий. Кроме того, относительно короткая продолжительность сессий получения изображений может оказаться недостаточно продолжительной, чтобы отследить динамические изменения в паттерне клеточной эмиграции всего потомства.

Figure 2. Tracing the lineage of single progenitors in dorsal neural tube or somites. Individual epithelial cells either in dorsal neural tube (NT)or somite subdomains were transfected with a green fluorescent protein (GFP)-encoding plasmid using fine tip micropipettes with an outer diameter of 1.0 mm and inner diameter of 0.75-0.78 mm. The concentration of plasmid was adjusted to generate single transfected cells. For pCAGG-GFP, the optimal concentration was found to be about 0.05-0.1.0 µg/µL. A few hours following the injections, embryos were observed under a fluorescent binocular to confirm labeling of single cells. Two days later, the location and composition of resulting labeled clones were inspected. (A) Labeling of individual dorsal NT cells at progressive stages prior to and during the emigration of neural crest (NC) progenitors. When labeled early, at the 22 somite-stage (ss), NC produced progeny in the sympatho-adrenal anlagen only. When labeled at 27ss, labeled clones populated the spinal nerves and differentiated as Schwann cells. Labeling at 32ss yielded clones in the dorsal root ganglia (DRG), while late-stage labeling, performed at 37ss and 44ss, produced clones composed of melanocytes and roof plate cells, respectively. Notably, in more than 90% of the cases, progenitors labeled prior to delamination from the neurepithelium yielded clones in distinct primordia, implying that NC cells are fate restricted prior to emigration. (B) Labeling of individual progenitors in the epithelial somite and dermomyotome (DM). When labeled at E2, central progenitors within the dorsal somite gave rise to differentiated striated muscle cells in the myotome, while late labeling in the central sheet of the DM, performed at E3, yielded clones composed of both dermal and muscle progenitor cells. As a comparison, labeling of the lateral aspect of the somite at E2 generated both striated muscle in the myotome and vascular cells in the adjacent cardinal vein (CV). However, labeling of the ventrolateral lip of the DM at E3 mainly yielded fate-restricted clones containing striated muscle. DA, dorsal aorta; N, notochord; NT, neural tube.

Поскольку описанное выше картирование судеб имело отношение к фланговым уровня нейрально оси, то понадобились дополнительные исследования для выяснения существуют ли аналогичные премиграторные карты NC дополнительно к осевым уровням и когда во время онтогенеза NC могут быть впервые выявлены такие карты судеб. Поскольку в отличие от предшественников NC туловища клетки цефалической части NC отсоединяются все вместе во время короткого периода скорее, чем индивидуальные клетки в течение более продолжительного времени, то получение таких карт судеб очень трудная цель. Несмотря на эти отличия, было установлено, что в цефалических регионах у эмбрионов рыбок данио премиграторные латеральные предшественники эмигрируют первыми и генерируют нейроны, более медиальные клетки мигрируют позднее и генерируют Шванновские и пигментные клетки, тогда как наиболее медиальные предшественники формируют эктомезенхиму (Schilling & Kimmel 1994).

Результаты, описанные выше, открывают беспрецедентный порядок связи локализации предшественников из NC в дорсальной части NT и времени отслоения и миграции с судьбами. Кроме того, было установлено, что, по крайней мере, 80% и 90% случаев потомства презумптивных клеток NC туловища, чеченных соотв. до миграции, было ограничено единственным производным как у рыбок данио (Raible & Eisen 1994), так и кур (Krispin et al. 2010b) (Fig. 2A), соотв. Это указывает на то, что большинство премиграторных клеток NC клонально ограничено. Это не обязательно отражает полную детерминацию, поскольку, прибыв в зачаток ганглия, NC предшественники всё ещё могут выбирать между судьбой нейрональных или сателлитных клеток (Wakamatsu et al. 2000). В очевидном контрасте, когда lysinated rhodamine dextran (LRD) инъецировали в одиночных предшественников дорсальной части NT, то большинство клонов содержало меченных потомков во многих местах NC, не всегда соответствующих последовательному порядку колонизации, описанному выше. Др. клоны состояли как из NT, так и NC или только из NT клеток (Bronner-Fraser & Fraser 1988, 1989), что согласуется с мнением, что премиграторные NC клетки мультипотентны. Возможные различия между этими исследованиями могут заключаться в аккуратности анализируемых стадий и аксиальных уровней. В анализе Bronner-Fraser и Fraser, эмбрионы были хорошо ранжированы по стадиям и сомитным уровням, это делает возможным, что большинство инъекций метило примитивные нейроэктодермальные предшественники, в которых расхождение судеб между NC и NT или между разными NC судьбами ещё не произошло. Чтобы решить это очевидное расхождение и аккуратно определить начало ограничения NC в туловище. Был осуществлен системный клональный анализ, начиная со стадии нервной пластинки и вплоть до начала NC EMT. Базируясь на недавних доказательствах, такие исследования д. обязательно учитывать точные осевые уровни, а также дорсовентральное расположение презумптивных NC предшественников в NT (или эквивалентное медио-латеральное положение в нервной пластинке).

Отслеживание in vivo клеточных клонов, описанное выше, отражает состояние детерминации предшественников в данном месте и в данное время развития в нормальном эмбриональном контексте. Считается, что состояние спецификации клеток предшественников уже, чем потенциальные судьбы, которые могут быть сгенерированы в ответ на воздействие внешних или внутренних условий, иных, чем те, что предлагаются эмбриональными условиями. Клональный анализ in vitro NC клеток, осуществленный некоторыми авт., адекватно подтверждает эту концепцию (see section on Challenging the state of commitment of NC progenitors). Пример промежуточной ситуации представлен анализом расхождения клеточных клонов внутри когорты NC клеток, эмигрировавших из эксплантированных нейральных примордиев (Henion & Weston 1997). В этом исследовании, LRD инъецировали единичным NC предшественникам птиц вскоре после того, как они отслаивались в планарный субстрат, в котором общий порядок эмиграции клеток (сначала нейральных предшественников, а затем меланоцитов) также как и межклеточные взаимодействия сохранялись (Reedy et al. 1998). Они установили, что почти половина популяции NC, меченная 1-6 ч после инициальной эмиграции клеток из NT, уже представлена предшественниками с ограниченной судьбой, которые давали один тип клеток; или нейроны, глию или меланоциты. Эта пропорция возрастала до почти 90%, если анализировали судьбы позже эмигрировавших предшественников, меченных 30-36 ч после начала эмиграции NC. Был сделан вывод, что NC предшественники сегрегируют рано за счет асинхронного ограничения определенных клеточных судеб.

Итак, растут доказательства, подтверждающие, что премиграторный пул NC предшественников не гомогенен, как это первоначально предполагалось. Вместо этого, поскольку не аннулировано существование мультипотентных клеток даже на более поздних стадиях, то становится ясно, что предшественники с органиченными судьбами уже присутствуют в дорсальной части NT. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять точное время приобретения клетками судьбы в дорсальном нейроэпителии и лежащие в основе клеточные и молекулярные механизма (Krispin et al. 2010a).

Challenging the state of commitment of NC progenitors

Исследования по отслеживанию клонов подтвердили существование раннего ограничения судеб NC клеток. Это мнение в дальнейшем было подтверждено экспериментами in vivo и in vitro, в которых миграторное окружение было изменено, тем самым был затруднен потенциал приобретения новых качественных особенностей.

окончательный тест по проверке потенциала NC предшественников заключался в изоляции одиночных клеток на стадиях отслаивания или миграции, происходящих из разных осевых уровней и культивирования их в присутствии определенных ростовых и способствующих выживанию факторов и/или в клеточных субстратах, таких как фибробласты 3T3 с арестованным ростом (see below). Этот подход показал, что ранние NC являются гетерогенной популяцией, где обнаруживаются как мультипотентные, промежуточные, так и предшественники с ограниченными судьбами. Интересно, что цефалические перепелиные NC клоны содержат, с одной стороны, плюрипотентные NC-подобные стволовые клетки с частотой 1/305 клонов, тогда как, с др. стороны, 20% клонов содержат потомков, несущих уникальный фенотип (или нейроны, хрящи или Шванновские клетки) даже в условиях, которые пригодны для пролиферации и дифференцировки множественных клонов (Baroffio et al. 1990, 1991; Le Douarin & Dupin 2003; Trentin et al. 2004; Le Douarin 2008). Сходным образом, было установлено, что в то время как некоторые NC клетки плюрипотентны (Sieber-Blum & Cohen 1980), , по крайней мере, три клона детерминированы до миграции - сенсорные нейроны (Sieber-Blum 1989), большинство пигментных клеток туловища (Sieber-Blum & Cohen 1980) и гладкомышечные клетки на краниальном уровне оси (Sieber-Blum & Zhang 1997).

Чтобы выявить потенциал NC клеток in vivo были осуществлены гетеротопические и гетерохронические трансплантации. У птиц эта техника впервые предложена Le Douarin с коллегами с использованием химер перепел-курица, которые продемонстрировали, что на популяционном уровне потенциал большинства, но не всех NC предшественников занчительно больше, чем продуцируемые ими клоны (rev. [Le Douarin 1982]). Т.к. трансплантации были осуществлены на ранних стадиях (E2) и эмбрионы были проанализированы после полной дифференцировки (E7 или позже), то возможность селективных механизмов, оперирующих в химерах, такие как гибель "несоответствующих" клеток, включая те, что являются детерминированными предшественниками, которые были неспособны развиваться в эктопических местах, нельзя исключить. Фактически существование такого механизма уже было описано (Wakamatsu et al. 1998). В приведенном выше исследовании нейрогенные предшественники нервного гребня были трансплантированы между эктодермой и дорсальными частями сомитов, то наблюдалась волна гибели трансплантированных клеток после краткого периода экспрессии свойств нейронов в этом пути.

У рыбок данио, когда ранние нейрональные клетки трансплантировали в позднюю миграторную среду, то клетки сохраняли свою нейральную судьбу и давали производные в DRG. Соответственно, когда поздно эмигрирующие пигментные клетки вносили в условия раннего миграторного пути, они были неспособны продуцировать нейральные судьбы (Raible & Eisen 1994, 1996). Эксперименты на эмбрионах птиц, позволяющие получать в короткое время по сравнению с классикой химеры перепел-курица, давали сходные результаты. Нейральные предшественники вносили в среду для меланоцитов с помощью неправильной экспрессии рецептора наведения Ednrb2 (Harris et al. 2008), путем гетерохронных трансплантаций или комбинацией обоих методов. Отклоненные нейрональные клетки не меняли своей судьбы, чтобы приспособиться к новым условиям. Вместо этого они сохраняли свои собственные качественные особенности путем активации ряда нейрональных маркеров в эктопическое время и эктопическом месте. Как и ожидалось эти нейроны не выживали в эктопических местах после нескольких дней (Krispin et al. 2010b). Более того, временное ингибирование миграции NC на 24 ч, обусловленное трансфекцией tetracycline-зависимой доминантно негативной формы Rac1. После снятия ингибирования более поздняя стадия теперь соответствовала началу латеральной миграции, несмотря на это предшественники NC мигрировали дорсовентрально в направлении DRG, где они генерировали нейроны и глию несмотря на то, что подверглись действию условий, характерных для меланоцитов (Shoval & Kalcheim 2012). Сходным образом, эктопическая миграция ранних NC предшественников наблюдалась у мышей, лишенных активности гена neuropilin-1. Эти эктопически мигрирующие клетки, однако, сохраняли симпатические и сенсорные судьбы, это опять же подтверждает ранние ограничения нейральных предшественников из NC (Schwarz et al. 2009). Для подтверждения этого мнения было предложено несколько маркеров, дифференциально экспрессирующихся в субнаборах нервного гребня и в специфических клонах, происходящих из нервного гребня. Напр., продукт гена Seraf , секретируемый белок с EGF-подобными повторами, который, как было установлено, экспрессируется, начиная с ранних стадий, в субнаборе вентрально мигрирующих клеток нервного гребня, что сопровождается экспрессией в клоне Шванновских клеток, начиная с P0 (Wakamatsu et al. 2004).

Mechanisms underlying early fate specification of NC progenitors

Растет количество экспериментальных доказательств относительно механизмов сегрегации предшественников NC в его различные субклоны (см. [Harris & Erickson 2007; Lallemend & Ernfors 2012; Pavan & Raible 2012]). Здесь мы сфокусируемся на некоторых молекулярных механизмах, скорее всего, оперирующих или в дорсальной части NT или в ранних мигрирующих клетках. Существование премиграторного картирования судеб производных NC в туловище птиц вместе с демонстрацией раннего ограничения судеб клеток в NC у разных видов и аксиальных уровнях (see above) показывают, что некоторые выборы судеб происходят уже на премиграторной стадии. С этим согласуется то, что эпителиальные предшественники NC могут быть подвергнуты градированными эффективными концентрациям дорсального NT сигнала до и/или во время периода отслоения NC. Такой градиент д. оперировать вдоль дорсо-вентрального расширения премиграторного пула в данное время. Поскольку предшественники премиграторного эпителия прогрессивно перемещаются в дорсальном направлении до образования трубки (Krispin et al. 2010b), то можно предположить, что презумптивные меланобласты, экспозируемые в течение более продолжительного времени таким фактором, т.к. переходят с низких к высоким концентрациям фактора. Напротив, предполагаемые предшественники sympathoblast, расположенные ближе к срединной линии, будут экспозироваться высокими концентрациями в течение более короткого времени, т.к. они мигрируют первыми (Krispin et al. 2010a).

BMP4 соответствует потребностям такого фактора, т.к. он экспрессируется в дорсальной части NT рано во время онтогенеза NC и позднее, когда устанавливается окончательно верхняя (roof) пластинка. Следовательно, премиграторный пул NC клеток д. реагировать на BMP4 регулируемым пространственно-временным способом. Фактически, BMP4 продуцируется самими клетками NC, который в свою очередь отвечает на него, скорее всего, с помощью паракринного механизма, т.к. они экспрессируют BMP Receptor type 1A (но не типа 1B) во время своего пребывания в дорсальном нейральном примордии и прогрессивно подавляют транскрипты рецепторов после эмиграции (Sela-Donenfeld & Kalcheim 2002). Локальная передача сигналов BMP, как было установлено, в дорсальной части NT необходима, чтобы стимулировать продукцию Wnt1 (Sela-Donenfeld & Kalcheim 1999, 2002; Burstyn-Cohen et al. 2004; Chesnutt et al. 2004), индуцируя тем самым EMT клеток NC (Burstyn-Cohen et al. 2004). Кроме того, и BMP и Wnt сигнальные системы были ассоциированы с дифференциальным приобретением судеб предшественниками NC (see below), поскольку вовлекаются BMP/Wnt как факторы с двойной активностью на генерацию клеточных движений, а также дифференциальную спецификацию судеб. BMP и Wnt также играют роль во время вторичной нейруляции в наиболее каудальной части нервной трубки. В этом регионе продуцируются только меланоциты и глия с помощью NC практически при отсутствии нейронов. Этот дефект, как было установлено, является результатом персистенции BMP ингибитора noggin, который также замедляет транскрипцию Wnt1. Неправильная экспрессия BMP восстанавливает нейрогенный потенциал каудальной части NC, т.к. предупреждает клеточный апоптоз, обычно наблюдаемый во время нормального развития в этом регионе (Osorio et al. 2009). Следовательно, регулируемые уровни активности BMP/Wnt1, скорее всего, играют роль в жизнеспособности клеток и дифференциальной сегрегации клонов.

Важно понять, может ли и как эпителиальная конформация в противовес мезенхимной клеток NC затрагивать состояние их спецификации. Пример в пользу этой линии доказательств предоставляется экспрессией N-cadherin в премиграторных предшественниках, который не только служит для поддержания эпителиального состояния, но и также ингибирует каноническую передачу сигналов Wnt (Shoval et al. 2007), скорее всего, путем рекрутирования β-catenin в апикальные соединения за счет пула β-catenin, который транслоцируется в клеточное ядро, где он действует как активатор транскрипции.

Вовлечение передачи сигналов BMP в предопределение предшественников NC показано в недавнем исследовании на эмбрионах рыбок данио. В цефалических регионах Twist1, как было установлено, играет важную роль в продвижении эктомезенхимы за счет не эктомезенхимных судеб, таких как производные ПНС и пигментные клетки. Twist1 способствует развитию эктомезенхимного клона путем индукции передачи сигналов fibroblast growth factor (FGF) и путем активации fli1a посредством консервативного специфичного для эктомезенхимы энхансера. BMP, происходит из сигналов из дорсальной части нейроэпителия посредством Id2a, чтобы ингибировать активность Twist1. Т.о., клетки краниальной части NC, мигрирующие вентрально и прочь от дорсального источника BMP, постепенно теряют ВМР в результате репрессии с помощью Id2a, способствуя тем самым спецификации эктомезенхимы, тогда как клетки, которые остаются в тесной близи от источника BMP приобретают нейральную судьбу (Das & Crump 2012). Следовательно, временное воздействие передачи сигналов BMP может влиять на судьбы, выбираемые ранними клетками NC.

Wnt1, как было установлено, действует ниже BMP в дорсальной части нервной трубки. Считается, что Wnt может быть частью сигнальной сети, которая оперирует в нейроэпителии, чтобы регулировать спецификацию NC, было показано, что на уровнях туловища у эмбрионов мышей сенсорные нейроны и меланоциты генерируются последовательно вследствие активности β-catenin. Избыток β-catenin на премиграторных стадиях способствует сенсорному нейрогенезу за счет практически всех остальных производных NC, тогда как избыток β-catenin на миграторных стадиях стимулирует эктопический меланогенез. Поскольку одна и та же передача сигналов лежит в основе развития разных фенотипов как функция времени, то состояние детерминации предшественников мишеней может быть уже отличным на предыдущих стадиях (Lee et al. 2004; Hari et al. 2012).

Первоначальные доказательства подчеркивали молекулярные различия между предполагаемыми предшественниками в дорсальной части нервной трубки. Foxd3, Snail2 и Sox9 экспрессируются в нейральных, но не меланогенных предшественниках у птиц уже на премиграторных стадиях (Krispin et al. 2010b). Эти гены могут служить в качестве детерминант судеб, чтобы управлять нейральным и/или ингибировать развитие меланоцитов, соотв. ([Thomas & Erickson 2009; Krispin et al. 2010b], Nitzan et al., unpubl. data, 2012). Транскрипция всех трех генов позитивно регулируется с помощью BMP4 и Wnt1 (Sela-Donenfeld & Kalcheim 1999; Burstyn-Cohen et al. 2004), подтверждая существование регуляторной сети премиграторных генов, которая обеспечивает передачу сигналов и транскрипционных факторов, ответственных за ранний выбор судеб. Поскольку точную роль каждого из выше упомянутых факторов и природу их взаимодействий ещё предстоит выяснить и необходимо идентифицировать дополнительные гены, которые обладают дифференциальной пространственно и/или временной экспрессией в дорсальной части нервной трубки, для подтверждения представленной выше гипотезы.

Работая с рыбками данио, группа Eisen предоставила элегантную модель переключения судеб между Rohon-Beard (RB) клетками и сенсорными нейронами в DRG. DeltaA мутанты обнаруживали избыток RB клеток в дорсальной части спинного мозга, но были лишены туловищного NC, хотя развитие цефалического NC оставалось интактным. Кроме того, Neurogenin 1 (Ngn1) был первым, необходимым для спецификации RB клеток и лишь позднее оказывался необходим клеткам в DRG. Более того, передача сигналов Delta/Notch, как было установлено, репрессирует экспрессию Ngn1, способствуя тем самым выбору судеб NC в латеральных частях нейральной пластинки (Cornell & Eisen 2000, 2002). Perez and colleagues (1999) установили, что у эмбрионов кур субнабор клеток NC экспрессирует Ngn1/2 сразу после эмиграции и что эти клетки склонны к выбору судьбы сенсорных нейронов. Избыточная экспрессия этих транскрипционных факторов локализует клетки в DRG и вызывает экспрессию маркеров сенсорных нейронов. Однако мышиные клетки, экспрессирующие репортер для Ngn2, были обнаружены, как вносящие равный вклад в сенсорные нейроны и глию (Zirlinger et al. 2002), выбор судеб, который, по-видимому, происходит после прибытия клеток в месте предназначения (see below). Кроме того, отслеживание судеб в субнаборе контралатерально мигрирующих клеток NC показало, что они генерируют специфически болевые (nociceptive) нейроны в DRG (George et al. 2007), это подтверждает идею ранней спецификации некоторых клеток NC в сенсорный клон.

Как упоминалось выше, выбор некоторых судеб, воспринимаемых NC предшественниками, происходит после прибытия клеток на место. Напр., выбор стать нейрональной или глиальной клеткой происходит внутри зачатка ганглия. После заполнения DRG предшественники, как было установлено, подвергаются асимметричным клеточным делениям, после чего Numb- и Delta-экспрессирующие клетки становятся нейрональной сердцевиной ганглия, тогда как Notch-экспрессирующие клетки формируют глию, в основном расположенную по периферии. Экспериментальные манипуляции подтвердили, что этот выбор зависит от механизма Notch-обеспечиваемого латерального ингибирования (Morrison et al. 2000; Wakamatsu et al. 2000).

Дополнительными местами мишенями, которые принимают судьбоносные решения позже, являются сайты, расположенные вдоль периферических нервов, выходящих из спинного мозга, которые выстланы NC-производными предшественниками Шванновских клеток. Последние клетки были описаны как дополнительный источник меланоцитов (Adameyko et al. 2009). Недавно предложен механизм, с помощью которого реципрокное ингибирование между Sox2 и Mitf диктует решения становиться или Шванновскими клетками или меланоцитами, и что подавление Sox2 в нервах, происходящих из предшественников Шванновских клеток, обязательно для усиления активности Mitf и последующей спецификации в клон меланоцитов (Adameyko et al. 2011).

A spatio-temporal fate map of DM derivatives

DM представлен центральным листком, ограниченным 4 губами. Несмотря на инициальные противоречия между разными исследованиями эмбрионов птиц, теперь общепринято, что четыре губы DM, образуются полностью удлинёнными миоцитами (Fig. 1) (Kahane et al. 1998, 2002; Cinnamon et al. 1999, 2006; Denetclaw & Ordahl 2000; Huang & Christ 2000; Gros et al. 2004). Недавно молодой, всё ещё эпителиальный центральный листок, как было установлено, также продуцирует миоциты с помощью механизма, который ещё предстоит выяснить (Ben-Yair et al. 2011). Современные знания показывают, что выше указанные предшественники отслаиваются в подлежащий миотом, где они временно распространяются на всю его толщину и удерживают апикально-базальную полярности до дифференцировки в unit-length волокна. Следовательно, весь DM обладает способностью генерировать миотомные миоциты (Fig. 1B).

На более поздней стадии центральный листок DM диссоциирует, продуцируя дермис, а также Pax3/7-позитивные мышечные предшественники, которые остаются митотически активными внутри миотома (Kahane et al. 2001; Ben-Yair & Kalcheim 2005). Эти предшественники, как было установлено, у мышей и кур постепенно развиваются в волокна или сателлитные клетки (Gros et al. 2005; Kassar-Duchosoy et al. 2005; Relaix et al. 2005). Важно, что как митотические миобласты, так и дермис возникают из одиночных клеток DM, это может указывать на то, что они, по крайней мере, бипотентные при нормальных условиях (Ben-Yair et al. 2003; Ben-Yair & Kalcheim 2005).

DM является также источником сосудистых типов клеток у эмбрионов птиц. Клональный анализ, проведенный на уровне одиночных клеток показал, что все эпителиальные домены, в своем латеральном регионе являются наиболее плодовитыми производителями гладких мышц и эндотелия. Типичными локализациями эндотелиальных и гладкомышечных фенотипов, продуцируемых DM, были кардинальные вены и вителлиновые артерии, мезонефрические, дермальные и соматоплевральные сосуды. Отметим, что продукция эндотелиальных клеток максимальная в латеральных частях эпителиальных сомитов (E2) и постепенно снижается с развитием. Пропорция гладкомышечных клеток была наивысшей на ст. E2 и E2.5 по сравнению с E3, когда миотомные клетки становились основными производными. Эти результаты подтверждают упорядоченный во времени ход расхождения клонов из латеральных частей сомитов и последующего DM, при этом наблюдается перекрывание во времени с генерацией субклонов гладких и поперечно исчерченных мышц (Ben-Yair & Kalcheim 2008). Это особенно важно, т.к. ретроспективный анализ клонов у трансгенных мышей с использованием nlaacZ репортера, показал, что эндотелиальные, гладкие мышечные и поперечно-полосатые мышечные клетки обладают общим ранним предшественником, присутствующим до начала сомитогенеза (Esner et al. 2006).

В отличие от фланговых уровней оси анализ судеб клеток латеральных частей сомитов, проведенный на уровне задних конечностей показал, что значительная пропорция одиночных предшественников продуцирует как эндотелиальные, так и поперечно-полосатые мышечные клетки (Kardon et al. 2002a), подтверждая, что сегрегация судеб на уровне задних конечностей является поздним процессом, т.к. латеральные предшественники отсоединяются и мигрируют экстенсивно в конечность ещё до выраженной дифференцировки.

Птичьи эмбрионы чрезвычайно удобны для отслеживания клонов дискретных субдоменов DM благодаря легкости осуществления контролируемой в пространстве и времени фокальной электропортации и инъекций в одиночные клетки клональных трассеров (Fig. 2B) (Ben-Yair & Kalcheim 2010). Эти исследования подчеркивают гетерогенность эпителиальных сомитов и DM, это ставит вопрос о механизмах, ответственных за сегрегацию судеб (see below).

The state of specification of DM progenitors

Клональный анализ DM предшественников показал, что разделение на мышечный, сосудистый и дермальный клоны происходит контролируемым во времени и пространстве способом (see above and [Scaal & Christ 2004; Kalcheim & Ben-Yair 2005; Kalcheim et al. 2006; Ben-Yair & Kalcheim 2008; Buckingham & Montarras 2008; Buckingham & Vincent 2009]). Следовательно, DM является привлекательной моделью для исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе выбора клетками судеб, и оперирующих в эпителии.

Напр., созревание центральной пластинки DM связано с поразительным сдвигом в плоскости делений эпителиальных клеток с первоначальной планарной ориентации, при которой митотическое веретено ориентировано параллельно медио-латеральной протяженности пластинки DM, на перпендикулярную ориентацию перед диссоциацией клеток, которая генерирует одну апикальную и одну базальную дочернюю клетки и этот сдвиг, как было установлено, зависит от функции LGN. LGN это у млекопитающих гомолог Drosophila Partner-of-Insc (Pins), который важен для позиционирования веретена за счет сцепления с клеточным кортексом митотического веретена (Du et al. 2001; Gotta et al. 2003; Du & Macara 2004; Sanada & Tsai 2005; Siller et al. 2006). LGN-зависимые планарные клеточные деления в раннем DM листке, как было установлено, необходимы для поддержания симметричных делений, которые предопределяют предшественников или в DM (самообновляющиеся предшественники) или в миотом как миоциты. Более того, обычный 90° сдвиг в плоскости клеточного деления перед эпителиальной диссоциацией, как было установлено, важен для генерации баланса между мышечными в противовес дермальным судьбам. Следовательно, центральный эпителий генерирует последовательно миоциты и затем митотические миобласты и дермис, а LGN-зависимая ориентация клеточных делений является критической для сегрегации судеб на обеих стадиях (Ben-Yair et al. 2011). Связан ли этот процесс с асимметричным распределением детерминант клеточных судеб между дочерними клетками или он в основном результат дифференциальной транслокации мультипотентных клеток в миотом и дермис, где и происходит действительная спецификация, ещё предстоит выяснить. Соответственно, N-cadherin, как было установлено, одинаково наследуется обеими дочерними клетками во время планарных митозов в DM и только апикальными дочерними клетками во время перпендикулярных клеточных делений. Более того, избыток и потеря активности N-cadherin заставляет DM предшественников колонизировать миотом и дермис, соотв. (Cinnamon et al. 2006). Пока неясно, однако, действует ли N-cadherin как детерминант судеб в DM или в основном как молекула клеточной адгезии, которая посредством гомофильных взаимодействий с миотомными клетками, которые также экспрессируют белок, управляя достижением клетками в места предназначения в зачатке миотома за счет дермиса. Концентрация перпендикулярных митозов, как описывается, преобладает в DM дорсомедиальной губе (Venters & Ordahl 2005). Появление таких делений тесно ассоциирует с асимметричной локализацией фактора Notch пути Numb, делающего такие деления асимметричными. Напротив, планарные были свободны от Numb и поэтому были названы симметричными. Можно предположить, что в приведенных выше перпендикулярных митозах Numb-экспрессирующие дочерние клетки транслоцируются в миотом, тогда как Numb-негативные клетки остаются в эпителии DM в качестве пролиферативных предшественников, хотя экспериментальные данные, подтверждающие это мнение пока недоступны.

В качестве дополнительного образца для изучения расхождения клонов в латеральной части сомитов и DM птиц могут выступать клоны, происходящие из индивидуальных предшественников, дающие или эндотелиальные или гладкомышечные клетки, но не оба типа, указывая тем самым на раннюю сегрегацию сосудистых клонов. Напротив, смешанные клоны, содержащие как гладкие, так и поперечно исчерченные клетки, были очевидными (Fig. 2B lateral). Соотв., передача сигналов BMP необходима для дифференцировки и/или миграции, но ингибирует дифференцировку поперечно-полосатых мышц (Kahane et al. 2007; Ben-Yair & Kalcheim 2008). Кроме того, активность Notch, как было установлено, необходима для продукции гладких мышц, но ингибирует дифференцировку поперечно-полосатых мышц. Следовательно, выбор стать гладкими или поперечно-полосатыми мышцами зависит от передачи сигналов Notch (Ben-Yair & Kalcheim 2008). У мышей, Buckingham и сотр. (Lagha et al. 2009) идентифицировали транскрипционный фактор Foxc2 в качестве гена, который негативно регулируется с помощью Pax3/7 и показали, что они ингибируют экспрессию др. др. Анализ компаундных мутантов и манипуляции с эксплантами сомитов показали, что Pax3/Foxc2 соотношение влияет на выбор судьбы между миогенной и сосудистой клеточной судьбой, соотв. Напротив, в конечностях Pax3, по-видимому, не детерминирует клетки латеральной части дермомиотома в клетки с мышечной судьбой (Kardon et al. 2002b). Дальнейшие исследования необходимы для выяснения взаимоотношений между сигнальными системами, такими как Notch и BMP и их нижестоящими транскрипционными факторами в сегрегации вышеописанных клонов.

Interactions between NC and somites control multiple events

NC induction

Действительная индукция NC испытывает влияние со стороны взаимодействий с мезодермальной тканью (see [Basch & Bronner-Fraser 2006; Basch et al. 2006; Stuhlmiller & Garcia-Castro 2012] for comprehensive reviews). На стадии гаструлы dorsolateral marginal zone (DLMZ) Xenopus, которая расположена вентрально по отношению проспективного NC и генерирует параксиальную и промежуточную мезодерму, является источником сигналов, индуцирующих NC (Fig. 3A). Эксперименты по рекомбинациям с DLMZ и анимальными шапочками или трансплантациям параксиальной мезодермы в вентральный эпидермис стимулируют экспрессию маркеров NC (Bonstein et al. 1998; Monsoro-Burq et al. 2003; Steventon et al. 2009). Более того, экспланты NC на ст. нейрулы поддерживают экспрессию маркеров NC, если ко-культивируются с параксиальной мезодермой, указывая на участие мезодермы в поддержании фазы качественных особенностей NC (Bonano et al. 2008; Steventon et al. 2009). DLMZ экспрессирует множественные лиганды Wnt и FGF l и BMP антагониста Chordin (Mayor et al. 1995; Monsoro-Burq et al. 2003; Hong et al. 2008; Steventon et al. 2009) (Fig. 3A), молекулы, как известно, участвующие в индукции NC. Сходным образом, у птиц рекомбинации между возникающей нервной тканью и сомитами или латеральной мезодермой также генерируют производные NC меланоциты (Selleck & Bronner-Fraser 1995).

Figure 3. Examples of neural crest (NC)somite interactions. (A) The dorsolateral marginal zone (DLMZ) patterns the NC. The DLMZ of the Xenopus gastrula is close to the neural plate (NP)-ectoderm boundary. Wnt, Chordin and Fgf signaling from the DLMZ specify NC in this domain, thereby inducing expression of Snail2 and other early NC markers. (B) The medial lip of the nascent dermomyotome (DM) controls the timing of NC delamination. In the early dorsal neural tube (NT), prior to the onset of NC emigration, levels of noggin are high, in part due to somite-derived fibroblast growth factor (FGF) signaling, thereby inhibiting the activity of BMP4 and consequent NC delamination. During dissociation of the somite, decreasing FGF signaling results in reduced transcription of noggin in the dorsal NT. Consequently, inhibition on BMP4 is relieved, Wnt1 transcription is stimulated and NC emigration is set in motion. In parallel, increasing retinoic acid (RA) levels in the DM act upon the dorsal NT to induce Wnt1 and trigger NC cell emigration (yellow cells). (C) The DM and later dermis influences the choice of pathways followed by NC cells. During the early stage of NC migration, DM cells express the secreted ligand Slit2, which acts upon Robo1/2-expressing NC cells (red) to prevent them from entering prematurely the dorsolateral pathway. At a later stage of migration, the Edn3 ligand, expressed in the somite-derived dermis and in the ectoderm attracts melanoblasts (green) that express the Ednrb2 receptor following delamination from the neural tube; this interaction guides them into the dorsolateral pathway. (D) The dorsal neural tube (NT) patterns the medial DM. NT-derived Bmp4 and Wnt1 signal the adjacent dorsal somite (S) to promote a medial identity, the development of the medial lip of the DM, and the expression of genes such as noggin and Wnt11, respectively. (E) Migrating NC cells regulate myogenesis. Migrating NC cells (yellow) meet the dorsomedial lip (DML) of the DM and signal through Delta1 (Dll) to transiently activate Notch in the DM; this results in enhanced myogenesis at the expense of Pax7-positive progenitors in the epithelium. Migrating NC cells fated to become Schwann cells (red) along peripheral nerves (blue) and sympathetic ganglia (SG) adjacent to the dorsal aorta (DA) (red) signal through Nrg1/ErbB3 to the central and hypaxial DM and myotome (pink) to maintain the progenitor state while inhibiting myogenic differentiation. See text for details and references. N, notochord; NP, neural plate; Scl, sclerotome.

The timing of NC EMT

Значительное количество доказательств происходящее, прежде всего, от эмбрионов птиц, связано с началом миграции NC в туловище, с сомитогенезом и последующей диссоциацией сомитов (Loring & Erickson 1987; Teillet et al. 1987). На уровне сегментной пластинки презумптивные NC предшественники всё ещё ограничены дорсальной частью нервной трубки (NT) (Teillet et al. 1987). Эмиграция первых клеток NC становится очевидной на уровнях противостоящих эпителиальным сомитам. Более того, после диссоциации сомита они продолжают покидать нейроэпителий и одновременно начинают заполнять сомит посегментно (Fig. 1B) (Loring & Erickson 1987; Teillet et al. 1987; Kalcheim & Teillet 1989; Debby-Brafman et al. 1999). Это указывает на то, что параксиальная мезодерма регулирует определенные аспекты NC EMT и эмиграции. Однако, в ростральной части туловища сигналы, запускающие NC EMT, могут не находиться под строгим контролем сомитов как на ранних стадиях, существует асинхронность между сомитогенезом и исходом нервного гребня (Newgreen & Erickson 1986).

При взаимодействии между noggin и BMP4 в дорсальной части NT, как было установлено, генерируется градированная активность последнего, это посредством регуляции транскрипции Wnt1 и Wnt-зависимой канонической передачи сигналов запускает отслоение NC предшественников и затем начало клеточной миграции (Sela-Donenfeld & Kalcheim 1999; Burstyn-Cohen et al. 2004) (Fig. 3B). Этот рострально-каудальный градиент активности BMP4 генерируется, несмотря на постоянный уровень продукции мРНК BMP4 вдоль дорсальной части NT с помощью действительно противостоящего, понижающегося градиента транскрипции noggin и активности, которые коррелируют с развитием сомитов. Подавление noggin прогрессивно уменьшает ингибирование BMP и делает возможным NC EMT. Как генерируется эта градированная экспрессия noggin в дорсальной части NT остается неясным. Благодаря корреляции во времени между уровнями noggin и развитием сомитов, сомитные факторы, как полагают, влияют на уровни мРНК noggin в NT. В соответствие этому мнению эксперименты по трансплантациям показали, что диссоциирующие, но не более молодые сомиты, испускают ингибитор продукции noggin в дорсальной части NT, тем самым связывают время EMT с развитием сомитов как подходящих субстратов для последующей миграции NC (Sela-Donenfeld & Kalcheim 2000). Несмотря на это, точная идентификация этих факторов остается не осуществленной. Недавно описаны противоположные градиенты FGF и ретиноевой кислоты, обнаруженные в параксиальной мезодерме, где описываются как участвующие в контроле времени NC EMT, помимо впечатляющих специфических аспектов на индукцию NC. Снижение FGF на уровнях сомитов, как полагают, необходимо для подавления noggin. Напротив, ретиноевая кислота не нужна для модуляции транскрипции noggin. Кроме того, передача сигналов FGF предупреждает преждевременную экспрессию Wnt1, тогда как ретиноевая кислота запускает транскрипцию Wnt1 на осевых уровнях, которые содержат специфические NC предшественники. Следовательно, противоположные градиенты FGF и ретиноевой кислоты влияют на NC EMT, по крайней мере, частично путем модуляции специфических аспектов сигнальных путей BMP и Wnt (Fig. 3B) (Martinez-Morales et al. 2011), приводя в движение этот процесс (see above).

В этом контексте,следует упомянуть, что продуцируемый эктодермой Wnt6 способствует инициальной эпителизации сомитов, однако Wnt6 подавляется после формирования DM (Schmidt et al. 2004). На более поздней стадии FGF8 из миотома, как полагают, способствует диссоциации лежащей поверх центральной части DM посредством Snail1-зависимого механизма (Delfini et al. 2009). Следовательно, ранняя эктодермальная передача сигналов Wnt, сопровождаемая передачей сигналов FGF из параксиальной мезодермы и её производных, выполняет непосредственную и опосредованную роль в EMT предшественников как NC, так и DM. Хотя нижестоящие механизмы, приводящие к NC EMT изучались очень активно, но мы всё ещё лишены молекулярного понимания процесса, ответственного за диссоциацию пластинки DM, или прогрессивное отслоение клеток от губ DM, за исключением вентро-латерального края на плечевом и пояснично-кресцовом уровнях оси, где hepatocyte growth factor/scatter фактор посредством рецептора Met запускает EMT и миграцию в зачатки конечностей (Dietrich et al. 1999; Vasyutina & Birchmeier 2006).

Segmental migration of NC and patterning of the peripheral nervous system

ПНС у высших позвоночных сегментирована, чтобы выстроить периферические ганглии и нервы в соответствии с позвоночником. Этот паттерн устанавливается во время эмбриогенеза, когда формируются позвонки из склеротомов, происходящих из сомитов, и клетки NC преимущественно мигрируют в ростральные половинки склеротомов (Fig. 1). Трансплантационные эксперименты на эмбрионах птиц показали, что метамерное расположение ПНС зависит от ростро-каудального чередования склеротомных свойств (Keynes & Stern 1988; Keynes et al. 1990; Kalcheim & Goldstein 1991; Fraser 1993; Kalcheim 2000), и таким образом развиваются специфические компоненты позвонков (Goldstein & Kalcheim 1992; Bruggeman et al. 2012). Некоторые молекулярные семейства, как было установлено, обеспечивают сегментную миграцию NC преимущественно посредством отталкивающих взаимодействий между каудальной частью склеротома и NC клетками; они включают Eph и Ephrins, F-spondin, Neuropilins и Semaphorins, T-cadherin, etc. (Krull et al. 1997; Debby-Brafman et al. 1999; Krull 2001; Gammill et al. 2006; Kuriyama & Mayor 2008; Roffers-Agarwal & Gammill 2009; Schwarz et al. 2009). Напр., отталкивающие наводящие сигналы SEMA3A от каудальной части склеротома и DM и их рецептор neuropilin 1 (NRP1) являются важными для направления миграции клеток NC через ростральную часть склеротома посредством прирожденных путей вдоль межсомитных кровеносных сосудов. Потеря функции любого из генов вызывает избыточную миграцию NC между сомитами, потерю сегментации и эктопическую дифференцировку нейронов. Следовательно, переключение с пути между сомитами на путь через склеротом является обязательным условием для собственно формирования паттерна ПНС и контролируется с помощью SEMA3A/NRP1 взаимодействий между склеротомом и чувствительными NC предшественниками (Schwarz et al. 2009).

Поскольку некоторые активности, скорее всего, оперируют последовательно (Debby-Brafman et al. 1999; Krull 2001; Gammill et al. 2006; Kuriyama & Mayor 2008; Roffers-Agarwal & Gammill 2009; Schwarz et al. 2009), то тот факт, что множественные сигнальные системы участвуют в обеспечении миграции NC предшественников по вентральному пути, указывает на кооперативные взаимодействия между ними и, следовательно, на существование регуляторной сети, которая гарантирует формирование сегментного паттерна. Кстати, нет экспериментальных данных, подтверждающих это мнение.

Заслуживает упоминания в этом контексте то, что дополнительные взаимодействия происходят внутри индивидуальных сегментов, это объясняет ростро-каудальную полярность свойств склеротомов. Такие взаимодействия между каудальной частью склеротома и возникающим миотомом демонстрируют формирование паттерна пионерских миобластов птиц. Пионерские миобласты генерируют первые миотомные волокна и действуют в качестве каркаса для дальнейшего формирования паттерна миотома. От места своего возникновения вдоль всего медиального края эпителиального сомита (Fig. 1, E2 green), они диссоциируют и мигрируют в направлении рострального края каждого сомита, от которого дифференцировка распространяется как в ростро-каудальном, так и медио-латеральном направлении. Такое направленное поведение, которое происходит в индивидуальных сегментах, напоминает полярность миграции NC. Трансплантационные эксперименты показали, что регуляция формирования пионерского паттерна присуща самим сомитам. Более того, пионерские миобласты экспрессируют Robo2, тогда как DM и каудальная часть склеротома экспрессируют Slit1. Потеря Robo2 или происходящего из склеротома Slit1 (но не происходящего из DM Slit1) ведет к функциональным нарушениям как в направленной миграции клеток, так и в формировании волокон, а их эффекты были опосредованы через RhoA (Halperin-Barlev & Kalcheim 2011). Следовательно, сигналы, исходящие из каудального домена склеротома, контролируют как нейральные, так и скелетные предшественники, подчеркивая важность гетерогенности внутри сомита при формировании некоторых аспектов паттерна плана тела, которые функционально связаны с последней стадией.

Melanoblast migration along the dermomyotome-derived dermis

Как показано выше, NC клетки мигрируют вдоль нескольких отличающихся путей в туловище развивающегося эмбриона. У кур рано мигрирующие клетки нервного гребня, которые дают нейральные производные, ограничены вентральными путями, медиальнее DM и между сомитами, тогда как более поздние клетки, которые продуцируют меланоциты, мигрируют вдоль дорсо-латеральных путей под эктодермой. Этот путь становится обычно "доступным" после диссоциации эпителиального DM, он генерирует дорсальный дермис, мезенхиму, которая служит в качестве субстрата для миграции меланоцитов (Erickson et al. 1992; Tosney 1992). Т.о., также в случае миграции меланобласта происходит тесное взаимодействие межу NC предшественниками и производными сомитов.

Slit лиганды и Robo рецепторы участвуют в разных аспектах миграции NC в туловище. Slit2 экспрессируется в DM , а рано мигрирующие клетки NC экспрессируют Robo1 и Robo2. Более того, Slit2, как было установлено, отталкивает миграцию NC in vitro, эктопическая экспрессия доминантно-негативного рецептора Robo1 индуцирует существенную фракцию ранних NC клеток к эктопической миграции вдоль дорсо-латерального пути, обычно используемого меланоцитами. Эти находки подтверждают, что DM-производный Slit2 репрессирует вступление NC на дорсо-латеральный путь, ограничивая тем самым миграцию ранних NC клеток вентральным путём (Fig. 3C) (Jia et al. 2005). Дополнительные отталкивающие сигналы присутствуют как в каудальной части склеротома, так и на дорсо-латеральном пути, они, как известно, ограничивают миграцию нейральных предшественников и включают ephrins, F-spondin, chondroitin sulfate proteoglycans и PNA-связывающие молекулы (see above and [Oakley & Tosney 1991; Oakley et al. 1994; Debby-Brafman et al. 1999; Santiago & Erickson 2002]). Некоторые из этих ингибирующих молекул остаются на дорсо-латеральном пути и во время инвазии меланобластов из этого домена и их миграции у эмбрионов птиц, это позволяет предположить, что происходит экспрессия позитивных хемотактических молекул наведения, таких как Ednrb2 и EphB2 рецепторы (Harris et al. 2008). Напр., Ednrb2 активируется в меланобластах ещё до вступления в дорсо-латеральный домен, а endothelin3 (ET3), его лиганд, экспрессируется клетками эктодермы, DM и мезенхимного дермиса (Lecoin et al. 1998; Nataf et al. 1998; Nagy & Goldstein 2006; Krispin et al. 2010b). Harris and Erickson установили, что Ednrb2 и EphB2 управляют инвазией меланобластов по дорсо-латеральному пути и подтвердили, что передача сигналов от этих рецепторов является дополнительной, поскольку избыточная экспрессия одного рецептора может заменить потерю другого (Harris et al. 2008). Интересно, что даже если инициация дорсо-латеральной миграции совпадает с появлением дорсального дермиса, то эктопическая экспрессия Ednrb2 в NC предшественниках наиболее ранних стадиях достаточна для направления миграции клеток преимущественно между эктодермой и эпителиальным DM (Krispin et al. 2010b). Возможно высокие уровни Ednrb2 рецепторов доминируют над ингибирующими сигналами, присутствующими в поверхностных путях на ранних стадиях (Fig. 3C). Т.о., происходящие из дермиса факторы привлекают происходящие из NC меланобласты, которые позднее проникают в кожу, чтобы обеспечить её характерными паттернами пигментации.

NC- mesoderm interactions in the regulation of myogenesis

Пространное общение NC клеток с соседней мезодермой распознается на всех уровнях нейральной оси. В голове клетки NC, как известно, вносят вклад в формирование скелетных элементов и соединительной ткани. Прогрессивные взаимодействия между NC и краниальной мезодермой форматирует черепно-лицевой морфогенез и аспекты взаимной клеточной дифференцировки mesoderm shape craniofacial morphogenesis and aspects of mutual cell differentiation (Noden & Trainor 2005). NC клетки являются также источником автономной молекулярной информации, которая генерирует морфологию клюва птиц, поскольку трансплантированные NC клетки перепела продуцируют клюв перепела у уток хозяев , а утиный NC продуцирует утиные клювы у хозяев перепелов. Эти трансформации используют регуляцию экспрессии генов в соседней ткани хозяина, а также морфологические изменения тканей клюва хозяина, которые включают эктодерму, а также происходящие из мезодермы мышцы (Schneider & Helms 2003; Le Douarin et al. 2004). Клетки краниального NC также заполняют фарингеальные дуги, которые содержат в своем центре массу мезодермальных клеток. Эти происходящие из мезодермы клетки оказываются окруженными NC, снаружи покрыты эктодермой, а изнутри энтодермой (Le Douarin & Kalcheim 1999; Graham 2003). Мезодермальные клетки сливаются вместе, чтобы сформировать мышечные волокна, которые прикрепляются к специфическим производным NC скелетным компонентам высоко скоординированным способом (Noden 1983; Couly et al. 1992; Kцntges & Lumsden 1996; Schilling & Kimmel 1997; Grammatopoulos et al. 2000; Cerny et al. 2004; Grenier et al. 2009). Такое расположение имеет большое значение для черепно-лицевого развития, поскольку нарушения во взаимодействиях между мезодермой, NC и эпителием оказывают выраженные эффекты на черепно-лицевое развитие. Функциональный рот, напр., зависит от скоординированного развития производного NC лицевого скелета и ассоциированной мускулатуры, которая происходит из мезодермы. Более того, сигналы, испускаемые клетками NC, инструктируют мезодермальные предшественники дифференцироваться в предшественники миобластов и затем организовать самих себя вокруг развивающихся скелетных элементов. Используя эмбрионов мышей и птиц, группа Tzahor показала, что ранний миогенез не зависит от взаимодействий с краниальным NC, до миграции, формирования паттерна, пролиферации и дифференцировки мышечных предшественников, регулируемых с помощью предшественников нервного гребня (Rinon et al. 2007).

В туловище растут доказательства, что взаимодействия между NC и сомитами играют фундаментальную роль в развитии производных сомитов. Напр., дорсальная часть NT, которая содержит премиграторный NC, регулирует специфические аспекты развития DM посредством активности BMP4 (Sela-Donenfeld & Kalcheim 2002), также как и последующее образование дорсального дермиса посредством Neurotrophin 3 (Brill et al. 1995). Кроме того, передача сигналов Wnt формирует паттерн медиальной части DM (Spence et al. 1996; Capdevila et al. 1998; Ikeya & Takada 1998; Schmidt et al. 2000; Olivera-Martinez et al. 2001). Напр., Wnt1 из дорсальной части NT действует посредством beta-catenin-зависимого пути, контролируя экспрессию Wnt11 в медиальной части DM (Fig. 3D) (Marcelle et al. 1997), которая в свою очередь ориентирует элонгацию миоцитов. Wnt11 обеспечивает этот эффект посредством пути планарной клеточной полярности (Gros et al. 2009).

Будучи вовлечены в миграцию клетки NC , как было установлено, предоставляют про-миогенные сигналы посредством активации Notch пути в предшественниках медиальной части DM эмбрионов кур. После взаимодействия мимоходом с NC предшественниками, клетки медиальной губы DM, которые экспрессируют временно Pax7 активируют передачу сигналов Notch, вследствие чего они транслоцируются в миотом, где они становятся Myf5-позитивными и затем дифференцируются в MyHC-экспрессирующие миоциты (Fig. 3E) (Rios et al. 2011). Это может быть важным для выяснения, являются ли эти события результатом локального взаимодействия между вентрально мигрирующими клетками NC, которые контактируют с губой DM, или более общим свойством мигрирующих клеток NC, которые контактируют с дополнительными доменами в DM, которые также обладают миогенным потенциалом. Более того, возможны взаимодействия между временной активацией Notch и Wnt11 в медиальной губе DM , которые предстоит исследовать в контексте миогенной индукции и собственно формирования паттерна.

Др. недавнее исследование подчеркивает важность производного NC Neuregulin1. который действует прежде всего посредством ErbB3 рецептора, и, как было установлено, регулирует развитие мышц у мышей путем поддержания пула Pax7 предшественников и предупреждения преждевременной миогенной дифференцировки (Fig. 3E) (Van Ho et al. 2011). Во-первых, авт. специально доставляли доминантно-негативную Pax3 конструкцию в клетки NC туловища, в результате наблюдали 30% уменьшение вентрально мигрирующих клеток NC. Соотв., количества Pax7-позитивных предшественников снижались как в центральной части DM, так и в hypaxial мышцах, с ранней активацией генов спецификации, но с последующей недостаточностью терминальной мышечной дифференцировки. Следовательно, отсутствие предшественников NC вызывало истощение пула предшественников, ведущее в конечном итоге к более маленьким мышцам. Помимо этого инициального наблюдения они охарактеризовали NC-продуцируемый Neuregulin1 как фактор, ответственный за поддержание пула Pax7-позитивных предшественников за счет дифференцированных мышц. Было бы интересно сравнить, могут ли Pax7-позитивные предшественники в DM и те, что располагаются в мышцах сходным образом отвечать на Neuregulin1 и/или на дополнительные, продуцируемые NC сигналы (Kalcheim 2011).

Concluding remarks

The early heterogeneity already apparent in the dorsal NT and the DM imposes the need for searching local cues that operate within the epithelia themselves such as cell adhesion-dependent mechanisms, oriented cell divisions, morphogen gradients etc., and for local cues in the vicinity that may impact upon epithelial behavior. In addition, these epithelia are highly dynamic as different populations transit, for example, through the dorsal NT and the lateral DM while epithelial integrity is maintained. How is the knowledge for establishing successive waves of progenitors acquired remains a central issue of research.

The existence of intimate interactions between NC cells and the various mesoderm-derived populations has already been firmly established to provide a basis for correct patterning of the segmental body plan (both neural and skeletal components), proper territory colonization by pigment cells and craniofacial morphology; and the repertoire of underlying molecular mechanisms is steadily increasing. An important aspect of these interactions is that these transient tissues continuously feed-back on each other to affect distinct events in a sequential manner. Future challenges are to elucidate whether all NC cells are equivalent in their ability to influence somitic processes, or, alternatively, is NC-somite signaling compartmentalized in space and time to distinct NC subsets and, if so, to pinpoint the specific populations and the responsible genes. Reciprocally, since the timing of NC EMT, their migration and differentiation are influenced by distinct somite cell subsets, elucidating the responsible gene regulatory network is the next essential requirement.

Neural crest and somitic mesoderm as paradigms to investigate cell fate decisions during developmentErez Nitzan, Chaya Kalcheim Development, Growth & Differentiation Special Issue: THE AVIAN MODEL SYSTEM EDITED BY R. LADHER, T. SUZUKI AND H. NAKAMURA Volume 55, Issue 1, pages 60–78, January 2013

Neural crest and somitic mesoderm as paradigms to investigate cell fate decisions during development
Erez Nitzan, Chaya Kalcheim
Development, Growth & Differentiation Special Issue: THE AVIAN MODEL SYSTEM EDITED BY R. LADHER, T. SUZUKI AND H. NAKAMURA Volume 55, Issue 1, pages 60–78, January 2013