Эндобплазматический ретикулум (ER) является трехмерной сетью мембранозных тубул и цистерн, которые распространяются по всей клетке от ядра к плазматической мембране. Интерфазный ER может быть подразделен на ядерный и периферический ER и сеть ER может иметь разную морфологию в разных областях клетки, что связано с разными функциями (Baumann and Walz, 2001). Он выполняет разные клеточные функции, включая транслокацию белков functions через ER мембрану, интеграцию белков в мембрану, упаковка и модификации белково в просвете и синтез фосфолипидов и стероидов (see Baumann and Walz, 2001; Voeltz et al., 2002). ER также распознается как главное хранилище Ca²⁺ в клетках, характеризующееся присутствием Ca²⁺ насосов, которые аккумулируют Ca²⁺, Ca²⁺-связывающие белки, которые удерживают ионы в просвете хранилища и Ca²⁺ каналы, чтобы быстро высвобождать Ca²⁺ в ответ на стимуляцию (rev. Meldolesi and Pozzan, 1998; Papp et al., 2003). Мобилизация накопленного в эти х хранилищах Ca²⁺ играет важную роль в агонистами-индуцированной передаче сигналов Ca²⁺ в стимлированных клетках и ионы Ca²⁺ используются как внутриклеточные сигналы, которые регулируют разнообразные клеточные функции (rev. Berridge et al., 2003; Rizzuto and Pozzan, 2006). Широкое распределение ER по всей клетке позволяет высвобождать Ca²⁺ в точных областях клетки и тонко регулировть специфические клеточные функции, такие как стимуляция ионных каналов в плазматической мембране, регуляция метаболизма митохондрий и регуляция гненой экспрессии в ядре (Rizzuto and Pozzan, 2006). Гетерогенность ER Ca²⁺ хранлищ зависит от неслучанйного распределения Ca²⁺-обслуживающих белков и локализации Ca²⁺ высвобождающих каналов, которые могут создавать локальные Ca²⁺ сигналы и микродомены в цитозоле (Papp et al., 2003). Регуляция уровня Ca²⁺ в ядре является примером сложной формы локальной передачи сигналов Ca²⁺. Увеличение концентрации Ca²⁺ в ядре может оказывать специфические эффекты, отличающиеся от тех, что наблюдаются в цитоплазме. Ca²⁺ важен в сигнальных путях, чтобы регулироовать экспрессию генов путем стимуляции транслокации факторов транскрипции из цитозоля в ядро; Ca²⁺ также транслоцирует или активирует энзимы, которые регулируют активность ядерных транскрипционных факторов и модифицирует структуру хроматина (Flavell and Greenberg, 2008; Mellstrom et al., 2008). Использование избирательных буфферов для цитоплазматического и ядерноплазматического Ca²⁺ делает возможной непосредственную демонстрацию, что клеточная пролиферация зависит от сигналов Ca²⁺ внутри ядра скорее, чем в цитоплазме (Rodrigues et al., 2007). Сходный подход в линиях живых клеток показал, что нуклеоплазматический Ca²⁺ необходим для mitogen-activated protein (MAP) киназой обусловленно транскрипции генов (Pusl et al., 2002). Ядро ограничивается ядерной оболочкой (NE), которая выполняет двойную функцию, т.к. она отграничивает нуклеоплазму от цитоплазмы и может непосредственно использоваться в передаче сигналов Ca²⁺ внутри ядра. Недавние обзоры описывают в деталях разные аспекты передачи сигналов ядерного кальция (Alonso and Garcia-Sancho, 2011; Bootman et al., 2009).

Structure of the NE

Использование флюоресцентной окраски, которая не может обмениваться между прерывающимися мембранами предоставляет доказательство, что ER является единственной мембранной системой (Terasaki and Jaffe, 1991) , а использование просветных green fluorescent protein (GFP)-нагруженных белков демонстрирует, что крупные молекулы могут быстро диффундировать внутри пространства просвета, ограничиваемого ER и NE мембранами (Subramanian and Meyer, 1997; for review, see Voeltz et al., 2002). Эта непрерывная мембранная система организована в разные специализрованные субдомены, такие как sER, rER или NE, которые морфологически отличны и выполняют разные функции. Так, большинство мембранных белков общее в sER и rER, но некоторые белки, участвующие в транслокации или преобразовании вновь синтезированных белков, обогащены в rER ( rev. Levine and Rabouille, 2005; Voeltz et al., 2002). NE разделяет ядерный и цитоплазматический компартменты интерфазных клеток. Наблюдаемое в световой микроскопии ядро, по-видимому, ограничивается мембраной, общей с ER, но ЭМ выявляет двойной мембранный слой вокруг ядра. Следовательно, NE может быть подразделена на три морфологически и биохимически разные структуры: наружную ядерную мембрану (ONM), внутреннюю ядерную мембрану (INM) и nuclear pore complex (NPC) (for reviews, see Baumann and Walz, 2001; Gerace and Burke, 1988). ONM является непрерывной с ER, она декорирована рибосомами и содержит множество белков, общих с ER. Она также обладает набором уникальных белков, некоторые из которых могут закреплять ядро на актиновом цитоскелете и центросоме; др. взаимодействуют посредством просвета с белками INM. INM чсодержит множество отличающихся белков, которые контактируют с подлежащей ламиной и хроматином (Batrakou et al., 2009; Hetzer, 2010; Prunuske and Ullman, 2006). Протеомный анализ NE выявляет типы клеток, специфически отличающиеся по составу белковых субкомплексов, и указывает на функциональную сложность NE (Schirmer and Gerace, 2005). ONM и INM продолжаются в каждый NP , который соединяет мембраны NE и регулирует транспорт между ядром и цитоплазмой. NPC является 120 MDa белковым комплексом, который обнаруживает 8-кратную ротационную симметрию с наружным диаметром в 100 nm и центральным транспортным каналом размером 40 nm в диаметре. он состоит из 30 разных белковых компонентов, некоторые с высоким мол. в, а др. удвоены много раз на NPC (Batrakou et al., 2009). NPC обеспечивает коммуникации и селективный обмен между нуклеоплазмой и цитоплазмой.

NE может наблюдаться или с помощью ЭМ или с помощью обычной микроскопии после иммуноокрашивания белков, присутствующих в или ассоциированных с любой из мембран NE. Эти исследования проиллюстрировали разнообразие ядерной формы в зависимости от типа клеток или клеточной физиологии. Такие подходы позволили идентифицировать динамичные тубулярные каналы, которые появляются в глубине узких инвагинаций NE. Эти инвагинации или впячи вания впервые были описаны в 1979 (Bourgeois et al., 1979), наблюдаются в большом количестве типов клеток (Clubb and Locke, 1998; Collado-Hilly et al., 2010; Fricker et al., 1997; Johnson et al., 2003; Langevin et al., 2010; Lui et al., 2003; Wittmann et al., 2009). Инвагинации NE недавно были классифицированы на два основых класса в зависимости от того, вовлекают ли они ONM (Malhas et al., 2011). Type I инвагинации это те, которые инвагинируют только INM в нуклеоплазму, они могут быть разветвлены и ветвисты. Инвагинации типа II затрагивают и INM и ONM. ЭМ исследования и недавно трехметрная структурная иллюминационная микроскопия выявили двухслойную структуру этих типа II инвагинаций и выявили присутствие NPC (Schermelleh et al., 2008). Тубулы, ограничиваемые этими типа II инвагинациями, содержат цитоплазматические компоненты, такие как актин (Clubb and Locke, 1998; Johnson et al., 2003) и митохондрии (Clubb and Locke, 1998; Lui et al., 2003). Эти инвагинации, которые были названы нуклеоплазматическим ретикулумом увеличивают область обмена между цитоплазмой и нуклеоплазмой и осуществляют контакты глубоко внутри ядра с хроматином, а иногда распространяются почти до ядрышка. Рис. 1 иллюстрирует присутствие инвагинаций NE в поляризованных эпителиальных клетках Madin–Darby почек собак (MDCK).

Figure 1. Polarised MDCK cells develop invaginations in the nuclear envelope

NE as a Ca²⁺ store

Просвет NE непрерывен с просветом ER (Subramanian and Meyer, 1997), так что можрно предположить, что Ca²⁺ накапливаемый где-нибудь в ER может диффундировать свободно в NE. Однако это не подразумевает, что Ca²⁺ униформно транспортируется внутри ER по всей клетке и мы можем сказать, вряд ли ядро обладает своей собственной транспортной системой Ca²⁺. Активное АТФ-зависимое накопление Ca²⁺ было измерено в изолироанных ядрах печени и оно оказалось ассоциировано с увеличением концентраций внутриядерного свободрного Ca²⁺ (Nicotera et al., 1989). Используя Ca²⁺-чувствительные флюоресцентные зонлды и конфокальный анализ, было показано, что Ca²⁺ накапливается в NE изолированных ядер печени (Gerasimenko et al., 1995), а измерения концентраций Ca²⁺ в NE с низкого сродства флюоресцентными Ca²⁺ зондами в интактных клетках дало значение покоя 250–350µM (Petersen et al., 1998). Sarco/endoplasmic reticulum Ca²⁺-ATPases (SERCAs) ответственны за активный транспорт Ca²⁺ в ER и было продемонстрировано, что насосы Ca²⁺ в NE идентичны тем, что в ER (Lanini et al., 1992). Семейство SERCA включает продукты трех генов, наз. SERCA1, SERCA2 и SERCA3, каждый дает альтернративно сплайсируемые мРНК и изоформы белков (for reviews, see Wuytack et al., 2002). Некоторые исследования сообщают о присутствии SERCA на NE путем использования boron–dipyrromethene (BODIPY)–thapsigargin, но гидрофобная природа этой молекулы вызывает некоторые сомнения в специфичности мечения (Collado-Hilly et al., 2010). Иммуногистохимические эксперименты прямо демонстрируют присутствие SERCA2 изоформы на NE эпителиальных клеток (Collado-Hilly et al., 2010; Lee et al., 1997a) или мышечных клеток (Abrenica and Gilchrist, 2000). Ca²⁺ насос также был найден в инвагинациях NE (Avedanian et al., 2011; Collado-Hilly et al., 2010). Т.к. ONM непрерывна с мембраной ER, то SERCA вполне возможно присутствует на ONM, но по нашим сведениям отсутствуют исследования EM, указывающие на присутствие SERCA на INM. В некоторых типах клеток sodium–calcium обменник, расположенный в INM может быть использован для переноса Ca²⁺ между нуклеоплазмой и просветом оболочки (Xie et al., 2002). Функциональные исследования показывают, что концентрации Ca²⁺ в нуклеоплазме снижаются после стимуляции. Это может быть обусловлено или прямым накачиванием через INM или диффузией через NPC.

Ca²⁺ насосы могут накапливать Ca²⁺ в специфических областях клетки, а Ca²⁺-связывающие белки в просвете ER предоставляют способный к высвобождению пул Ca²⁺ вблизи высвобождающих Ca²⁺ каналов (Papp et al., 2003). Ca²⁺-сохраняющий белок calreticulin был локализован с помощью иммуноцитохзимии в NE и в инвагинациях NE разных тканей, включая ооциты человека и эмбрионы и эпителиальные клетки (Balakier et al., 2002; Bedard et al., 2005; Collado-Hilly et al., 2010; Echevarria et al., 2003). Следовательно, присутствие Ca²⁺-связывающих белков в NE подтверждает их роль в качестве хранилищ Ca²⁺, которые могут прдеоставлять Ca²⁺ в ядро.

Локализация Ca²⁺-высвобождающих каналов является критической для генерации пространственно сложных Ca²⁺ сигналов и в этом случае для индукции ядерных Ca²⁺ сигналов. Inositol-1,4,5-trisphosphate (IP3), продуцируемый мембранными phosphoinositides после гормональной стимуляции, с IP3 рецептором (IP3R) и высвобождает Ca²⁺ из внутриклеточных хранилищ. Семейство IP3R включает продукты трех генов, названных IP3R1, IP3R2 и IP3R3, которые обнаруживают специфическое тканевое распределение, а иногда разные субклеточные локализации (Mikoshiba, 2007; Vermassen et al., 2004). Присутствие IP3R в ядре, как полагают, исходя из прямых измерений IP3-индуцированного высвобождения Ca²⁺ из ядер печени и из связывания радиомеченного IP3 с изолированными ядрами (Malviya et al., 1990; Nicotera et al., 1990). Однако мало сообщений, непосредственно демонстрирующих локализацию IP3R в ядре или NE, возможно из-за низкой плотности рецепторов, обнаруженных в этой органелле. Иммуногистохимические эксперименты, проведенные in situ подтвердили присутствие IP3R на околоядерном ER и на NE в эпителиальных клетках (Collado-Hilly et al., 2010; Lee et al., 1997b; Leite et al., 2003; Nakanishi et al., 1996; Siefjediers et al., 2007; Yule et al., 1997), кардиомиоцитах (Bare et al., 2005) скелетных мышечных клетках (Cardenas et al., 2005; Kusnier et al., 2006), клетках (Vermassen et al., 2003) и в ооцитах Xenopus (Kume et al., 1993). IP3R был также обнаружен на нуклеоплазматическом ретикулуме клеток HeLa (Lui et al., 2003), клеток печени (Echevarria et al., 2003), MDCK клеток (Collado-Hilly et al., 2010), кардиомиоцитов (Guatimosim et al., 2008) и гладкомышечных клеток (Avedanian et al., 2011). Некоторые исследования подтвердили, что IP3R2 более часто ассоциирует с ядром (Bare et al., 2005; Laflamme et al., 2002; Leite et al., 2003), но в соответствии со тканью, , следовательно, любой субтип рецептора может быть локализован в ядре (for review, see Vermassen et al., 2004). Иммуногистохимические эксперименты, проведенные с помощью обычнй микроскопии, неспособны установить, локлаизуются ли IP3Rs на ONM или INM. ONM облдает многими общими свойствами с ER мембранами и, в самом деле, IP3Rs были обнаружены на ONM изолированных ядер с помощью электрофизиологических измерений IP3-индуцированных токов (Mak and Foskett, 1994; Stehnobittel et al., 1995a). Однако загрязнение ER мембранами не может быть полностью исключено. Недавно цитоплазматический домен IP3R был непосредственно визуализован на изолированных ядрах Sf9 клеток с помощью freeze-dry rotary shadowing для ЭМ и оказался локализованным на цитоплазматической стороне NE (Cardenas et al., 2010). Хотя имеются прямые доказательства локализации IP3 на ONM, его присутствие на INM спорно. Функциональные эксперименты подтвердили, что IP3 может вызывать высвобождение Ca²⁺ непосредственно через INM (see below). Более того, patch-clamp запись с INM нейронов Пуркинье выявила присутствие InsP3R-активированных каналов (Marchenko et al., 2005). Но нет иммуногистохимических доказательств на уровне ЭМ локализации IP3R га INM. Необходимо отметить, чтто некоторые исследования описывают присутствие IP3Rна малых пузырьках внутри ядра, которые могут быть ответственны за мимолетный ядерный Ca²⁺ (Huh et al., 2006; Yoo et al., 2005). Отличаюатся ли эти пузырьки от инвагинаций NE пока неясно. Наконец, ryanodine receptors (RyRs) были непосредственно визуализованы с помощью BODIPY–Ry на NE ядер, изолированных из панкреатических клеток (Gerasimenko et al., 2003). Онни были также локализованы с помощью иммунногистохимических экспериментов с NE кардиальных клеток (Abrenica and Gilchrist, 2000) и в NE и нуклеоплазматическом ретикулуме миобластных клеток (Marius et al., 2006). Эти данные четко показывают, что NE многих типов клеток обладают всеми характеристиками хранилищ Ca²⁺, которые могут быть мобилизованы стимуляцией к высвобождению сигналов Ca²⁺ внутри или в тесной близости к ядру.

Production of IP3 in the NE

Канонический путь, который ведет к мобилизации внутриклеточного Ca²⁺ связан с активацией или рецепторов 7 раз пронизываюих мембрану или рецепторных тирозин киназ, которые индуцируют гидролиз phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PIP2) и продукцию IP3 (Berridge et al., 2003). Подвижность IP3, высвобождаемого из плазматической мембраны достаточна, чтобы мобилизовать Ca²⁺ из ER где-либо в цитоплазме, включая NE (Allbritton et al., 1992). Однако, различные компоненты сигнального каскада, ведущие к мобилизации Ca²⁺ , были обнаружены также в ядре. Phosphoinositides (как и энзимы, ответственные за их синтез, а именно, phosphatidylinositol и phosphatidylinositol 4-phosphate киназы) давно известно как присутствующие в ядре (for review, see Irvine, 2003). Тот факт, что эти ядерные inositol липиды противятся детергентам, указывает на то, что они расположены внутри ядра, возможно на структурах, наз. speckles, а в действительности не в NE. Но возможно, что инвагинации NE могут быть обогащены PIP2, так что они кажутся внутриядерными (Irvine, 2006). Разные изоформы phospholipase C (PLC) были идентифицированы в ядре и обеспечивать in situ продукцию IP3 и diacylglycerol. PLC-β в своем С-терминальном доене область, ответственную за ядерную локализацию (Cocco et al., 2006). PLC-β присутствует как в целых ядрах, так и в ядрах, обработанных детергентами, указывая тем самым, что она возможно не присутствует на NE (for review, see Visnjic and Banfic, 2007).

Если мы предположим, что локальная продукция IP3 в ядре мобилизует локально Ca²⁺, то всё же остается неясным, как PLC стимулируется. Несколько исследований описали транслокацию в ядро рецепторов ростовых факторов после стимуляции (for review, see Wells and Marti, 2002), но их роль в изменениях концентрации Ca²⁺ в ядре и реакции, обеспечиваемые ростовыми факторами, были исследованы только недавно. Напр., эксперименты, осуществленные на линии печеночных клеток, показали, что рецептор hepatocyte growth factor (HGF) , c-Met, быстро транслоцируется в ядро после стимуляции с HGF и появляется как на NE так и внутри ядра. c-Met-индуцированный ядерный сигнал Ca²⁺ зависит от гидролиза PIP2 и образования IP3 в ядре. Это отличается от сигнала Ca²⁺, индуцированного с помощью vasopressin, который зависит от формирования IP3 в цитоплазме (Gomes et al., 2008). Insulin также индуцирует осцилляции Ca²⁺ в гепатоцитах крыс и имеющиеся данные подтверждают, что рецептор инсулина транслоцируется в ядро, чтобы инициировать IP3-зависимый ядерный сигнал Ca²⁺ (Rodrigues et al., 2008). Различные с G-белком-связанные рецепторы, также были обнаружены в ядре в разных типах клеток (for review, see Gobeil et al., 2006). Напр., metabotropic глютаматовый рецептор, mGlu5R, был найден в ядре нейронов, а иммуногистохимические эксперименты с использованием конфокальной микроскопии или ЭМ подтвердили, что он локализован на мембране NE (O’Malley et al., 2003). Эксперименты, осуществленные на на клетках 293 эмбриональных почек человека, экспрессирующих мутантный рецептор mGlu5, приводили к потере связывания G-белка, указывая тем самым, что ядерный mGlu5 рецептор купируется с Gq/11 и PLC, чтобы генерировать IP3 и мобилизовать ядерный Ca²⁺ (Kumar et al., 2008). В интактных клетках внеклеточные лиганды, такие как глютамат или quisqualate достигают ядрерных рецепторов посредством как sodium-зависимых транспортеров, так и cystine glutamate обменников (Jong et al., 2005). Др. исследование на кардиомиоцитах показало, что типа 1 и 2 angiotensin рецепторы (AT1R and AT2R, соотв.) располагаются на ядерных мембранах. Применение angiotensin II к этим рецепторам увеличивает экспрессию мРНК ядерного фактора-kappa B mRNA, и стимуляцию AT1R, индуцируемую сигналом Ca²⁺ в изолированных ядрах посредством IP3R-обеспечиваемого механизма. Angiotensin II может быть продуцирован in situ в интактных кардиомиоцитах и может активровать этот внутриядерный путь (Tadevosyan et al., 2010).

Role of NE in nuclear Ca²⁺ signalling

Ядро отделяется от окружающей цитоплазмы с помощью NE, но два компартмента могут общаться посредством NPC. Общепризнано, что молекулы, крупнее 70 kDa не перераспределяются пассивно между ядром и цитоплазмой и поэтому нуждаются в наводящих последовательностях, которые будут транспортироваться через NPC с помощью облегченной диффузии или активного транспорта. Напротив, металлы ионов, малые метаболиты, и молекулы до 10 kDa в своей массе свободно обмениваются между цитоплазмой и ядром за счет пассивной диффузии через NPC (Torok, 2007). Проницаемость пор для белков промежуточного размера может регулироваться. Среди факторов, которые модулируют проницаемосять ядерных пор, ионы Ca²⁺ представляют особый интерес как в отношении концентрации цитозольного Ca²⁺ , так и количества Ca²⁺ в NE. Greber and Gerace (1995) впервые продемонстрировали для клеток млекопитающих, что истощение Ca²⁺ из NE ингибирует как сигналом-обоеспечиваемый транспорт белков в ядро, так и пассивную диффузию 10 kDa флюоресцентного dextran через NPC. Сходные эксперименты осуществили на интактных ядрах или ядернх мембранах ооцитов Xenopus laevi , демонстрируя. что истощение ядерных хранилищ Ca²⁺ регулирует перемещения 10 kDa молекул через NE (Stehnobittel et al., 1995b). Однако, измерения диффузии GFP через NE интактных клеток с помощью real-time imaging, показало, что она не затрагивается истощением околоядерных хранилищ Ca²⁺ (Wei et al., 2003). Недавнее исследование на клетках печени с использованием локальной двухфотонной активации photoactivatable GFP, демонстрируя. что гормоны, которые увеличивают концентрации цитозольного Ca²⁺ , увеличивают проницаемость ядерной мембраны (O’Brien et al., 2007). Эти и др. исследования иллюстрируют расхождения в роли Ca²⁺ на проницаемость NPC, они также показали, что как просветный, так и цитоплазматический Ca²⁺ может выполнять важную роль в регуляции переноса макромолекул между цитоплазной и нуклеоплазмой (for review and discussion see Bootman et al., 2009; Sarma and Yang, 2011). Это может указывать на механизм, который обеспечивает поступление факторов транскрипции или др. регуляторных молекул и регулирует транскрипцию генов в клетках мишенях. Общепризнанно, что Ca²⁺ может диффундировать свободно через NPC; однако, могут ли они регулироваться с помощью Ca²⁺ внутри NE вопрос споный (Gerasimenko and Gerasimenko, 2004). Регуляторная роль Ca²⁺, хранимого в просвете NE, ассоциирована с переключением конформации NPC , это может контролировать диффузию промежуточного размере молекул. Atomic force микроскопия показала, что происходит смещение центральных гранул на цитоплазматическую сторону NE в условиях истощения Ca²⁺ (Moore-Nichols et al., 2002; PerezTerzic et al., 1996; Stoffler et al., 2006).

Ионы Ca²⁺ д. также действовать непосредственно в нуклеоплазме и регулировать транскрипцию генов. Это малая молекула, которая, как полагают, свободно диффундирует через NPC, так что можно ожидать, чтоконцентрация Ca²⁺ в ядре быстро уравновешивается с цитозольной концентрацией Ca²⁺. В самом деле, исследования интактных клеток basophilic leukaemia (RBL) крыс (Allbritton et al., 1994) или нейронов (Eder and Bading, 2007; O’Malley, 1994) и изолированных ядер пчеени (Gerasimenko et al., 1995) демонстрирует, что сигнал Ca²⁺ из цитозоля в ядро не сильно задерживается с помощью NE. Следовательно, волны Ca²⁺, которые появлются в цитозоле стимулированной клетки могут распространяться в нуклеоплазму. Однако основной вопрос связан с проблемой наблюдаемых мимолетных вариаций Ca²⁺ в нуклеоплазме и могут ли они быть генерированы автономно и отличаться от цитозольных вариаций Ca²⁺. Несколько групп, используя флюоресцентные изобразения Ca²⁺ в живых клетках сообщали, что концентрации Ca²⁺ может быть обличны в цитозоле и ядре. Однако было установлено, что флюоресцентные индикаторы Ca²⁺ могут вести себя по-разному в ядре, т.к. они более яркие в ядре, чем в цитозоле. И связывание Ca²⁺ с зондом и динамический диапазон индикатора могут быть затронуты. Это ветед к техническим артефактам, что ведет к неправильной интерпретации данных и к спору относительно регуляции концентраций Ca²⁺ в ядре (for discussion see Bootman et al., 2009).

Несколько экспериментальных подходов было использовано для изучения ядерных сигналов Ca²⁺, таких как кинетический анализ временных вариаций Ca²⁺ в цитоплазме и нуклеоплазме, и прямые манипуляции цитоплазматическим и нуклеоплазматическим содержанием Ca²⁺ в интктных клетках. Некоторые исследования показали, что сигнал Ca²⁺ может возникать в ядре (Figure 2). Стимуляция печеночных HepG2 клеток субмаксимальными концентрациями АТФ показала, что сигнал Ca²⁺ возникает раньше и сильнее в ядре. чем в цитозоле. Это подтверждено фотовысвобождением IP3 внутри клеток, это показывает, что ядерные IP3R каналы более чувствительны к IP3, чем цитоплазматические IP3R, и это коррелирует с более высокой чувствительностью типа 2 IP3R, присутствующих в NE (Leite et al., 2003). Избирательные измерения изменений Ca²⁺ в цитозоле или ядре с помощью целенаправленного aequorin в GH3 клетках гипофиза показали, что IP3-индуцированная ядерная реакция не ингибируется добавлением цитозольного heparin, который не проникает через ядерные поры. Более того, ядерный Ca²⁺ реагирует на IP3, обнаруживая более высокую чувствительность и снова это коррелировало с присутствием IP3R2 в ядре (Chamero et al., 2008). В функциональных экспериментах с изолированными ядрами печени, IP3 или cyclic ADP ribose вызывает увеличение Ca²⁺ внутри ядра (Gerasimenko et al., 1995). Сходным образом, в изолированных ацинарных панкреатических ядрах nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate, cyclic ADP ribose или IP3 снижали концентрацию Ca²⁺ внутри NE и это ассоциировало с временным повышением Ca²⁺ в нуклеоплазме (Gerasimenko et al., 2003).

Figure 2. Summary of the different mechanisms that regulate nuclear Ca²⁺ concentration

Кардиомиоциты вызывают особый интерес, поскольку Ca²⁺-зависимые сигнальные пути регулируются в условиях постоянных временных вариаций Ca²⁺, которые обусловливаеют кардиальные сокращения во время каждого сердцебиения (Molkentin, 2006). Стимуляция вентрикулярных миоцитов с помощью endothelin 1, который продуцирует внутриклеточный IP3, вызывает локальные высвобождения Ca²⁺ из NE посредством IP3R, и снова эти данные коррелируют с присутствием типа 2 IP3R на NE. Такое локальное высвобождение Ca²⁺ запускает фосфорилирование histone deacetylase 5 и ядерный экспорт, который не происходит во время глобальных временных вариаций Ca²⁺ во время каждого сердцебиения (Wu et al., 2006). Участие индуцируемого с помощью IP3 высвобождения Ca²⁺ в ядерных временных вариациях Ca²⁺ подтверждено прямым добавлением IP3, чтобы сделать проницаемыми кардиомиоциты, это увеличивало Ca²⁺ в ядре (Zima et al., 2007). Непосредственное мечение Ca²⁺ в просвете NE показало, что он мобилизируется, чтобы повысить концентрацию Ca²⁺ в нуклеоплазме. Эксперименты, осуществленные на изолированных ядрах также продемонстрировали, что InsP3 индуцирует высвобождение Ca²⁺ из NE и делает возможным возникновение всплесков Ca²⁺ в нуклеоплазме (Zima et al., 2007). Сходные результаты были получены в электрически стимулированных артериальных миоцитах, где добавление endothelin 1 вызывало увеличение ядерного Ca²⁺, эффект обеспечивался продукцией IP3 и активацией IP3R (Kockskamper et al., 2008). Подъем концентрации ядерного Ca²⁺, индуцированный endothelin 1 в кардиомиоцитах, использует путь, ведущий к кардиальной гипетрофии (Higazi et al., 2009).

Известно, что Ca²⁺ , высвобождаемый из NE, участвует в генезе и регуляции всплесков Ca²⁺ в нуклеоплазме. Однако основное противоречие связано с ориентацией притока Ca²⁺ из NE. Ca²⁺ может быть высвобожден непосредственно в нуклеоплазму посредством INM или высвобожден в цитоплазму, а затем проникнуть в ядро через NPC. Одним из подходов для выяснения, высвобождается ли Ca²⁺ непосредственно в нулеоплазму, это воздействие IP3 или антагонистов IP3 на цитоплазму или нуклеоплазму и учет эффектов на цитоплазматические или нуклеоплазматические всплески Ca²⁺. Эти подходы дали противоречивые результаты, возможрно из-за типа клеток, испобльзованных в экспериментах или геометрии ядра [see below]. В экспериментах, проведенных на клетках RBL, стимулированных с помощью IP3-генерируемого агониста, инъекции heparin–dextran, ингибитора IP3R, который исключен из ядра, супрессировали всплески Ca²⁺ в цитозоле и в ядре, указывая, что ядерный Ca²⁺ увеличивается за счет цитозольного увеличения Ca²⁺ (Allbritton et al., 1994). Но др. эксерименты, проведенные на интактных клетках приввели к др. заключению. Так. инъекция heparin в ядро HeLa клеток устраняли увеличение Ca²⁺, вызыванное histamine, при этом наблюдалось увеличение цитозольного Ca²⁺ (Lui et al., 1998a). Инъекция IP3 в ядро ооцитов Xenopus вызывало увеличение Ca²⁺ в ядре, даже если heparin присутствовал в цитозоле (Hennager et al., 1995). Более того, наблюдения всплеска Ca²⁺ в изолированных ядрах указывает на то, что Ca²⁺ непосредственно высвобождается из просвета NE в нуклеоплазму, поскольку предполагается, что Ca²⁺, высвобождаемый в мнкубационную среду, д. немедленно диффундировать и расстворяться далеко от ядра (Gerasimenko et al., 2003; Gerasimenko et al., 1995; Zima et al., 2007). Сегодня существует определенный консенсус, что Ca²⁺ может высвобождаться ственно из просвета NE в нуклеоплазму посредством INM, наиболее вероятно посредством IP3R или в некоторых случаях посредством RyR. Необходимо отметить, что малые пузырьки были описаны внутри нуклеоплазмы, которые могут накапливать Ca²⁺ и высвобождать его в присутствии IP3 (Yoo et al., 2005). Эти предполагаемые хранилища Ca²⁺ в нуклеоплазме могут также участвовать в некоторых типах клеток в генезе ядерных Ca²⁺ сигналов и участвовать в физиологических реакциях в интактных клетках. Весь аппарат, необходимый для локальной продукции IP3 внутри нуклеоплазмы, находится в ядре. Он может индуцировать высвобождение Ca²⁺ через INM или нуклеоплазматические пузырьки, если мы предположим, что стимулы (гормоны или агонисты) могут достигать ядра в виде комплексов с мембранным рецептором путем эндоцитоза или локальной внутриклеточной продцкции.

Присутствие IP3R на ONM документировано лучше всего (see above), но его участие в регуляции концентрации ядерного Ca²⁺ трудно отделить от роли IP3R на ER в тесной близи к ядерной мембране. Тщательный анализ субклеточного происхождения сигналов Ca²⁺ в Fluo-3-нагруженных клетках HeLa, указывает на то, что все сигналы, которые увеличивают концентрацию ядерного Ca²⁺ цитоплазматического происхождения. Всплески Ca²⁺, которые возникают в течение 2–3 mm в околоядерной зоне распространяются анизотропно вдоль всего ядра. Более того, низкая способность к буфферизации ядра делает возможной существенную пролонгацию сигнала Ca²⁺ в ядре по сравнению с малым цитозольным сиогналом (Lipp et al., 1997). В этом случае можно предположить, что Ca²⁺, высвобождаемый посредством IP3R в направлении цитозоля, д. диффундировать в нуклеоплазму посредством соседних NPC, а отсутствие механизма поглощения Ca²⁺ в ядре позволяет Ca²⁺ быстро диффундировать по всей нуклеоплазме (Lipp et al., 1997). Некоторые исследования согласуюстя с этой моделью. Так. прямая инъекция IP3 в ядро ооцита хомячка в тесной близи к INM не индуцирует высвобождения Ca²⁺, но если IP3 униформно воздействует на цитоплазму, то инициируется увеличение Ca²⁺ в околоядерной цитоплазме и затем в нуклеоплазме. Было сделано заключение, что увеличение концентрации Ca²⁺ в нуклеоплазме является следствием высвобождения Ca²⁺ в околоядерную цитоплазму и диффузию через NPC. Соотв., кластеры ER расположены в околоядерной цитоплазме и служат в качестве триггерной зоны для IP3-индуцированного высвобождения Ca²⁺ и распространения его в нуклеоплазму (Shirakawa and Miyazaki, 1996). В неонатальных миоцитах, phenylephrine- или IP3-возбуждаемые волны Ca²⁺ захватывают всё ядро без распространения в большую часть цитозоля (Luo et al., 2008). IP3R , расположенные на ONM, могут быть активированы с помощью IP3, продуцируемого на плазматической мембране в присутствии агонистов. Этот путь может быть облегчен с помощью структуры клетки, напр., в кардиальных миоцитах IP3R присутствует на ONM в тесной близости к T канальцам (скорее всего являющихся источником IP3) и парам, содержащим RyR2, это может создавать локальные околоядерные микродомены Ca²⁺ и активировать IP3R (Escobar et al., 2011). Интересно отметить, что в некоторых типах клеток NPC обнаружены также в ER субдомене, известном как annulate lamellae. Недавно было установлено, что активность IP3R снижается в annulate lamellae, а смягчение этого ингибирования коррелирует с демонтажом NPC в этом ER субдомене (Boulware and Marchant, 2008). Бывло бы интересно исследовать, могут ли NPC регулировать также приток Ca²⁺ и активностть IP3R в NE.

Influence of the geometry of the nucleus

Геометрия ядра может участвовать в генезе и формировании паттерна сигнала ядерного Ca²⁺. Мы наблюдали выше. что инвагинации двойной мембраны NE формируют хранилища Ca²⁺ глубоко внутри ядра в тесной близости к хроматину. Они увеличивают ядерную поверхность и количество NPC и могут поэтому облегчать обмен между цитоплазмой и ядром. Wittmann et al. [2009] использовали подход с математическим моделированием, которые выявил, что подразделение ядра на компартменты неравных размеров за счет инвагинаций может выполнять функцию микродоменов, которые генерируют отличающиеся сигналы Ca²⁺. Предполагается, что ядерные инвагинации уменьшают диффузионные состояния, Ca²⁺ достигает центральных сайтов быстрее и исчезает более быстро. Это означает, что “nuclear inertia” снижается за счет впячиваний мембраны (Queisser et al., 2011). И моделирование и экспериментальные подходы к нейронам гиппокампа показывают, что ядерные всплески Ca²⁺ , вызываемые всплесками цитозольного Ca²⁺ являются более крупными в малых компартментах ядра, чем в более крупных компартментах того же самого ядра. Более того, информационная частота сигнала Ca²⁺ сохраняется и разрешается лучше в малых компартментах, инвагинированных в ядра. Авт. продемонсрировали, что присутствие ядерных инвагинаций коррелирует с событиями, связанными с транскрипцией, поскольку синаптической активностью индуцированное фосфорилирование гистона H3 по serine 10 более мощное в ядрах нейронов с инвагинациями, чем нейронах, ядра которых почти сферические (Wittmann et al., 2009). Эта работа подчеркивает роль геометрии ядер нейронов в передаче сигналов Ca²⁺ и в активации событий, регулирующих транскрипцию. Образование ядерных инвагинаций в синаптически активных нейронах обеспечивает структурную пластичность, которая может позволить адаптацию к метаболическим состояниям, связанными с регуляцией экспрессии генов.

В предыдущем примере инвагинации NE пассивно регулируют сигнал Ca²⁺, генерируемый в цитозоле, они могут также непосредственно участвовать в генезе всплесков Ca²⁺ в ядре. В клетках HeLa, инвагинации NE определяют распространение цитозоля внутрь ядра, где Ca²⁺ может быть высвобожден или транспротирован после стимуляции ionomycin (Lui et al., 1998b). Это демонстрирует, что нуклеоплазматический ретикулум является хранилищем Ca²⁺. Недавно, IP3-3-kinase-B была обнаружена вместе с IP3R, в ядерных инвагинациях клеток линии легочной крациномы и она могла модулировать концентрацию IP3 локально внутри ядра (Nalaskowski et al., 2011).

Роль нуклеоплазматического ретикулума в передаче сигналов Ca²⁺ бвла охарактеризована в экспериментах, осуществленных с линией печеночных клеток Echevarria et al. [2003], которые продемонстрировали, что сеть внутриядерных разветвлений, которая продолжается в ER и NE соддержт calreticulin, IP3R и активность по сохранению Ca²⁺. Стимуляция клеток с помощью HGF преимущественно индуцирует сигналы ядерного Ca²⁺. Более того, локальное фотовысвобождение небольших количеств IP3 приводит к небольшому увеличению Ca²⁺, которое начинается вблизи этого нуклеоплазматического ретикулума. Эти авт. показали также, что высвобождение Ca²⁺ в ядре заставляет ядерную protein kinase C транслоцироваться в NE, демонстрируя специфический эффект локальных сигналов ядерного Ca²⁺.

Мы подчеркивали выше вопрос. связанный с направлением высвобождения Ca²⁺ из NE, или прямо в нуклеоплазму или в цитоплазму и диффузию через NPC. Присутствие инвагинаций NE может облегчать диффузию Ca²⁺ из цитоплазмы в нуклеоплазму. Ограниченные мембранами каналы идентичны ONM и тем самым вычленяет определенное цитозольное пространство в глубоких частях ядра. Brasen et al. [2010] подсчитали, что складкообразные поверхности клеток предоставляют механизм генерации микродоеменов, где концентрации Ca²⁺ могут быть значительно выше, чем в остальной массе цитозоля, а длинные узкие мембранные углубления будут наиболее эффективными в генерации таких микродоменов с высоким содержанием Ca²⁺. ONM выстилка тубул скорее всего содержит IP3R, который может высвобождать ионы Ca²⁺ в направлении цитозоля внутри узких углулбений, формируемых инвагинациями NE. Это д. приводить к локальным высоким концентрациям свободного Ca²⁺, чья диффузия в остальную часть цитозоля ограничена. Ca²⁺ сохраняемый в этом ограниченном пространстве цитоплазмы может диффундировать в нуклеоплазму более легко, через ядерные поры, выявленные в инвагинациях с помощью ЭМ (Figure 2).

Differences between the NE and the peripheral ER

NE часто представляется в качестве субдомена ER , а периферический ER описывается как расширенная сеть, которая ответвляется от NE. Каковы же роли NE и периферического ER в передаче сигналов Ca²⁺. Белковый состав ONM в основном сходен с таковым периферического ER независимо от различий, которые могут характеризовать специализированные субдомены ER. Основными различиями в составе белков периферического ER и NE связаны с INM. которая содержит свои собственные белковые компоненты и выстилается ламиной, богатой промежуточными филаментами. В частности, NE пронизана NPC, которые регулируют транспорт молекул между цитоплазмой и нуклеоплазмой. Как мы видели выше, Ca²⁺ обслуживающие белки равномерно распределены в периферическом ER и в NE; это делает возможным накопление Ca²⁺ в одиночном пространстве просвета и высвобождение Ca²⁺ в цитоплазму и нуклеоплазму. Важным различием между двумя структурами является их пространственная организация. Периферический ER состоит из динамической сети мембранных слоев и взаимосвязанных тубул, а NE формирует мембранные слои вокруг хроматина и ядерных ламин. Это сказывается на участии в механизмах передачи клеточных сигналов.

Периферический ER является сетью, которая расширяется внутрь цитозоля и покрывает каждую часть клетки. Эта ER сеть стабилизируется частично путем взаимодействий с клеточными органеллами, такими как митохондрии, Гольджи, эндосомы или плазматическая мембрана. Тесное соседство ER мембран с др.клеточными мембранами важно для обмена липидами между органеллами. other cell membranes are important for interorganelle exchanges of lipids. Эти взаимодействия также играют важную роль в передаче сигналов Ca²⁺. Белковые комплексы, включая IP3 рецептор, активно исследовались в последнее время и это позволило выявить соединение митохондрий и ER и перенос Ca²⁺ в митохондрии (de Brito and Scorrano, 2010). Тем же самым способом взаимодействия ER с плазматической мембраной были описаны в эпителиальных клетках, где IP3R концентрируются вблизи апикального домена плазматичекой мембраны (Vermassen et al., 2004). ER белки STIM ощущают снижение концентрации в ER Ca²⁺ и активируют ORAI Ca²⁺ канал плазматической мембраны через соединения между двумя мембранами (Shen et al., 2011). Эти локальные взаимодействия периферического ER согласуются с тем фактом, что он постоянно перестраивается и перемещается вдоль микротрубочек, напоминая осьминога, который распространяет свои щупальцы внутри цитозоля и реглуирует локально приток Ca²⁺.

NE, хотя и является продолжением периферического ER, выполняет дополнительную роль, т.к. она разделяет два клеточных компартмента, цитоплазму и ядро, и поэтому играет статическую роль. Она регулирует перенос молекул, включая Ca²⁺, между цитоплазмой и ядром и является хранилищем Ca²⁺, это позволяет высвобождать Ca²⁺ в нуклеоплазму. Динамика NE ограничена образованием впячиваний, которые увеличивают поверхность обмена между цитоплазмой и нуклеоплазмой. Инвагинации NE модулируют перенос сигнала Ca²⁺ из цитоплазмы в ядро и делают возможным высвобождение Ca²⁺ глубоко вблизи хроматина.

Conclusion

Over recent years, it has become more and more evident that nuclear Ca²⁺ signals can specifically influence gene transcription and cell-cycle progression. At the molecular level, all the components constituting the Ca²⁺ signalling cascade (from the hormone receptor to the Ca²⁺ release channels) have been found in the nucleus. The NE plays a major role by integrating all the molecules that constitute a Ca²⁺ store and allows the local release of Ca²⁺ when stimulated by Ca²⁺-mobilising agents such as IP3, also produced locally. All this machinery suggests that Ca²⁺ signalling in the nucleus can be independent of cytosolic variations even if the mechanisms involved are not yet clearly established. On the contrary, the global cytosolic Ca²⁺ signals can be easily transmitted to the nucleoplasm through the NPCs, which are freely permeable to small molecules such as calcium ions. The exchanges between the cytoplasm and the nucleoplasm depend on the area of exchange and the number of NPCs and these two features are increased in some cell types and under some physiological conditions by the formation of invaginations of the NE. These structures, recently called nucleoplasmic reticulum, have long been observed, but very interesting recent data suggest that they could play important roles in nuclear functions. The nucleoplasmic reticulum allows the delivery of Ca²⁺ locally deep inside the nucleus. It also forms separate compartments of varying sizes within the nucleoplasm and could therefore determine whether the nucleus functions as an integrator or a detector of oscillating Ca²⁺ signals (Queisser et al., 2011). Until now we have described the generation of Ca²⁺ microdomains by considering their different subcellular location and how each organelle has its own distinct Ca²⁺-handling properties. A future challenge will be to characterise the signalling pathways and/or the physiological conditions that regulate the formation of the nucleoplasmic reticulum and modify the geometry of the nucleus. These regulatory mechanisms more likely participate in the pattern of the Ca²⁺ signal and possibly in other nuclear processes. The morphology regulation of the Ca²⁺ signal described in the nucleus could be extended to the Ca²⁺ dynamics in the entire cells (Queisser et al., 2011). In this way, the manipulation of the cell shape and microenvironment by the micropatterning techniques could be of considerable help (Thery, 2010). Modification of the morphology of the organelles such as the nucleus can modulate Ca²⁺ signals and this opens up new ways to describe the generation and propagation of Ca²⁺ signals at the nuclear level and, possibly, at the level of the entire cell.

Role of the nuclear envelope in calcium signalling Jean-Pierre Mauger Biology of the Cell Volume 104, Issue 2, pages 70–83, February 2012

Role of the nuclear envelope in calcium signalling
Jean-Pierre Mauger
Biology of the Cell Volume 104, Issue 2, pages 70–83, February 2012