В данном исследовании мы показали, что экспрессия Rhox6 регулируется во времени во время дифференцировки PGC-подобных клеток в EBs, происходящих из ESCs самцов мышей и что непрерывный нокдаун экспрессии Rhox6 нарушает процесс дифференцировки PGC-подобных клеток. Поэтому было предположено, что Rhox6 необходим для детерминации клона зародышевых клеток.

У развивающихся эмбрионов, Oct3/4 экспрессируется у преимплантационных эмбрионов во внутренней клеточной массе бластоциста, в эпибласте и зародышевой линии, это управляется с помощью его регуляторной последовательности (Yeom et al., 1996). Следовательно, как экспрессия Oct3/4, так и использование его регуляторной последовательности, являются ценными инструментами для мониторинга недифференцированного состояния ESCs (Walker et al., 2007; Chowdhury et al., 2010; Li et al., 2011) , а также дифференцировки зародышевых клеток (Yoshimizu et al., 1999; Geijsen et al., 2004; Young et al., 2010).

C др. стороны, формирование EBs воспроизводит процесс гаструляции у эмбрионов. Однако, клеточная дифференцировка в EBs обычно базируется на абсолютно случайных событиях. Чтобы увеличить выход интересующих типов клеток, часто используют генетически модифицированные линии ESC, в которых репортер, такой как EGFP, экспрессируется под действием регуляторной последовательности генетического маркера, специфичного для интересующего типа клеток. Затем, базируясь на экспрессии EGFP, интересующие дифференцированные типы клеток могут быть отсортированы от рассоединенных EBs (e.g. Nicholas et al., 2009). В данном исследовании мы использовали установленный протокол для индукции дифференцировки PGCs из ESCs (Geijsen et al., 2004). Посредством OGR1 ESC линии мы оказались способны воспроизвести процесс дифференцировки PGC in vitro, что демонстрировалось с помощью экспрессии EGFP , а также профиля экспрессии PGC маркеров. включая Oct3/4 (Figs. 1 and 2). Хотя исследованные PGC маркеры экспрессировались также в ESCs, эти маркеры не экспрессировались постоянно, а обнаруживали подавление активности после усиления активности во время образования EB (Fig. 2). Кроме того, EBs были культивированы в отсутствие LIF в течение, по крайней мере, 10 дней. Следовательно, очень вероятно, что большинство Oct3/4-позитивных клеток в EBs не остается недифференцированными ESCs, а дифференцируются в PGCs.

Данные, полученные в этом исследовании продемонстрировали, что Rhox6 экспрессируется в недифференцированных ESCs, происходящими из внутренней клеточной массы бластоциста. Мы установили, что экспрессируя Rhox6 регулируется во времени в ходе процесса дифференцировки PGC в EBs (Fig. 2A) и достигает своего максимального уровня на 6-й день после образования EB (Fig. 2B).

Базируясь на исследовании меток метилирования ДНК на по-разному метилированных регионах Igfr и H19 локусов , PGC-подобные клетки в EBs полностью теряли своё метилирование на 7-й день (Geijsen et al., 2004). В развивающихся эмбрионах очищение от метилирования ДНК родительского происхождения в PGCs происходит приблизительно на 10.5 день эмбриогенеза (Е) и заканчивается на E13.5 (Yamazaki et al., 2003). Т.о., PGC-подобные клетки дифференцируются в EBs на 7-й день и подобны постмиграторным PGCs у развивающихся эмбрионов. Экспрессия Rhox6 соответственно обнаруживается в гонадах самцов у E10.5 эмбрионов и достигает своего максимального уровня в постмиграторных PGCs E11.5 эмбрионов (Takasaki et al., 2000).

Мы показали, что конституитивный нокдаун Rhox6 существенно ингибирует дифференцировку PGC-подбных клеток в EBs (Fig. 4C). Эти данные показывают, что Rhox6 необходим для детерминации клона зародышевых клеток и экспрессируется в дифференцирующихся PGCs эмбрионов. Каждая линия ESC, выделенная в этом исследовании обладает отличающимися уровнями нокдауна или избыточной экспрессии Rhox6. Следовательно, будучи внесенными в бластоцисты хозяина в будущем исследовании, они смогут служить прекрасным инструментом для определения эффекта количественной экспрессии Rhox6 на детерминацию и дифференцировку PGC. Однако остается неясным, экспрессируется ли Rhox6 в PGCs на ст. E9.5 или раньше, когда происходит становление зародышевой линии у развивающихся эмбрионов. Обнаружение Rhox6 у эмбрионов на ст. E9.5 или более ранних стадиях довольно затруднительно из-за трудности получения зонда или антител, специфических к Rhox6 из-за высокого сходства его последовательностей с Rhox9. Вообще-то будущие исследования с использованием эмбрионов, которые экспрессируют EGFP, управляемым промотором Oct3/4, окажутся способны действительно определить полный профиль экспрессии Rhox6 в PGCs на разных стадиях путем выделения PGCs, исходя из экспрессии EGFP.

Согласно данным. полученным в этом исследовании избыточная экспрессия Rhox6 вызывает незначительные, если вообще вызывает, эффекты на дифференцировку PGC (Fig. 3D). У мышей детерминация зародышевой линии инициируется путем индукции сигнала от внеэмбриональной эктодермы к эпибласту на ст. E7.2 (Yoshimizu et al., 2001). В частности, этим сигналом является Bone morpho- genetic protein 4 (Bmp4) (Lawson et al., 1999; Ohinata et al., 2009). Следовательно, дифференцировка PGC является скорее пассивным процессом у мышей, так что Rhox6 может не играть роли в автономном предопределении судьбы ESCs к формированию PGCs. Однако поскольку OGR1 клоны, исследованные в наших экспериментах, были изолированы в соответствии с появлением недифференцированных ESCs, то это может приводить к обогащению клонов, в которых уровни экспрессии Rhox6 выше не более, чем в три раза по сравнению с негативным контролем. Несмотря на это мы не наблюдали каких-либо специфических отличий в получении колоний с появлением дифференцированных клеток после электропортации в ESCs или Rhox6 или DsRedT3 трансгенов. Кроме того, трансгены, кодирующие Oct3/4, Gata6 и Cdx2 вносили в ESCs в отдельных экспериментах, чья экспрессия управлялась CAG промотором. Активация этих генов, как известно, индуцирует дифференцировку или примитивной энтодермы (Niwa et al., 2000; Fujikura et al., 2002) или трофобластов (Niwa et al., 2005). Как и ожидалось, мы оказались способны воспроизвести индуцированную дифференцировку ESCs (data not shown). Хотя мы не измеряли уровни транскриптов или белков от трансгенов в этих экспериментах, логические выводы привели нас к заключению, что эти трансгены достигают сходных уровней активности в ESCs , что и Rhox6 трансген. Хотя уровень экспрессии Rhox6 трансгена может быть увеличен при использовании др. систем, но Rhox6, по-видимому, не играет существенной роли в прямой индукции дифференцировки PGC.