Кстати, in vivo происходящие транскриптомы мужских и женских PGCs были получены от мышей, у которых идентификация и выделение таких клеток легче с использованием промоторных последовательностей маркеров PGCs-клонов, таких как Oct4, Blimp1 и Prdm14 (Sabour et al., 2011; Saitou, 2009). Чтобы устранить этот недостаток в качестве моделей in vitro использовали как людские, так и мышиные (Hubner et al., 2003; Toyooka et al., 2003; Geijsen et al., 2004; Kee et al., 2006; Nagano, 2007; Qing et al., 2007; Wei et al., 2008; Hayashi et al., 2011; Panula et al., 2011) плюрипотентные стволовые клетки, базируясь на эмбриональных и индуцированных стволовых клетках. Хотя дифференцировка человеческих ESCs и iPSCs в PGCs-подобные клетки осуществлялась у мышей (Geijsen et al., 2004; Kee et al., 2006; Panula et al., 2011) анализ транскриптома получаемых PGCs был ограничен известными PGCs-специфичными генами, такими как BLIMP1/PRDM1, c-KIT STELLA/DPPA3, VASA/DDX4 и FRAGILIS/IFITM5. Отсутствие геномного анализа транскриптома этих человеческих, происходящих из ESCs- и iPSCs-, PGCs в дальнейшем будет мешать глубокому пониманию и анализу ключевых механизмов, лежащих в основе сложных биологических процессов развития зародышевых клеток и последующего гаметогенеза человека.

В попытке преодолеть некоторые из упомянутых выше недостатки, связанные с современными in vitro моделями PGCs человека, мы осуществили в данном исследовании обширный, базирующийся на транскриптоме, сравнительный анализ молекулярного портрета SMART-сгенерированных, сцепленных с T7 промотором двунитчатых выборок кДНК, происходящих от 4 неоплодотворенных ооцитов, 200 mPGCs и 500 fPGCs полученных ранее (Adjaye et al., 1999; Goto et al., 1999). Для обогащения транскриптов, экспрессируемых в женских зародышевых клетках, мы включали mPGCs, исключив Y-сцепленные гены. Подтверждением успешности такого подхода с вычитанием является обнаружение экспрессии ZFY исключительно в mPGCs и Zona Pellucida генов ZP4 как в fPGCs, так и ооцитах, тогда как ZP1 и ZP3 обнаруживались только в ооцитах (Supplementary Table 1).

Среди хорошо охарактеризованных PGCs-специфических генов мы выявили, напр., экспрессию BLIMP1/PRDM1 и PIWIL2 только в fPGCs и mPGCs клетках, VASA/DDX4 в fPGCs и ооцитах, DAZL и STELLA/DPPA3 только в ооцитах (Supplementary Table 1). Интересно, что LIN28A экспрессируется во всех типах клеток и , как было установлено, на мышах Lin28, негативный регеулятор Let-7, является важным для развития PGCs и ассоциирует также с озлокачествлением зародышевых клеток (Rybak et al., 2008; West et al., 2009).

BMP передача сигналов, как было установлено, важны для спецификации PGCs (Ying et al., 2000; Ying and Zhao, 2001; Pesce et al., 2002) и это согласуется с обнаржужением нами экспрессии BMP2, 3, 4, 6, 7 и GDF1, 2, 3, 9 и 15 и рецепторов BMPR1A и BMPR2 (Supplementary Table 1).

Наблюдаемые изменчивые паттерны экспрессии, напр., VASA/DDX4 в fPGCs и ооцитах, DAZL и STELLA/DPPA3 в ооцитах могут быть объяснены тем, что PCR-based SMART-generated T7 promoter-linked double-stranded cDNA выборки сделаны из ограниченного количества клеток (4 unfertilized oocytes, 200 mPGCs and 500 fPGCs). Несмотря на это наш подход впервые позволил сделать снимок транскриптома этих редких клеток человека.

Сравнение транскриптомов fPGCs человека с транскриптомами PGCs, выделенными из мышиных эмбрионов на соотв. стадиях (E11.5 – E18.5) развития (Sabour et al., 2011) привело к идентификации 1632 мышиных генов ортологов с идентифицированными одинаковыми нуклеотидами внутри кодирующих регионов в пределах 100 – 22%. Наивысшее количество перекрывающихся генов было с транскриптомами от мышей на ст. E14.5 mice (Fig. 3), значение этого пока неизвестно. Более того, из 11 генов, идентифицировнных Sabour et al., как экспрессируемых исключтельно в мужских и женских PGCs как in vitro, так и in vivo, но не вESCs, мы идентифицировали 4 из них (4930432K21Rik, Mov10l1, Tex13, Hba-a1), как экспрессирующиеся в человеческих fPGCs, подтвердив тем самым качественность нашей базы данных, что подчеркивает консервацию ключевых генов, ассоциированных с PGCs и потенциально участвующих в развитии и спецификации PGCs у обоих видов.

Исходя из транскриптомных данных мы сможем ассоциировать экспрессируемые гены с сигнальными путями. Напр., мы идентифицировали ключевые сигнальные пути, такие как mTOR, WNT/β-catenin, ERK/MAPK, PI3K/AKT, эстрогенового рецептора и андрогенного рецептора, регуляции клеточного цикла с помощью белков семейства BTG, Rac, CDK5, Actin cytoskeleton, Ephrin B и передачу сигналов в соединениях зародышевые клетки-клетки Sertoli, как активные в fPGCs и ооцитах.

Цитологический анализ у мышей и человека подтвердил, что и женские и мужские PGCs в равной степени способны вступать в мейоз (12 dpc у мышей и 10 неделя у человека) и что выбор клеточной судьбы зародышевыми клетками, выбор между вступлением в мейоз или митоз происходит в гонадах (McLaren and Southee, 1997; Suzuki and Saga, 2008; Bowles and Koopman, 2010). Пока ещё неизвестно и спорно, вызывается ли вступление в мейоз в гонадами самок или это изначально запрограммировано в PGCs самоцов и самок и ингибируется в гонадах самцов и разрешается в гонадах самок, или это обусловлено комбинацией регуляторных факторов. В самом деле, мы наблюдали дифференциальную экспрессию транскрипционных факторов хозяина (напр., zinc finger containing transcription factors-ZNFs) в fPGCs и mPGCs, в качестве потенциальных регуляторов процесса принятия этих решений (Supplementary Table 1).

Более того, наблюдалась экспрессия некоторых генов, ассоциированных с компонентами мейотического аппарата, напр., синаптонемального комплекса (SYCP2, SYCP3, TEX11, TEX13B, TEX15), специфичных для мейоза cohesins (SMC1B, STAG3), аппарата мейотической рекомбинации (DMC1, MSH4, TRIP13), piRNA пути (PIWIL2, TDRD1, MAEL) и др. ассоциированных с мейозом генов (HSPA4L, HSF2BP, HORMAD2, INTS6, CREBL2, ATF7IP2, MTL5, ZFP473) (Su et al., 2011). Напротив в mPGCs мы выявили экспрессию NODAL, который, как было установлено, на мышах осуществляет аутокринную сигнальную роль во время спецификации мужских PGCs (Souquet et al., 2012).

Неожиданным наблюдением в нешем исследовании стала экспрессия большого количества генов, кодирующих обонятельные рецепторы в fPGCs, mPGCs и неоплодотворенных ооцитах (Table 4). Обонятельные рецепторы (ORs) , которые являются G-protein-coupled receptors (GPCR) имеют 7-трансмембранных доменов как у многих нейротрансмиттеров и гормональных рецепторов и ответственны за распознавание и за G белком обеспечиваемую трансдукцию сигналов от пахучих веществ. В более раннем исследовании с использованием тех же fPGCs и mPGCs мРНК (differential display based-analyses) , что использовались и в данном исследовании, мы идентифицировали OR-ктдирующие гены, экспрессируемые в mPGCs клетках (Goto et al., 1999). Хотя OR-кодирующие гены уже были выявлены в mPGCs, обнаружение их экспрессии в fPGCs и ооцитах в данном исследовании не является артефактом, т.к. недавно было показано, что широко распространена экспрессия генов, связанных с обонянием в тканях столь несходных, как семенники, мышцы, печень и кожа, хотя некоторые из них могут быть псевдогенами (Feldmesser et al., 2006). Из 164 экспрессируемых OR-кодирующих генов, OR10J1, OR11A1, OR1D2, OR52K1 и OR7A17 были выявлены, как экспрессирующиеся в семенниках человека (Feldmesser et al., 2006) из них только OR10J1 был выявлен как экспрессируемый в mPGCs (Parmentier et al., 1992). Кроме того, из 164 OR-кодирующих генов человека гены дифференциально экспрессировались в mPGCs, fPGCs и ооцитах, нами идентифицированы 33 мышиных ортолога (напр., OR51M1/Olfr78, OR4D11/Olfr1423 and OR1B1/Olfr362) выделены красным (Table 4). Хотя и неожиданно, но это первое описание большого количества OR-кодирующих генов, обнаруживающих существенное перекрывание и характерные паттерны экспрессии в необлодотворенных ооцитах человека, мужских и женских PGCs на 10-й неделе беременности. Базируясь на наших находках, выдвигается гипотеза, что гены, кодирующие OR, участвуют в хемотаксисе спермиев.

In summary, we anticipate that our current dataset will provide insights into the design of more extensive functional studies that might increase our meagre knowledge of the genes and associated signaling pathways operative during germ cell development and hence in turn lead to the development of strategies enabling better differentiation and molecular characterisation of germ cells derived from either ESCs or iPSCs. Ultimately, this would have a profound relevance to reproductive as well as regenerative medicine.