Во время развития сердца некоторые пулы кардиальных предшественников дают разные клеточные клоны, такие как кардиомиоциты, гладкомышечные клетки кровеносных сосудов, фибробласты, которые образуют соединительную ткань и эндотелиальные клетки эндокарда (rev. Brand,2003; Vincent and Buckingham,2010). Чтобы во время развития сердца возникали корректная форма и функция, дифференцировка этих клонов клеток д. тонко контролироваться c помощью кардиальных морфогенетических событий, таких как образование петли сердечной трубкой, образование перегородок и трабекуляция. Существенная часть такого контроля это уровень регуляции транскрипции, а сеть кардиальных транскрипционных факторов,как было установлено, управляет временным и пространственным паттерном генной экспрессии в развивающемся сердце (rev. Bruneau,2002; Clark et al.,2006; Conway et al.,2010; Cripps and Olson,2002; Greulich et al.,2011; Kodo and Yamagishi,2011; McCulley and Black,2012; Nemer,2008; Olson,2006; Wirrig and Yutzey,2011). Транскрипционные факторы также играют важные роли постнатально в поддержании паттерна экспрессии генов дифференцировки, защиты клеток от апоптоза и регуляции реакций сердца на стрессы, такие как гипертрофический рост (Aries et al.,2004; Balza and Misra,2006; Oka et al.,2006,2007; Parlakian et al.,2005; Toko et al.,2002; Wang et al.,2005; Zhang et al.,2001).

В последнее время важность эпигенетических механизмов в регуляции транскрипции стала очевидной. Геномная ДК эукариот упакована в последовательность нуклеосом, известной как хроматин (Fig. 1A). Хроматин каждого данного региона может существовать в разных конфигурациях, которые или ограничивают или способствуют локальной транскрипционной активности. Каждая нуклеосома содержит участок ДНК обернутый вокруг 8 гистоновых молекул. Каждый гистон имеет N-терминальный и/или C-терминальный хвост, которые высовываются из нуклеосомы и могут быть ковалентно модифицированы c помощью ацетилирования, метилирования, фосфорилирования и др. ферментативных реакций (rev. Berger,2002; Cheung et al.,2000; Nightingale et al.,2006) (Fig. 1B). Эти модификации оказывают выраженные эффекты на конфигурацию хроматина, а, следовательно, и транскрипцию. Др. способ изменения конфигурации хроматина это АТФ-зависимое ремоделирование хроматина. Ремоделирование хроматина может изменять позицию нуклеосом, пространства между нуклеосомами, сродство нуклеосома-ДНК, а также целостность нуклеосом (rev. Aalfs and Kingston,2000; Fan et al.,2004; Glatt et al.,2011; Hargreaves and Crabtree,2011) (Fig. 1A).

Figure 1. Eukaryotic genomic DNA is packaged into chromatin. A: Nucleosomes are the basic subunits of chromatin. Each nucleosome consists of ?146 bp of DNA wrapped approximately twice around a histone octamer (the individual monomers and histone tails are not shown). ATP-dependent chromatin remodeling can change nucleosome density, the position of nucleosome(s), nucleosome-DNA affinity, and the integrity of nucleosome(s). B: Major modification sites on histone H3 tail. Different modifications have different effects on chromatin structure and transcriptional activity. For example, methylation of K4 and K27 is associated with transcriptionally active and silent chromatin, respectively. Modification of one residue can also promote or inhibit the modification of another residue. For example, methylation of K9 and phosphorylation of S10 inhibits each other.

Сердце экспрессирует множество эпигенетических факторов, включая как гистон-мтодифицирующие белки и ремоделирующих хроматин. Недавние публикации предоставили превосходные общие обзоры эпигенетической регуляции развития сердца и болезней (Han et al.,2011; Ohtani and Dimmeler,2011; Vallaster et al.,2012; van Weerd et al.,2011). Среди эпигенетических факторов белки Polycomb Group (PcG) и Trithorax Group (TrxG) уникальны благодаря свой способности поддерживать репрессированные и активные конфигурации хроматина, соотв., в течение длительных периодов времени и в отсутствие транскрипционных факторов, которые инициировали репрессию или активацию (rev. Jacobs and van Lohuizen,2002; Pirrotta,1995). Эти свойства сделали их особенно важными в поддержании "клеточной памяти" какво время дифференцировки клонов, так и во взрослых тканях. Исследования развития многих органов и тканей подтвердили их важность. Вплоть до недавнего времени имелось мало информации о роли PcG или TrxG белков в сердце. Однако появившиеся данные строго подтвердили, что они являются центральными игроками в спецификации кардиальных клонов во время развития сердца и в поддержании клеточных свойств во взрослом сердце.

PcG AND TrxG PROTEINS: ESSENTIAL REGULATORS OF AXIAL PATTERNING AND LINEAGE DEVELOPMENT

PcG белки и их антагонисты, TrxG белки, впервые были идентифицированы у Drosophila в качестве регуляторов гомеозисных генов (Hox генов) (rev. Kennison,1995). Hox гены сильно законсервированые транскрипционные регуляторы клеточных судеб вдоль передне-задней оси (rev. Hueber and Lohmann,2008). Они экспрессируются в определенных доменах вдоль передне-задней оси и в определенном временном порядке: индивидуальные Hox гены последовательно активируются во всё более задних доменах во всё более поздних временных точках (rev. Mallo et al.,2010). Общим результатом становится то, что закладываются пространственно несимметрично расположенные границы доменов экспрессии Hox (Fig. 2). PcG гены необходимы для репрессии Hox генов вне, особенно впереди, по сравнению с их нормальные доменами экспрессии (rev. Pirrotta,1995; Gould,1997). У PcG мутантов, Hox гены становятся дерепрессированными в передних клетках, заставляя эти клетки принимать более заднюю судьбу. С др. стороны, TrxG гены необходимы, для удерживания Hox генов активированными внутри их обычных доменов экспрессии (rev. Gould,1997). У TrxG мутантов экспрессия Hox генов не поддерживается соотв. образом, заставляя задние клетки принимать более переднюю судьбу.

Figure 2. Regulation of Hox genes expression by PcG and TrxG genes in Drosophila. A: Staggered expression of Drosophila Hox genes along the anterior-posterior axis of the embryo. The Drosophila genome contains seven Hox genes arranged in two clusters: the Antennapedia complex and the Bithorax complex. The genes and their respective expression domains in the Drosophila embryo are color-coded in this diagram. Ant, anterior; Post, posterior. B: PcG genes are required to repress Hox genes outside their normal expression domains. The diagram shows expression domain of the Hox gene AbdB in wild-type (left) versus Pc^-/- (right) embryos. AbdB is normally expressed in the posterior segments of wild-type embryos but expands anteriorly in Pc^-/- embryos. C:TrxG genes are required to maintain Hox gene expression. The diagram shows expression of the Hox gene Ubx in wild-type (left) versus trx^-/- embryos (right). Ubx expression is greatly reduced in trx^-/- embryos.

Помимо своей роли в формировании осевого паттернаIn, PcG и TrxG белки участвуют в развитии многих органов и клеточных клонов (rev. Surface et al.,2010; van Lohuizen1998). Геномные исследования показали, что PcG и TrxG белки и гистоновые метки, регулируемые с их помощью, ассоциируют с тысячами хроматиновых локусов в эмбриональных стволовых (ES) клетках и эти локусы многочисленны в качестве "онтогенетических генов" (Mikkelsen et al.,2007; Ku et al.,2008; Pan et al.,2007; Zhao et al.,2007). ES клетки, дефицитные по активности PcG дефектны в отношении дифференцировки и в отношении активирующих дифференцировку специфических генов, таких как маркеры клонов (Pasini et al.,2007; Chamberlain et al.,2008; Shen et al.,2009; Landeira et al.,2010).

Наконец, PcG и TrxG белки млекопитающих,как было установлено, участвуют в регуляции пролиферации и туморогенеза (rev. Bracken and Helin,2009; Hess,2004; Reisman et al., 2005). Напр., PcG белок Bmi-1 является онкогеном, который может индуцировать активность теломеразы и позволить клеткам обойти старение, когда он избыточно экспрессируется в эпителиальных клетках молочных желез (Dimri et al.,2002). Др. PcG белок, Ezh2, избыточно экспрессируется в устойчивом к гормонам метастазирующем раке простаты. Замалчивание Ezh2 c помощью siRNA ингибирует пролиферацию культивируемых клеток простаты (Varambally et al.,2002).

Functional Mechanisms of PcG and TrxG Proteins

PcG и TrxG белки функционируют на уровне хроматина и их функциональные механизмы сильно законсервированы. PcG белки действуют в мультибелковых комплексах (rev. Levine et al., 2004; Muller and Verrijzer,2009; Schuettengruber and Cavalli, 2009). Идентифицировано 4 таких комплекса у Drosophila: PhoRC, PRC1, PRC2 и PR-DUB. За исключением PhoRC, соотв. комплексы были идентифицированы также у млекопитающих. PhoRC комплекс обладает сиквенс-специфической ДНК-связывающей активностью и также взаимодействует с моно- и ди-метилированным lysine 27 of histone H3 (H3K27) (Klymenko et al.,2006). Было предположено, что PhoRC играет критическую роль в распознании гипометилированных нуклеосом вокруг вышестоящих регуляторных элементов генов мишеней для PcG. Комплекс PRC2 обладает метил-трансферазной активностью и индуцирует триметилирование H3K27 (Czermin et al.,2002; Muller et al.,2002). H3K27me3 является хорошо известной меткой молчащего хроматина и ассоциирована с промоторами и регуляторными элементами генов мишеней для PcG. Комплекс PRC1 связывает триметилированный H3K27 и вызывает компакцию хроматина, тем самым поддерживаются хроматиновые регионы мишеней в молчащем состоянии (Fischle et al.,2003; Francis et al.,2004) (Fig. 3A). PRC1 также mono-ubiquitinates гистон H2A по лизину 119 (Wang et al., 2004), эта убиквитиназная активности PRC1, по-видимому, оказывается несущественным для его функции замалчивания (Eskeland et al.,2010). Комплекс PR-DUB обладает гистоновой deubiquitinase активностью, которая специфична для mono-ubiquitinated H2A (uH2A) в in vitro исследованиях (Scheuermann et al.,2010). Точная роль H2A ubiquitination/deubiquitination в PcG-обеспечиваемой репрессии всё ещё неясна.

Figure 3. PcG and TrxG proteins function at the level of chromatin. A: Biochemical functions of the PcG complexes PRC2 and PRC1. PRC2 mediates the trimethylation of histone H3K27, a repressive histone mark. PRC1 binds H3K27me3 and compacts chromatin. B: Biochemical functions of TrxG complexes MLL and BAF. MLL mediates trimethylation of histone H3K4. BAF has chromatin remodeling activity.

TrxG белки также функционируют в комплексах, состоящих из многих субъединиц (Fig. 3B) (reviewed in Schuettengruber et al.,2011). Три TrxG комплекса, MLL комплекс, BRM/BAF комплекс и суперкомплекс, были очищены в клетках млекопитающих. MLL комплекс обладает histone methyltransferase (HMTase) активностью и триметилирует lysine 4 of histone H3 (H3K4) (Milne et al., 2002; Yokoyama et al.,2004). H3K4me3 тесно ассоциирует с регионами промоторов транскрипционно активных локусов (Bernstein et al.,2005; Schneider et al.,2004). Комплекс BRM/BAF обладает SWI/SNF хроматин-ремоделирующей ATPase Brm/Brg1 и обеспечивает АТФ-зависимое скольжение нуклеосом (Papoulas et al.,1998; Wang et al.,1996). Суперкомплекс обладает как HMTase активностью, так и хроматин-ремоделирующей активностью (Nakamura et al.,2002).

Несколько линий доказательств показали, что PcG и TrxG белки противодействуют функции один другого. Во-первых, PcG и TrxG мутации оказывают противоположные эффекты на формирование аксиального паттерна. PcG мутации вызывают задние трансформации, тогда как TrxG мутации вызывают передние трансформации (rev. Kennison,1995). Во-вторых, генетические эксперименты показали, что большинство PcG и TrxG мутаций реципрокно репрессируют др. др. (Daubresse et al.,1999; Ingham,1984; Kennison and Tamkun,1988). Наконец, комплекс PRC1 блокирует способность ремоделирования хроматина комплекса BRM/BAF in vitro , собираемого на нуклеосомной матрице (Shao et al.,1999). Напротив активная гистоновая метка H3K4me3, которая генерируется SET1-подобным и MLL комплексами, ингибирует метилирование гистонов c помощью PRC2 (Schmitges et al.,2011). Итак, PcG и TrxG белки представляют сильно консервативную систему, которая поддерживает состояние транскрипции генов мишеней за счет тонко контролируемого баланса.

PcG and TrxG Proteins in the Maintenance of "Cellular Memory"

У многоклеточных организмов разные клеточные клоны обладают разными паттернами генной экспрессии. Во время дифференцировки клеточный хроматин принимает конфигурацию, чтобы облегчить клон-специфический паттерны экспрессии генов. Как конфигурация хроматина,так и паттерн экспрессии генов гарантированно наследуются клеточными потомками в течении многих клеточных делений, даже если онтогнетические сигналы, инициировавшие конфигурацию хроматина, более не присутствуют (rev. Margueron and Reinberg,2010; Simon,1995). PcG и TrxG белки, как полагают, особенно важны для поддержания такой "клеточной памяти" (rev. Jacobs and van Lohuizen,2002; Pirrotta, 1995).

Генетические эксперименты на Drosophila предоставили доказательства, что PcG белки участвуют в долговременном поддержании молчания генов. Напр., паттерн экспрессии Hox гена Ubx устанавливается вскоре после гаструляции во время эмбриогенеза Drosophila. У эмбрионов, мутантных по PcG гену esc, домен экспрессии Ubx первоначально нормальный, но возникает эктопическая экспрессия после стадии удлинения зародышевого диска (Struhl and Akam,1985). Т.о., esc необязателен для становления домена экспрессии Ubx, но необходим на более поздних стадиях, чтобы гарантировать, что Ubx останется молчащим в регионах, где он не был первоначально активирован. С др. стороны, TrxG белки действуют, чтобы поддерживать активацию генов. Напр., у эмбрионов мышей, лишенных TrxG гена Mll2, экспрессия Mox1 и Hoxb1, двух мишеней для Mll2, индуцируется нормально, но позднее уменьшается и в конечном итоге теряется полностью (Glaser et al.,2006).

Как белки PcG/TrxG могут облегчать переход конфигураций хроматина в ходе клеточных делений? Поскольку точные механизмы достаточно далеки от полного понимания, некоторые намеки могут быть найдены в последних биохимических и структурных исследованиях PRC2 комплекса. Во время S фазы стержневые компоненты PRC2 помещаются в места репликации ДНК (Hansen et al.,2008). Один из стержневых компонентов, EED, соединяется с предсуществующими H3K27me3 метками посредством своих WD40 повторов (Margueron et al.,2009). EED-H3K27me3 взаимодействие стимулирует метилтрансферазную активность PRC2. Т.о., предсуществующая H3K27me3 не только представляет способ рекрутирования комплекса PRC2, но и также активирует комплекс триметилировать H3K27 во вновь инкорпорированных гистонах, обеспечивая механизм эффективного "самообновления" H3K27me3 метки во время митозов.

EMERGING ROLES FOR PcG AND TrxG PROTEINS IN THE REGULATION OF HEART DEVELOPMENT AND FUNCTION

Множественные PcG и TrxG гены обычно экспрессируются в сердце мышей. Благодаря важной функции PcG/TrxG генов, конституитивный нокаут ключевых PcG или TrxG генов часто ведет к гибели во время раннего эмбриогенеза прежде, чем может быть проанализирован кардиальный фенотип (Bultman et al.,2000; O'Carroll et al.,2001; Voncken et al.,2003). Исследования, обусловленных определенными условиями нокаутных моделей установили критические роли для двух комплексов PcG и одного комплекса TrxG во время кардиального развития и/или во взрослом сердце (Fig. 4; see Supp. Table S1, which is available online).

Figure 4. Multiple steps of cardiac development require PcG/TrxG function. Precardiac mesoderm give rise to cardiac progenitors in the first heart field (FHF) and second heart field (SHF, also known as anterior heart field or AHF). The TrxG protein Baf60c likely regulates the induction of cardiac fate. Cells in the FHF form the linear heart tube, which gives rise to the bulk of the left ventricle (LV) and also serves as a scaffold for subsequent heart growth. As the heart tube loops, cells in the SHF migrate to join the linear heart tube and give rise to the outflow tract (O), right ventricle (RV), and atria (A). Both Baf60c and the PcG protein Phc1 have been shown to regulate this early phase of cardiac development. The formation of the chambered heart from the looped heart involves a number of morphogenic processes such as trabeculation, proliferation, and septation. Multiple PcG and TrxG proteins, including Brg1, Baf60c, Ezh2, Eed, and Jmj, have been shown to regulate these processes. The dashed line between Jmj and Ezh2/Eed represents possible functional interaction. In addition to the FHF and SHF, cells from cardiac neural crest and proepicardium also contribute to the heart (not diagrammed).

Polycomb Repressor Complex 2 (PRC2) Core Components: Ezh2 and Eed

Ezh2 является SET-доменовойт гистон метилтрансферазой и стержневой субъединицей PRC2 (Czermin et al.,2002; Muller et al.,2002). Гомогенные Ezh2 нокаутные эмбрионы погибают до завершения гаструляции (O'Carroll et al.,2001), подтверждая, что Ezh2 необходим для раннего эмбрионального развития. Ezh2 экспрессируется на высоком уровне в развивающемся сердце, подавляется в сердце взрослых, тогда как его гомолог Ezh1 обнаруживает обратный паттерн (Sdek et al.,2011). Два недавних исследования, в которых инактивировали Ezh2 в специфических популяциях клеток, показали, что Ezh2 играет важные роли как во время развития сердца, так и в сердце взрослых (He et al.,2012a; Delgado-Olguin et al.,2012).

Инактивация Ezh2 в кардиомиоцитах желудочков с использованием Nkx2.5::Cre (Ezh2NK) приводила к перинатальной гибели и к ряду аномалий сердца, включая гипоплазию в компактном миокарде, избыточную трабекуляцию, дефекты перегородок и расширение правого предсердия (He et al.,2012a). Перинатальная гибель и истончение миокарда наблюдались также, если Eed был делетирован в дифференцированных кардиомиоцитах c помощью TnT::Cre, который активен чуть позднее, чем Nkx2.5::Cre (He et al.,2012a). Однако EedTnT эмбрионы не обнаруживали дефектов перегородок или расширения предсердия. Итак, эти результаты подтверждают, что PRC2 активность необходима для многих аспектов морфогенеза сердца во многих временных точках. Каковы молекулярные основы морфологических дефектов в Ezh2NK и EedTnT сердцах? He et al. (2012a) идентифицировали более 50 генов, которые непосредственно репрессируются c помощью PRC2 в развивающемся сердце. Этот список включает множественные транскрипционные факторы с известной ролью на разных ступенях морфогенеза сердца, такие как Isl1, Tbx2, Tbx3, Hand1, Irx5 и Six1 (Cai et al.,2003; Costantini et al.,2005; Guo et al.,2011; McFadden et al.,2005; Mesbah et al.,2008; Risebro et al.,2006; Ribeiro et al.,2007; Riley et al.,1998; Singh et al.,2011). Это подтверждает, что PRC2 критически участвует в онтогенетической координации экспрессии программ кардиальных генов. Кроме того, PRC2 непосредственно репрессирует циклин-зависимые киназные ингибиторы Ink4a/b, это может объяснить фенотип гипоплазии у Ezh2NK эмбрионов (He et al.,2012a) (Fig. 5A).

Figure 5. Roles of Ezh2, Brg1, and Jmj in cardiomyocyte proliferation and trabeulation. A: Pathways by which Ezh2, Brg1, and Jmj regulate fetal cardiomyocyte proliferation. Cyclins (such as cyclin D) activates cyclin-dependent kinases (such as Cdc4), which phosphorylate Rb and relieve Rb repression of a number of genes essential for cell cycle progression. Ezh2 promotes fetal cardiomyocyte proliferation by direct repression of the cyclin-dependent kinase inhibitor Ink4a/b. Brg1 also promotes fetal cardiomyocyte proliferation, and it does so by activating Bmp10, which in turn represses another cyclin-dependent kinase inhibitor p57kip2. Jmj inhibits fetal cardiomyocyte proliferation by repressing cyclin D and by acting as a co-repressor for Rb. It is unclear whether Jmj and Ezh2 functionally interact with each other in the repression of cyclin D and Ink4a/b, and if they do, whether Jmj promotes or inhibits PRC2 activity in these contexts (hence dashed line between Jmj and Ezh2). Over-proliferation of fetal cardiomyocytes may result in delayed differentiation. B: Regulation of trabeculation by Ezh2, Brg1, and Jmj. The diagram shows a trabecula. Formation of these finger-like trabeculae is induced by signaling between the endocardium and the myocardium. Proteoglycans in the cardiac jelly modulates the trabeculation process by modulating the function of signaling molecules (x). Ezh2 expression in the myocardium is required for trabeculation, possibly by repressing an as-yet unidentified downstream effector (y). Brg1 expression in the endocardium promotes termination of trabeculation by activating the secreted proteinase ADAMTS1, which mediates the degradation of extracellular proteoglycans. Jmj expression in the endocardium negatively regulates trabeculation by repressing Notch.

Исследование Delgado-Olguin et al. с использованием MEF2c-ANF::Cre , чтобы инактивировать Ezh2 со ст. E7.5 в кардиальных предшественниках второго поля сердца (SHF, также известного как переднее поле сердца или AHF) и в их производных. Интересно, что Ezh2SHF мыши не обнаруживают явных дефектов кардиального морфогенеза; вместо этого, такие животные доживают до взрослого периода, но у них развивается кардиальная гипертрофия и фиброз в происходящем из SHF правом желудочке (Delgado-Olguin et al.,2012) (Fig. 6). Six1 идентифицирован как основной эффектор функции Ezh2 при гипертрофии сердца. Удаление одной копии Six1 устраняет фенотипы гипертрофии и фиброза, вызываемые специфичной для SHF делецией Ezh2 (Delgado-Olguin et al.,2012). Six1 обычно экспрессируется в предшественниках SHF на ст. E7.5-E8.5, но подавляется быстро после дифференцировки (Guo et al.,2011).В Ezh2SHF сердцах экспрессия Six1 сохраняется в течение всего кардиогенеза и во взрослом миокарде. Интересный вопрос, играет Ezh2 (и активность PRC2) роль в инициации или поддержании онтогенетического замалчивания Six1 и др. кардиальных мишеней. У Drosophila, онтогенетическое замалчивание Hox генов может быть подразделено на фазы инициации и поддержания, которые нуждаются в разных регуляторных элементах, а активность PcG специфически необходима во время фазы поддержания (Ringrose and Paro,2007). Т.о., можно ожидать, что активность PRC2 млекопитающих постоянно необходима, в течение всего взрослого периода, чтобы поддерживать Six1 в состоянии молчания. Др. словами, репрессия Six1 может быть инициирована в Ezh2SHF сердцах, но не поддерживается. Напротив, PRC2 млекопитающих может быть необходим временно для инициации молчания Six1, но становится не нужным после этого. Выбор между этими двумя сценариями может повлиять на разработку терапии, нацеленной на путь PRC2. Ценное замечание, что взрослое сердце преимущественно экспрессирует Ezh1 вместо Ezh2 (Sdek et al.,2011). Однако функция Ezh1 недостаточна. чтобы репрессировать Six1 во взрослых Ezh2SHF сердцах (Delgado-Olguin et al.,2012). Это может быть обусловлено функциональной дивергенцией между Ezh1 и Ezh2. Хотя Ezh1, как было установлено, метилирует H3K27 и участвует в комплектации Ezh2 в ES клетках и кожной ткани (Ezhkova et al.,2011; Shen et al.,2008), два исследования подчеркнули важность отличий между функциями двух гомологов, включая роль по активации транскрипции для Ezh1 (Margueron et al.,2008; Mousavi et al., 2012).

Figure 6. Opposing roles of Ezh2 and Brg1 in the regulation of hypertrophic response. The adult heart responds to stress, such as pressure overload or ?-adrenergic stimulation, by hypertrophic growth of cardiomyocytes. This results in thickened myocardial walls and smaller ventricular chamber(s). The PcG protein Ezh2 represses cardiac hypertrophy through a Six1-dependent pathway. The TrxG protein Brg1 is required for development of the hypertrophic response.

Помимо метилирования H3K27, Ezh2,как было установлено, метилирует также кардиальный транскрипционный фактор GATA4 и ингибирует активность GATA4 как in vivo, так и in vitro (He et al.,2012b) (Fig. 7). Это делает GATA4 первым из известных негистоновых субстратов для PRC2 и открывает новый механизм, c помощью которого PRC2 может регулировать транскрипцию. Будущие эксперименты необходимы для выяснения относительного вклада метилирования H3K27 в противовес метилированию GATA4 в направлении PRC2-обусловленного молчания генов мишеней для GATA4. Более того, возможно, что GATA4 не является исключительным примером и что PRC2 имеет и др. негистоновые субстраты, которые предстоит идентифицировать.

Figure 7. Known interactions between PcG/TrxG proteins and cardiac transcription factors. The TrxG complex BAF physically interacts with cardiac transcription factors GATA4, Nkx2.5, and Tbx5 and potentiates their activity on target promoters. A genetic interaction between Brg1 and the transcription factor Tbx20 has been shown, but it is unclear whether Tbx20 physically interacts with Brg1, Baf60c, or other subunit(s) of BAF. GATA4 also physically interacts with the PcG protein Ezh2, which methylates GATA4 and inhibits its activity. Jmj interacts with both GATA4 and Nkx2.5 and inhibits their activities through an as-yet unknown mechanism.

PRC2 Accessory Component: Jumonji/Jarid2

Jumonji (Jmj, также известен как Jarid2) является членом основателем семейства Jumonji, которое состоит из 27 белков у человека. Многие белки семейства Jumonji, по-видимому, являются histone lysine demethylases (KDM) (reviewed in Cloos et al.,2008). Однако, сам Jmj , как полагают, является ферментативно неактивным, поскольку он содержит несколько аминокислотных замен в ко-факторе Fe(II) связывающего региона, который важен для активности KDM (Klose et al., 2006). Jmj ассоциирует с PRC2 в ES клетках и некоторых др. типах клеток и тканей (Landeira et al.,2010; Li et al.,2010a; Pasini et al.,2010; Peng et al.,2009; Shen et al.,2009). В соответствии с этой ассоциацией, Jmj и PRC2 ко-локализуются во многих регионах хроматина и каждый способствует эффективному привлечению другого к хроматиновым мишеням. Однако остается неясным усиливает или ингибирует Jmj активность HMTase из PRC2, и возможно, что Jmj может действовать обоими способами в зависимости от уровня своего белка относительно PRC2. Наконец, Landeira et al. (2010) показали, что Jmj необходим для поддержания мишеней промоторов для PRC2 в "primed" состоянии, связанном c помощью RNA polymerase II, фосфорилированном по Ser 5 (the "poised" RNA pol II) и готовым быть активированным при получении сигнала к дифференцировке.

Jmj играет критическую роль в развитии сердца. Экспрессия Jmj в желудочках инициирует трабекулярный слой на ст. E10.5 и распространяется на компактный слой на ст. E12.5; он широко экспрессируется в обоих сдлоях на ст. E18.5 и постнатальных стадиях (Toyoda et al.,2003). Эффект мутации Jmj обнаруживает сильную зависимость от генетического фона. Jmj^-/- на C3H/He фоне погибают примерно на ст. E11.5 с избыточной пролиферацией в трабекулярном слое, это может прекращать кровообращение и вызывать гибель (Takeuchi et al.,1999). С др. стороны, Jmj^-/- эмбрионы на C57BL/6 фоне выживают до перинатальных стадий и обнаруживают двойной выход из правого желудочка (DORV), ventricular septal defects (VSD) и тяжелое недоразвитие (noncompaction) стенки желудочков (Lee et al.,2000).

Поскльку молекулярный механизм функции Jmj во время развития сердца далек от понимания, ряд исследований попыталось пролить свет разными способами. Прежде всего, Jmj взаимодействует с двумя важными кардиальными транскрипционными факторами, Nkx2.5 и GATA4, и ингибирует активацию промоторов мишеней Nkx2.5 и GATA4 (Kim et al.,2004). Это может объяснить почему Jmj^-/- сердца неспособны подавлять atrial natriuretic factor (ANF, кодируемый геном Nppa), который является известной мишенью для Nkx2.5 и GATA4 (Lee et al.,2000). Во-вторых, Jmj регулирует клеточный цикл кардиомиоцитов двумя способами (Fig. 5A): с одной стороны, он репрессирует экспрессию cyclin D1 (и, следовательно, ингибирует фосфорилирование Rb); с др. стороны, он взаимодействует с Rb и действует как Rb ко-репрессор (Toyoda et al.,2003; Jung et al.,2005). Оба способа приводят к репрессии генов мишеней для E2F, которые необходимы для прохождения клеточных циклов. Jmj способен соединяться с промотором cyclin D1 в трансфицированных клетках и рекрутирует активность метилирования H3K9 (Shirato et al.,2009), тем самым непосредственно репрессирует cyclin D1. В-третьих, в эндокарде Jmj выступает как негативный регулятор передачи сигналов Notch, которая служит как митогенный сигнал для миокарда и регулирует процесс трабекуляции (Fig. 5) (передача сигналов Notch прир трабекуляции, см. High and Epstein,2008). Jmj ассоциирует с консервативным регионом локуса Notch1, а уровень белка Notch1 достоверно повышен в Jmj^-/- сердцах (Mysliwiec et al.,2011). Удивительно, что специфичный для эндотелия нокаут Jmj, который устраняет Jmj в эндокарде и др. клетках эндотелиального клона, воспроизводит большинство кардиальных фенотипов мышей Jmj^-/- (Mysliwiec et al.,2011). Это указывает на то, что Notch и возможно др. сигналы, возникающие в эндокарде, обеспечивают существенную часть функции Jmj, клеточно неавтономным способом. Наконец, Jmj необходим для экспрессии маркеров дифференцировки, таких как Myh6 (encoding ?-MHC), ?-cardiac actin и actinin, в кардиомиоцитах плода (Takeuchi et al.,1999; Nakajima et al.,2011). Однако это может быть косвенным эффектом от функции Jmj на регуляцию пролиферации в противовес дифференцировке. Повышенная экспрессия cyclin D в Jmj^-/- сердцах вызывает гиперпролиферацию и предупреждает экспрессию GATA4, который является активатором транскрипции этих генов дифференцировки (Nakajima et al.,2011).

Polycomb Repressor Complex 1 (PRC1) Core Component: Phc1

Phc1 (также известен как Rae28) у млекопитающих гомологом Drosophila PcG белка Polyhomeotic (Ph). Phc1 и Ph являются компонентами у млекопитающих и Drosophila комплекса PRC1, соотв. Phc1 мутантные эмбрионы дефектны уже в ранний период и на важной ступени кардиального морфогенеза-образование петли сердца-которое происходит между E8.5 и E9.5 (Shirai et al.,2002). Поскольку мутантное сердце способно формировать камеры, оно обнаруживает VSD и др. аномалии сердца (Takihara et al.,1997; Shirai et al.,2002). Эти дефекты, по-видимому, возникают в результате потери экспрессии кардиального транскрипционного фактора Nkx2.5 (Shirai et al.,2002). Phc1 не нужен для инициации экспрессии Nkx2.5, но необходим для продолжения его экспрессии. Принимая во внимание, что PcG белки обычно функционируют, чтобы замалчивать гены, регуляция Nkx2.5 с помощью Phc1 может быть косвенной, но точный механизм предстоит ещё определить.

Интересно, что трансгенные исследования показали, что из-за повсеместной экспрессии трансген Phc1 д. восстанавливать экспрессию Nkx2.5 и устранять дефекты кардиального морфогенеза у Phc1^-/- эмбрионов, а специфичную для кардиомиоцитов экспрессию нет (Shirai et al.,2002; Koga et al.,2002). Это указывает на то, что нормальный морфогенез сердца нуждается в функции Phc1 в популяции клеток, иных чем кардиомиоциты. Специфичная для кардиомиоцитов избыточная экспрессия Phc1 не устраняет ни врожденные пороки сердца у Phc1^-/- эмбрионов, ни нарушенный кардиальный морфогенез у эмбрионов с дикого типа фоном. Однако продолжающаяся экспрессия Phc1 в кардиомиоцитах взрослых является вредной и ведет к нарушению организации саркомеров, апоптозу кардиомиоцитов, расширению камер и сердечной недостаточности (Koga et al.,2002). Благодаря функции PcG белков в мульти-субъединичных комплексах, активность комплекса, такого как PRC1, скорее всего, зависит как от субъединичного состава, так и стехиометрии. Т.о., трудно предсказать, будет ли постоянная экспрессия Phc1 в кардиомиоцитах взрослых поддерживать или мешать активности PRC1. Несмотря на это мы может сделать вывод, что тонкая регуляция активности PcG на взрослых стадиях важна для поддержания функции кардиомиоцитов. Будущие исследования расшифруют молекулярные функции PRC1 во взрослом сердце.

BAF Complex Core Component: Brg1/Smarca4

Drosophila TrxG белок Brm является стержневым компонентом BRM комплекса, который обеспечивает зависимое от АТФ ремоделирование хроматина (Papoulas et al.,1998). У человека BRG1-associated-factor (BAF) комплекс содержит множественные консервативные субъединицы с BRM комплексом дрозофилы (Wang et al.,1996). Стержневая ATPase в hBAF может быть или hBRG1 (также известна как SMARCA4) или hBRM (SMARCA2), обе они гомологичные Brm дрозофилы.

У мышей, Brg1 широко экспрессируется в эмбриональном сердце и его экспрессия в разных регионах, по-видимому, выполняет разные роли. Экспрессия Brg1 в эндокарде критическая для трабекуляции в миокарде желудочков (Stankunas et al.,2008) (Fig. 5B). Во время процесса трабекуляции передача сигналов между эндокардом и миокардом заставляет миокардиальные клетки формировать пальцеобразные проекции или трабекулы. Трабекуляция регулируемый во времени процесс, который начинается на ст. ~E9.0, и затухает к ст. E12.5 и завершается на ст. E14.5. Соотв. степень трабекуляции является критической для нормальных сокращений и гемодинамики в сердце эмбриона и важна для жизнеспособности эмбриона. Внеклеточный матрикс между эндокардом и миокардом, известный как кардиальный гель, играет важную роль в трабекуляции благодаря воздействию на диффузию и функцию сигнальных молекул и путем создания микроусловий, которые поддерживают пространные клеточные движения, необходимые для образования трабекул (review of the role of ECM in cell signaling, see Kim et al.,2011). Brg1 необходим для репрессии ADAMTS1, секретируемой матричной металлопротеиназы, которая деградирует Versican и возможно др. протеогликаны в кардиальном геле и тем самым завершает процесс трабекуляции (Stankunas et al.,2008). Когда Brg1 делетирован в эндокарде, то ADAMST1 оказывается дерепрессированным преждевременно, приводя к ранней деградации кардиального геля и недостаточной трабекуляции. Низкомолекулярный ингибитор ADAMST1 может устранять фенотип гипотрабекуляции в культивируемых мутантных Brg1 эмбрионах, подтверждая, что основной функцией Brg1 в процессе трабекуляции является регуляция ADAMST1.

Brg1 экспрессируется также во всем эмбриональном миокарде и его экспрессия необходима для нормальной пролиферации и дифференцировки кардиомиоцитов (Hang et al.,2010). Специфичная для миокарда делеция Brg1 приводит к существенной редукции пролиферации кардиомиоцитов, снижению экспрессии Bmp10 (фактора роста кардиомиоцитов), и увеличению экспрессии p57kip2 (циклин-зависимого киназнго ингибитора) (Fig. 5A). Кроме того, Brg1^-/- кардиомиоциты обнаруживают преждевременное образование организованных саркомеров, повышенную экспрессию "взрослой" MHC изоформы ?-MHC и пониженную экспрессию ?-MHC (кодируемую геном Myh7), "плодной" изоформы, которая преимущественно экспрессируется эмбриональным сердцем.

Помимо участия в развитии сердца, Brg1 также играет роль в сердечных заболеваниях у взрослых. За исключением в небольшом количестве не кардиомиоцитов, взрослое сердце не экспрессирует Brg1. Однако, Brg1 может быть реактивирован стрессовыми сигналами. Реактивация Brg1 важна для развития гипертрофии у TAC-оперированных мышей (Hang et al.,2010) (Fig. 6). Сердце взрослых мышей преимущественно экспрессирует ?-MHC. Одним из характерных событий во время гипертрофического процесса является переключение ^-/--MHC изоформ: реактивация Myh7 и часто конкурентная репрессия Myh6. В соответствии с его ролью в эмбриональном сердце, Brg1 необходим для активации Myh7 и репрессии Myh6. Это может частично объяснить, почему Brg1 необходим для гипертрофии, хотя дополнительные механизмы также могут действовать.

Поскольку рекрутирование PcG белков на сайты мишени хромтина, как полагают, использует специализированные регуляторные элементы (rev. Muller and Kassis, 2002; Ringrose and Paro,2007) и/или длинные некодирующие РНК (Kotake et al.,2011; Pandey et al.,2008; Rinn et al.,2007; Plath et al.,2003; Zhao et al.,2008), большое количество исследований подтвердило, что транскрипционные факторы играют важную роль в рекрутировании BAF и др. комплексов, ремоделирующих хроматин (rev. Peterson and Workman,2000; Sudarsanam and Winston,2000). В соответствии с этим мнением, Brg1 и BAF комплекс функционально взаимодействуют со многими кардиальными транскрипционными факторами (Lickert et al.,2004; Lou et al.,2011; Takeuchi and Bruneau,2009; Takeuchi et al.,2011) (Fig. 7). У мышей Brg1 генетически взаимодействует с Tbx5, Nkx2.5 и Tbx20 (Takeuchi et al.,2011). Двойные гетерозиготы Brg1 с любым из этих транскрипционных факторов погибают до ст. E14.5 и обнаруживают различные кардиальные морфогенетические дефекты, демонстрируя взаимное генетическое усиление между мутациями Brg1 и в этих транскрипционных факторах. Функциональное взаимодействие наблюдалось также между BAF комплексом и GATA4 как у мышей, так и рыбок данио (Lickert et al.,2004; Lou et al.,2011; Takeuchi and Bruneau,2009; Takeuchi et al.,2011).

BAF Complex Core Component: Baf60c/Smarcd3

Baf60c (также известный как Smarcd3) является др. стержневым компонентом комплекса BAF. Его дрожжевой гомолог,как было установлено, важен для активности комплекса SWI/SNF, который является дрожжевым аналогом BAF (Cairns et al.,1996). Существует три Baf60 паралога в геноме млекопитающих, Baf60a, b и c. Среди них Baf60c единственный, который экспрессируется в развивающемся сердце (Lickert et al.,2004).

В противовес широкой экспрессии Brg1, паттерн экспрессии Baf60c is очень тканеспецифичен. Когда экспрессия Baf60c инициируется ~E7.5, то она ограничена кардиальным гребнем. Он продолжает экспрессироваться на высоком уровне в сердечной трубке и в камерах сердца. На ст. E9.5 экспрессия также обнаруживается в сомитах, дорсальной части нервной трубки и зачатках конечностей. Используя трансгенных мышей, экспрессирующих siRNA против Baf60c, Lickert et al. показали, чтоt Baf60c особенно важен для развития тракта оттока (OFT), правого желудочка (RV) и предсердия, происходящих из SHF (Lickert et al.,2004).

Когда Baf60c и GATA4 были совместно трансфицированы эмбрионам мыши дикого типа на ст. E6.5-E8.75, то ранний кардиальный маркер Actc1 эктопически индуцировался в обычно не-кардиогенной мезодермальной ткани (Takeuchi and Bruneau,2009). Добавление Tbx5 в смесь для трансфекции делало возможной дальнейшую дифференцировку в сокращающиеся кардиомиоциты. Эти результаты указывают на то, что Baf60c может выполнять центральную функцию в спецификации кардиальной судьбы помимо своей более поздней роли в морфогенезе сердца. Эта функция не выявляется в siBaf60c модели, возможно из-за того, что RNAi не полностью элиминирует экспрессию Baf60c (Lickert et al.,2004).

Хотя Brg1 и Baf60c оба являются стержневыми компонентами BAF комплекса, но Brg1- и Baf60c-дефицитные мыши обладают самостоятельными, хотя и перекрывающимися фенотипами. Оба необходимы для трабекуляции (Lickert et al.,2004; Stankunas et al.,2008). С др. стороны, ни специфичная для эпикарда, ни специфичная для миокарда делеция Brg1 не вызывает существенных дефектов в SHF (Stankunas et al.,2008; Hang et al.,2010). Различия в фенотипах между Brg1- и Baf60c-дефицитом могут быть результатом различий во времени потери Brg1 или Baf60c усоотв. модельных мышей. Роль Brg1 в развитии SHF может отсутствовать при условных нокаутах, при которых происходит делеция Brg1 после E9.5. Альтернативно, это может быть обусловлено разными ролями, которые выполняют эти два белка в комплексе BAF. При использовании репортеров было показано, что Baf60c усиливает активность Tbx5, Nkx2.5 и GATA4 путем усиления взаимодействия между этими транскрипционными факторами и Brg1 (Lickert et al.,2004) (Fig. 7). Это подтверждает, что Baf60c действует как мостик между BAF комплексом и избранными кардиальными транскрипционными факторами. В дополнение к внесению активности по ремоделированию хроматина, содержащейся в Brg1, Baf60c может позволять своим транскрипционным факторам партнерам достигать др. активностей посредством BAF комплекса, таких как histone H2B ubiquitinase активность (Li et al.,2010b) или взаимодействие с базовым транскрипционным аппаратом (Cho et al.,1998; Lemieux and Gaudreau,2004; Neish et al.,1998; Wilson et al.,1996). Т.о., разные гены мишени могут обладать индивидуальной потребностью в Brg1 и Baf60c, в зависимости от того, нуждается ли их активация в ремоделировании хроматина и/или др. активностях, обеспечиваемых c помощью BAF.

Baf60c не единственный важный для рекрутирования Brg1 и др. BAF-ассоциированных активностей, они также нуждаются в связывании GATA4 с двумя его локусами мишенями (Takeuchi and Bruneau,2009). Роль BAF в рекрутировании взаимодействующих с ним транскрипционных факторов уже наблюдалась ранее. Напр., SWI/SNF (дрожжевой аналог BAF) стимулирует связывание нуклеосом транскрипционными факторами Sp1, USF и NF-κB in vitro (Utley et al.1997). In vivo, SWI/SNF необходим для эффективного связывания GAL4 с низким сродством, нуклеосомных сайтов, но не для связывания GAL4 с высоким сродством сайтов или сайтов свободных нуклеосом с низким сродством (Burns and Peterson,1997; Kwon et al., 1994). Было предположено, что BAF может быть рекрутирован c помощью транскрипционного фактора, соединяющегося с сайтом высокого сродства и это в свою очередь способствует рекрутированию др. транскрипционных факторов, которые соединяются с более слабыми сайтами. Альтернативно, BAF может взаимодействовать с более поздним транскрипционным фактором в растворе прежде, чем оба будут присоединены к сайту мишени (Peterson and Workman,2000; Sudarsanam and Winston,2000).Т.о., Baf60c может рекрутироваться др. фактором и обеспечить последующее присоединение GATA4или может быть рекрутирован одновременно с GATA4 и стабилизировать ассоциацию GATA4-хроматин, которая иначе слабая и преходящая. Зависит ли присоединение Baf60c/BAF от GATA4 или любого взаимодействующего с ним фактора предстоит определить в последующих экспериментах.

PERSPECTIVES

During embryonic development, the process of heart morphogenesis involves multiple groups of cells whose specification, proliferation, migration, differentiation, and interaction must be precisely regulated both temporally and spatially. During adult life, cardiomyocytes need to maintain their identity and function for many years while having the capacity to respond to physiological changes. PcG and TrxG proteins are well suited for the regulation of both embryonic heart development and adult heart function. By creating repressive and activating chromatin structures, respectively, PcG and TrxG proteins play unique roles in the maintenance of lineage identity and cellular memory. The studies reviewed here have demonstrated important functions for several PcG and TrxG proteins in the heart. However, many questions remain to be answered. While we know PcG and TrxG proteins play critical roles in multiple steps of cardiac development, there are conspicuous gaps in our knowledge: we still know nothing about their function in the development of cardiac neural crest and the proepicardium, both of which make essential contributions to the heart (reviewed in Gittenberger-de Groot et al.,2010; Stoller and Epstein,2005). While PcG and TrxG proteins have been shown to regulate the hypertrophic response in the adult heart, we need a deeper understanding of their functional mechanisms to address whether cardiac hypertrophy involves a modification of “cellular memory” and whether the normal cellular memory, once modified, can be restored. While functional interactions between PcG/TrxG proteins and cardiac transcription factors have been reported, we are still a long way from integrating PcG and TrxG function into the overall picture of cardiac transcriptional regulation. Finally, to translate findings from basic research to medicine, we need to address whether mutations in human PcG and TrxG genes are associated with heart disease. As we gain a better knowledge of the roles and functional mechanisms of PcG and TrxG proteins in the heart, we will move closer to harnessing epigenetic mechanisms in the prevention and/or treatment of heart disease.

Epigenetic regulation of cardiac development and function by polycomb group and trithorax group proteins Q. Tian Wang Developmental Dynamics Volume 241, Issue 6, pages 1021–1033, June 2012

Epigenetic regulation of cardiac development and function by polycomb group and trithorax group proteins
Q. Tian Wang
Developmental Dynamics Volume 241, Issue 6, pages 1021–1033, June 2012