Сердечная недостаточность часто является следствием потери кардиальных миоцитов после инфаркта. Пациенты, госпитализированные с повторяющимися эпизодами сердечной недостаточности имеют пргноз столь же низкий, как и пациенты с распространенными злокачественными образованиями (Stewart et al, 2001). Помимо трансплантации сердца и имплантации механических помогающих желудочкам устройств, современная терапия не решает центральной проблемы снижения накачивающей способности из-за снижения пула кардиальных миоцитов.

До недавнего времени перспектива кардиальной регенерации была в основном предметом научной фантастики. Длительное время считалось, что сердце млекопитающих является окончательно дифференцированным органом, неспособным к пополнению изнашиваемых миоцитов. В последнюю декаду было установлено не только, что кардиальные миоциты млекопитающих сохраняют некоторую способность к делениям (Beltrami et al, 2001), но и также идентифицированы эндогенные клетки кардиальных предшественников в сердце (Beltrami et al, 2003) или костном мозге (Orlic et al, 2001). Эти клетки сохраняют некоторый потенциал к дифференцировке в клеточные компоненты сердца, включая эндотелиальные клетки, гладкомышечные клетки и кардиальные миоциты.

Если клетки предшественники, располагающиеся у взрослых способны продуцировать новые сердечные клетки, то терапевтическая доставка таких клеток предшественников может облегчить генерацию de novo функционального миокарда. В этом контексте клеточная терапия сердца быстро переросла в клиническое лечение сердечных болезней, но рандомизированные клинические испытания с предшественниками костного мозга выявили в лучшем случае скромные улучшения вентрикулярной функции (Martin-Rendon et al, 2008). Короче, многообещающая полная регенерация сердца осталась не реализованной.

В свете противоречивых результатов клинических испытаний, было жестко пересмотрены основы кардиальной регенерации, а недавние успехи предзнаменовали будущие направления в этой области.

Heart regeneration in lower organisms

Неудачи с регенерацией сердца млекопитающих очевидны, если сравнить с организмами, такими как рыбки данио и тритоны, которые демонстрируют удивительную способность к выживанию после удаления до 20% сердца путем отрезания верхушки желудочка (Oberpriller & Oberpriller, 1974; Poss et al, 2002). Предсуществующие кардиальные миоциты, соседствующие с местом разреза, подвергаются дедифференцировке, характеризующейся растворением саркомерных структур. Это сопровождается включением маркеров синтеза ДНК (напр., аналогов нуклеотидов) , что указывает на пролиферацию (Jopling et al, 2010; Kikuchi et al, 2010; Laube et al, 2006). В конечном итоге вновь сгенерированные кардиальные миоциты функционально интегрировали с предсуществующим миокардом. Сердце обнаруживало лишь незначительные остаточные доказательства повреждения, демонстрируя полную кардиальную регенерацию.

Evidence for heart regeneration in mammals

Во время эмбрионального развития и раннего постнатального периода мыши также демонстрируют удивительную способность к регенерации. Эмбрионы, гетерозиготные по специфической для кардиальных миоцитов нулевой мутации по Х-сцепленному гену holocytochrome c synthase (Hccs) , демонстрируют замещение кардиальных миоцитов во время плодного развития (Drenckhahn et al, 2008): когда одна из двух X хромосом случайно инактивируется в каждой соматической клетке самок, приблизительно 50% кардиальных миоцитов представлено Hccs-нулевыми и, следовательно, не функциональны. Пролиферативные функциональные Hccs-экспрессирующие кардиальные миоциты компенсируют нефункциональные Hccs-нулевые миоциты, так что при рождении 90% сердца происходит из миоцитов, содержащих один функциональный Hccs аллеь. Сходная пластичность у постнатальных мышей ограничена первой неделей после рождения; удаление верхушки приводит к пролиферации миоцитов и структурному восстановлению, сходному с регенерацией у рыбок данио и тритонов (Porrello et al, 2011). После этого, однако, поврежденный миокард в основном замещался фиброзом и рубцами. Действительно ли сердце взрослых млекопитающих неспособно к замещению кардиальных миоцитов или оно всё же сохраняет на низком уровне способность к репарации, это фундаментально важно, поскольку даже оборот миоцитов на низком уровне открывает спектр умножения, отвечающий за исцеление. Поэтому важны доказательства, подтверждающие мнение о большей пластичности сердца млекопитающих.

Первые аргументами против парадигмы о терминально дифференцированных молчащих кардиальных миоцитах получены декаду тому назад; всё увеличивающаяся сила этих аргументов отражает появление новых данных, ставших возможными благодаря методологическим инновациям. Ранние доказательства подтвердили пластичность кардиальных миоцитов, благодаря математическому моделированию популяции миоцитов, базируясь на цитометрических показателях. Напр., измеренный средний объём увеличения кардиальных миоцитов позволил подсчитать, что он оказывается несоответствующим предсказываемому увеличению, наблюдаемому по изменению объема целого сердца (Astorri et al, 1971). Эти данные и сходный анализ, базирующийся на содержании ДНК показывают, что изменения объема сердца не могут быть объяснены только гипертрофией и что гиперплазия кардиальных миоцитов (увеличение количества клеток) вносит вклад в изменения массы сердца. Однако эти исследования не были широко восприняты, т.к. их заключения базировались на ряде предположений о размерах миоцитов и содержимого ДНК.

Современный микроскопический анализ с детекцией маркеров клеточного цикла, таких как Ki67, или включения нуклеотидных аналогов (напр., iododeoxyuridine или 3H-thymidine) во вновь синтезируемую ДНК подтвердил мнение, что сердце млекопитающих может генерировать новые миоциты как во время нормального гомеостаза, так и после повреждений. Многие исследования продемонстрировали, что мышиные и человеческие кардиальные миоциты могут вступать в клеточный цикл, но описываемые скорости этого феномена отличаются более чем на порядок величин (Beltrami et al, 2001; Kajstura et al, 2010a, b; Soonpaa & Field, 1997).

Недавние эксперименты, сделались возможными путем тестирования ядерного оружия в средине 20th столетия, предоставив наиболее убедительные доказательства оборота постнатальных кардиальных миоцитов человека. После Partial Test Ban Treaty в 1963, заметное возрастание уровней атмосферного ¹⁴C, рассеяны в качестве биосферой абсорбированного углерода. Т.о., период ядерных испытаний служит историческим пульсовым мечением ДНК, а период после запрещения испытаний служит для отслеживания. Геномная ДНК клеток, сгенерированных во время или пульсового воздействия или отслеживания, отражает концентрацию в земной атмосфере ¹⁴C в тот момент времени, это позволило исследователям датировать возраст кардиальных миоцитов путем измерения концентрации ¹⁴C в их ядрах (Bergmann et al, 2009). Это показало, что взрослое сердца содержит некоторые кардиальные миоциты, сгенерированные во время периода жизни человека; их модель предсказала приблизительную скорость оборота в 1% в год в возрасте 25, и её снижение до 0.45% в возрасте 75.

Данные, полученные с помощью этих разнообразных технологий подтверждают мнение, что сердце млекопитающих обладает законсервированной некоторой способностью к обороту кардиальных миоцитов, хотя существуют затяжные споры о возможностях сердец млекопитающих к эндогенной регенеративной способности. Исследования, базирующиеся на идентификации митотических кардиальных миоцитов (Kajstura et al, 1998), иммунодетекции маркеров клеточного цикла, таких как Ki67 (Beltrami et al, 2001) или инкорпорации IdU во вновь синтезированную ДНК (Kajstura et al, 2010b), подтвердили, что почти 30% сердца может быть замещено в течение 1 года во время нормального гомеостаза, эта скорость увеличивается в 50-раз после повреждения. Эти удивительно высокие скорости показывают, что всё сердце замещается приблизительно каждые три года во время нормального гомеостаза и что все кардиальные миоциты, потерянные во время инфаркта могут быть замещены в течение 3-х недель. Напротив, данные исследований после ядерных испытаний, (Bergmann et al, 2009) и количественные исследования синтеза ДНК с использованием ауторадиографических измерений включения 3H-thymidine (Soonpaa & Field, 1997) указывают на скорость оборота в 1% или менее в год.

Действительная шкала эндогенной регенеративной реакции имеет важное значение для разработки рациональной терапии. Если скорость оборота относительно низкая, то терапевтические вмешательства д. сконцентрироваться на замещении потерянных или нефункциональных миоцитов. Если же сердце млекопитающих в самом деле обладет мощной прирожденной способностью к переполнению миоцитами, то терапия д. сконцентрироваться на сдвиге со сборки эндогенно сгенерированных миоцитов в функциональный миокард. Т.о., в контексте расхождений между доказательствами истинной шкалы эндогенной регенерации у млекопитающих, важно оценить потенциальные источники прирожденной склонности существующих методологий, которые используются для изучения судеб клеток.

Трудности измерений оборота кардиальных миоцитов в сердца в основном связаны с низкой скоростью оборота миоцитов в сравнении с соседними стромальными клетками (Bergmann et al, 2009). В течение промежутка времени, который практически непосредственно измеряет генерацию кардиальных миоцитов, число новорожденных клеток (вычислитель) намного меньше, чем общее количество клеток (знаменатель). Как результат небольшие ошибки могут умножать предполагаемые показатели абсолютного ежегодного или в течение всей жизни оборота миоцитов. Др. источником ошибок является случайная неправильна идентификация клеточных компонентов, которая является неминуемым следствием анализа трехмерных органов с помощью двумерных тканевых срезов, особенно, если базироваться на световой микроскопии, которая обладает ограниченной достоверностью выделения клеточных границ в сложной ткани, подобной сердцу (Laflamme & Murry, 2005). Проблема возрастает при аутофлюоресценции миокарда, которая осложняет любой метод, который базируется на детекции флюоресцентного сигнала, включая детекцию аналогов нуклеотидов, Ki67 или флюоресцентных меток, используемых в экспериментах по картированию генетических клонов.

Такие потенциальные возмущения могут также затрагивать и метод с датированием ¹⁴C, поскольку необходимо выделять ядра кардиальных миоцитов путем переваривания и сортировать с помощью проточной цитометрии. isolation of cardiac myocyte nuclei by digestion and flow cytometric sorting. Любые примеси в препаратах изолированных ядер могут вносить отклонения в анализ; предпочтительное выделение старых миоцитов может приводить к недооценке оборота миоцитов, тогда как загрязненные ядерные изоляты, которые включают ядра не-миоцитов приведут к переоценке.

Сердце также представяет уникальные затруднения по сравнению с др. органами из-за склонности кардиальных миоцитов синтезировать ДНК во время S-фазы без завершения митоза и/или цитокинеза (Fig 1). Во время раннего постнатального развития, напр., большинство кардиальных миоцитов грызунов (Li et al, 1996) и около 25-57% кардиальных миоцитов человека (Olivetti et al, 1996; Schmid & Pfitzer, 1985) становятся двуядерными. При созревании большинство кардиальных миоцитов становится полиплоидным с , по крайней мере, одним (4n: tetraploid) или двумя (8n: octoploid) дополнительными раундами репликации хромосом (Bergmann et al, 2010). Хотя некоторые исследования продемонстрировали, что величина пула кардиальных миоцитов не меняется с возрастом или при повреждениях (Olivetti et al, 1996), др. указывают, что состояние плоидности более динамично. Состояние плоидности кардиальных миоцитов может увеличиваться при гипертрофии миокарда или повреждениях (Adler & Friedburg, 1986), это может быть ошибочно принято за деления миоцитов. Напротив, сердца, которые были недогружены при имплантации вентрикулярного вспомогающего устройства, могут иметь меньший процент полиплоидных миоцитов, поскольку генерируется больше 2n кардиальных миоцитов (Wohlschlaeger et al, 2010). Эти аспекты биологии кардиальных миоцитов неминуемо будут вносить ошибки, это необходимо учитывать при любой количественной оценке образования кардиальных миоцитов. Как и при любой противоречивой гипотезе, достижение консенсуса относительно оборота кардиальных миоцитов у взрослых будет скорее всего достигнуто по многим линиям доказательства с использованием множественных различных методологий.

Defining the cellular source of new cardiac myocytes

Большинство сообщений указывает на определенную эндогенную способность к обновлению кардиальных миоцитов, они генерируют широкий фокус находок клеточных источников вновь возникающих кардиальных миоцитов. Три основные пути генерации новых кардиальных миоцитов: деление предсуществующих зрелых кардиальных миоцитов (Kajstura et al, 1998), амплификация дедифференцированных кардиальных миоцитов (Jopling et al, 2010; Kikuchi et al, 2010) и дифференцировка клеток предшественников (Hsieh et al, 2007). Существуют доказательства для всех трех процессов у разных видов и при разных условиях. Возможно, что более одного механизма может оперировать у данного вида на разных стадиях развития или патологического процесса.

Хотя имеется множество сообщений о делении зрелых кардиальных миоцитов у взрослых млекопитающих , большинство из них указывает, что это редкое событие. Это не удивительно, учитывая плотность упаковки и высоко организованный саркомерный контрактильный аппарат. Фактически репликации кардиальных миоцитов после повреждения у новорожденных мышей, тритонов и рыбок данио предшествуют молекулярные и/или цитоскелетные доказательства дедифференцировки (Jopling et al, 2010; Kikuchi et al, 2010; Oberpriller & Oberpriller, 1974; Porrello et al, 2011). Кардиальные миоциты вблизи места повреждения могут снова начать экспрессировать генные маркеры незрелости, подобные транскрипционному фактору цинковые пальчики GATA binding protein-4 (GATA4), одновременно с разборкой саркомерной структуры, что видно с помощью ЭМ. Эта популяция дедифференцированных кардиальных миоцитов экспрессирует маркеры синтеза ДНК во время пролиферативной фазы перед повторной дифференцировкой в зрелые кардиальные миоциты.

Вновь сгенерированные взрослые кардиальные миоциты млекопитающих могут возникать из эндогенного пула клеток предшественников после повреждения. В нашей лаборатории разработан подход по картированию генетических клонов для количественной оценки оборота кардиальных миоцитов, зависимого от предшественников (Fig 2) (Hsieh et al, 2007). У дважды трансгенных MerCreMer/ZEG мышей с индуцибельным репортером кардиальных миоцитов зрелые кардиальные миоциты подвергаются обратимому генетическому переключению с конституитивной экспрессии β-galactosidase на экспрессию green fluorescent protein (GFP) после пульсового воздействия tamoxifen. Во время chase периода, мы оценивали эффект повреждения миокарда на пропорцию GFP⁺ или β-gal⁺ кардиальных миоцитов. Повышенное кровяное давление или инфаркт миокарда приводили к достоверному снижению процента GFP⁺ кардиальных миоцитов и соотв. к увеличению процента β-gal⁺ кардиальных миоцитов, в соответствии с переполнением пула миоцитов с помощью β-gal-экcпрессируемых предшественников. С помощью этого подхода теоретически можно определить суммарный вклад предшественников в оборот миоцитов, он не может непосредственно идентифицировать молекулярные характеристики или анатомическую локализацию пула предшественников.

Одним из подходов для характеристики молекулярного фенотипа кардиальных предшественников является изучение развития эмбрионального сердца, исходя из предположения, что парадигмы развития воспроизводятся во время постнатальной репарации. Когда мы исследовали с помощью онтогенетической линзы, то возникла детальная картина растворимых и транскрипционных сигналов, которые управляют кардиогенной программой от гаструляции (образования разных зародышевых слоёв) до окончательного созревания кардиальных миоцитов (Mercola et al, 2011; Yi et al, 2010). Индукция экспрессии mesoderm posterior (MESP)-1 с помощью brachyury-экспрессирующих примитивных мезодермальных клеток является настоятельной потребностью для окончательной продукции дифференцированных сердечных клеток (Bondue et al, 2008; David et al, 2008; Lindsley et al, 2008). По мере роста развивающегося эмбриона после фазы образования зародышевых листков, его развивающееся сердца получает клетки из разных анатомических источников предшественников: 1st и 2nd поля сердца создают большую часть миокарда, с некоторым вкладом из предшественников эпикарда. Определенные поля могут быть преимущественно маркированы специфическими транскрипционными факторами; напр., первое поле сердца с помощью T-box transcription factor 5 (Tbx5) (Takeuchi et al, 2003), второе поле сердца с помощью Lim-homeodomain protein Islet1 (Isl1) (Cai et al, 2003) и эпикардиальные предшественники с помощью Wilms tumour-1 (WT1) или T-box transcription factor 18 (Tbx18) (Cai et al, 2008; Zhou et al, 2008). Др. кардиогенные факторы, идентифицированы с помощью отслеживания эмбриональных клонов или анализа молчания генов, включая гомеобоксный белок nkx2.5 (Wu et al, 2006), myocyte enhancer factor 2C (Mef2c) (Lin et al, 1997) и GATA4 (Molkentin et al, 1997).

В противоположность относительно хорошо известному пренатальному развитию, нет согласия относительно молекулярных характеристик постнатальных клеток кардиальных предшественников у млекопитающих или 'взрослых кардиальных стволовых клеток'. В ряде лаб. идентифицированы популяции клеток у постнатальных мышей, которые удовлетворяют некоторым критериям кардиальных предшественников. Распространенным подходом в таких исследованиях является ферментативно переваренная миокардиальная ткань и изоляция специфических клеточных популяций, исходя из экспрессии генов важных дя развития (isl-1(Laugwitz et al, 2005)), специфического профиля рецепторов клеточной поверхности (c-kit (Beltrami et al, 2003) или sca-1 (Oh et al, 2003)), физиологической способности активно исключать окраску Hoechst (т.наз побочные популяции клеток (Martin et al, 2004)) или исходя из роста типичных сферических колоний в тканевой культуре (Messina et al, 2004; Smith et al, 2007) (Fig 3). В целом метка 'кардиальных стволовых клеток' происходит из наблюдения само-размножения и трансдифференцировки в кардиальные миоциты, после воздействия кардиогенными условиями in vitro или когда они поставляются in vivo после повреждения.

Кажется невероятным, что орган с такой ограниченной регенеративной способностью будет обладать столь многими биологическим отличающимися предшественниками (Laflamme & Murry, 2011; Mercola et al, 2011). В конечном счете поле будет очевидным из тщательного in vivo отслеживания клонов-без ex vivo ступеней культивирования-чтобы изучить если и как данный тип клеток вносит вклад в пополнение кардиальных миоцитов во время или нормального гомеостаза или после повреждения (Fig 2). Отсутствие таких публикаций, кстати, д.б. частично связано с отсутствием специфичности большинства маркеров стволовых клеток, или из-за того, что они экспрессируются также не кардиоваскулярными клетками/предшественниками или из-за того, что ни могут частично испытывать индуцированную стрессом реактивацию 'плодных генных программ', феномен, который хорошо документирован во взрослых кардиальных миоцитах (Bisping et al, 2006; Kolodziejczyk et al, 1999; Saadane et al, 1999).

Moving towards a regenerative therapy

Пластичность сердца млекопитающих и идентификация клеточных приспособлений, которые демонстрируют потенциал кардиальной дифференцировки, возбудили усилия по разработке регенеративных терапевтических стратегий. Затруднения для терапии существенны: обычный крупный инфаркт миокарда, который ведет к сердечной недостаточности убивает около 1 биллиона кардиальных миоцитов (Laflamme & Murry, 2005), приблизительно четверть миоцитов сердца (Fig 4). Возможным терапевтическим подходом д.б. задабривание популяции эндогенных стволовых клеток или экзогенно осуществляемая клеточная терапия для замещения потерянных кардиальных миоцитов скоординировано с длительно действующей функциональной интеграцией. Среди мириадов потенциальных клеточных терапий, нет четкой выигрышной стратегии (Segers & Lee, 2008).

Bone marrow derived progenitors

Серии почти одновременных бросающихся в глаза исследований вызвали азарт получения кардиогенных предшественников от взрослых из источников вне сердца. Исследования post-mortem сердец мужчин с сердечным трансплантантом, которые получили сердце от доноров женщин показали, что приблизительно 10% из ?-саркомерных актин-позитивных кардиальных миоцитов имели Y хромосомы. Эти клетки безусловно происходили от самого пациента, из циркулирующих предшественников вне сердечного трансплантата (Quaini et al, 2002). Два др. современных исследования установили, что источником циркулирующих предшественников может быть костный мозг. В обоих случаях популяция клеток костного мозга обнаруживала высокую плотность рецептора клеточной поверхности c-kit, демонстрируя повторное заселение мышиных кардиальных миоцитов после экспериментального инфаркта миокарда (Jackson et al, 2001; Orlic et al, 2001). После этих первоначальных работ в ряде работ не удалось продемонстрировать сходные величины химеризма в трансплантированных сердцах (Deb et al, 2003; Hocht-Zeisberg et al, 2004; Laflamme et al, 2002; Muller et al, 2002) или потенциал стволовых клеток костного мозга (Balsam et al, 2004; Murry et al, 2004), это привело к некоему постулату, что трансдифференцировка кардиальных миоцитов переоценена из-за артефакта (Laflamme & Murry, 2005).

Ntv не менее, некоторые терапевтические наблюдались даже в исследованиях, не выявляющих трансдифференцировки (Balsam et al, 2004). Клеточная терапия с использованием аутологичных предшественников из костного мозга быстро перешла в клинику для лечения ишемической болезни сердца человека. Ряд рандомизированных испытаний с использованием моноядерных клеток костного мозга был предпринят и большинство исследований продемонстрировало скромное улучшение от клеточной терапии вентрикулярной функции. В наиболее крупном исследовании повторных введений обогащенных клетками предшественниками и в исследованиях по ремоделированию инфаркта AMI (REPAIR-AMI) (Schachinger et al, 2006), 204 рандомизированных пациента с острым инфарктом миокарда получали внутрикоронарно клетки костного мозга или плацебо. Спустя год было продемонстрировано достоверное улучшение как кардиальной функции, так и снижение смертности, повторных инфарктов миокарда или каких-либо revascularization процедур. Напротив, анализ данных спустя 18-мес. после сходных введений костного мозга в исследовании для улучшения шансов ST-подъема постинфарктной регенерации (BOOST) (Meyer et al, 2006), установили затухание ранних улучшений вентрикулярной функции. Однако, стоит отметить, что хотя улучшения вентрикулярной функции были скромными, не было обнаружено побочных эффектов в этих испытаниях.

Происходящие из костного мозга мезенхимные стволовые клетки также стали предметом клинических исследований. Эти клетки, получали из выборок костного мозга, которые проходили несколько пассажей и культивировались на пластике. Посредством традиционно используемого определения их способности к трехклональной (trilineage) дифференцировке в остеобласты, хондроциты и адипоциты, мезенхимные стволовые клетки также обнаруживали доказательства дифференцировки в кардиальные миоциты как in vitro в некоторых культуральных условиях, так и когда доставлялись после инфаркта миокарда у мышей (Toma et al, 2002). Учитывая эту их тенденцию к избеганию отторжения благодаря 'immune privilege', эти клетки были применены у людей в качестве аллогенного лечения инфаркта миокарда (Hare et al, 2009). Первоначальные клинические оценки согласовались с испытаниями, использовавшими моноядерные клетки костного мозга: пациенты ощущали некоторое улучшение вентрикулярной функции с легким снижением симптомов сердечной недостаточности. В целом, оценки такой клеточной терапии у человека не подтвердили широко распространенной адаптации в этот период, учитывая незначительные улучшения, недостаточность надежных данных и предвидимые затраты контроля качества, не сделали этот способ общераспространенным.

Endogenous cardiac progenitors

С момента первоначального предположения, что сердце млекопитающих может содержать эндогенную популяцию клеток предшественников (Beltrami et al, 2003), велись активные дискуссии о терапевтическом потенциале этих клеток. Имеется ряд теоретических преимуществ этого подхода. Аутологичный перенос осуществим, даже если будет необходимо ex vivo подращивание с учетом небольшого количества стволовых клеток в биоптатах сердца. Более того, по сравнению с клетками, изолированными из не кардиальной ткани, предшественники, происходящие из самого сердца теоретически частично пре-программированы к дифференцировке в сердечные клетки. Однако, некоторые сообщения фактически поставили под вопрос прирожденные свойства стволовых клеток для некоторых эндогенных предшественников от взрослых, включая 'stemness' взрослых кардиальных c-kit⁺ клеток (Tallini et al, 2009) и клеток, происходящих из кардиосфер (Andersen et al, 2009), оба типа были использованы в клинических испытаниях. Возможно, что проводимые сейчас испытания с этими предполагаемыми эндогенными кардиальными предшественниками, продемонстрируют улучшение кардиальной функции, но это не обязательно будет указывать на дифференцировку в кардиальные миоциты.

Pluripotent stem cells

Эмбриональные стволовые (ES) представляют собой прототипические стволовые клетки с признаками клоногенности, самообновления и плюрипотентности. Потенциал этих клеток представляет также реальную угрозу. учитывая их тенденцию давать тератомы (Amariglio et al, 2009). Одним из подходов для преодоления этой препятствующей проблемы были получены предшественники. происходящие из плюрипотентных клеток, которые уже детерминированы к кардиогенному пути. В качестве примера такой стратегии, клетки с профилем экспрессии Oct4, stage-specific embryonic antigen 1 (SSEA-1) и MESP1 демонстрируют некоторую регенеративную потенцию, после терапевтического введения в модели инфаркта у приматов, без обнаружимого образования тератом (Blin et al, in press). Можно представить сходную стратегию с использованием кардиогенных промежуточных клеток, экспрессирующих любой из ранее упомянутых транскрипционных факторов, ассоциированных с кардиальными предшественниками, или маркер клеточной поверхности, такой как рецептор сосудистого эндотелиального ростового фактора (Flk1/KDR) (Yang et al, 2008). Пока, такая стратегия д. сначала продемонстрировать как существенное преклиническое улучшение без туморогенности прежде, чем трансплантировать человеку. Если будет соответствие таким критериям, то ES-клеточная терапия будет иметь потенциал, предоставляемый 'пригодным к использованию' кардиальным миоцитам для лечения острого инфаркта миокарда или хронической сердечной недостаточности.

Второй подход, которые также может избавить от риска тератом, это генерация чистой популяции происходящих из ES кардиальных миоцитов для терапевтического введения или в виде клеточной суспензии или после ex vivo тканевого преобразования. Имеется уже огромный прогресс в определении факторов и транскрипционных сигналов для дифференцировки кардиальных миоцитов из ES клеток. Исходя из детального обсуждения (Noseda et al, 2011), развитие кардиальных миоцитов зависит от временно и дозово-зависимой экспозиции серии ростовых факторов из семейств wingless-типа MMTV integration site (Wnt), fibroblast growth factor (FGF), bone morphogenetic protein (BMP) и nodal. Базируясь на этой механистической информации, некоторые лаб., успешно генерировали ES-производные препараты с более чем 50% функциональных кардиальных миоцитов (Laflamme et al, 2007; Yang et al, 2008). Из-за прирожденных технических затруднений введение достаточных количеств дифференцированных кардиальных миоцитов-не учитывая гарантию их жизнеспособности и электромеханической интеграции-наиболее реальным будущим для таких технических успехов может стать неограниченный источник кардиальных миоцитов для получения миокардиальных трансплантатов.

Генерация induced pluripotent stem (iPS) может преодолеть два важных ограничения ES клеток: этические проблемы, связанные с получением ES клеток от эмбрионов и отторжением трансплантатов иммунной системой пациента, поскольку iPS клетки может быть искусственно получены из стромальных клеток пациента, пригодных к аутологической трансплантации. Недавние демонстрации повышенной иммуногенности сингенных трансплантированных iPS клеток, однако указывают на то, что иммунную систему не стоит не учитывать при разработке iPS-based терапии (Zhao et al, 2011).

Первоначальные протоколы генерации iPS клеток использовали ретровирусами поддерживаемую экспрессию 4-х генов стволовых клеток (Takahashi & Yamanaka, 2006; Yu et al, 2007). Поскольку вирусами репрограммированные клетки могут обладать ассоциированным риском неопластических превращений, то необходимы альтернативные стратегии репрограммирования, такие как использование малых молекул (Shi et al, 2008), или подходы не вирусной модификации генов (Warren et al, 2010) для любой будущей терапевтической стратегии. Однако наиболее важным уроком этих исследований может быть удивительная пластичность даже наиболее терминально дифференцированных клеток после воздействия правильной комбинации сигналов.

Tissue engineering

Со стволовыми клетками в качестве потенциального неограниченного источника кардиальных миоцитов, преобразование ex vivo миокардиальных трансплантатов по теории д. служить ещё одним терапевтическим подходом. Наиболее клинически пригодной для тканевого engineering является тонкая, простая, относительно бессосудистая ткань, такая как в трахее (Macchiarini et al, 2008). Из-за сложности и физиологической потребности функциональной миокардиальной ткани, многочисленные источники только кардиальных миоцитов недостаточны для создания клинически пригодных трансплантатов. Исторически наибольшим затруднением при тканевом инжениринге является адекватное поступление кислорода и питательных веществ для метаболически активной ткани, такой как сердца. Одним из подходов стало создание тонких кардиальных слоёв. которые может быть затем сложены для доставки in vivo (Shimizu et al, 2002). Хотя эти многослойные листки демонстрируют некоторую степень электромеханической координации и образования новых сосудов in vivo, пока остается неясным, могут ли быть такие подходы оптимизированы, чтобы давать полной толщины миокард с адекватным кровоснабжением. Добавление не миоцитарных клеточных компонентов, таких как фибробласты и эндотелиальные клетки, д. приводить к формированию примитивной сосудистой структуры внутри сконструированных трансплантатов, но электромеханические свойства недостаточны для нормального функционирования (Stevens et al, 2009). В конечном итоге успех в конструировании функционального, полной толщины миокарда буде, скорее всего, возможен только если будет решена проблема васкуляризации (Zimmermann et al, 2006).

Circumventing cell-based therapy with pharmacoregeneration?

Трудно представить, что одиночное фармакологическое вмешательство может привести к полной репарации сердца, но ряд недавних открытий подтверждает концепцию, что паракринные сигналы могут активировать механизмы репарации в сердце. В общем, разработка малых молекул или базирующаяся на белках терапия открывает относительно скромные проблемы с контролем качества по сравнению с клеточной терапией. Следовательно, фармакорегенеративные подходы могут оказаться более практичными в ближайшее время подходами, способствующими репарации сердца.

Наиболее ошеломляющим подтверждающим принцип подходом к генерации кардиальных миоцитов стала недавняя трансформация резидентных кардиальных фибробластов в кардиальные миоциты (Ieda et al, 2010). Сходные протоколы для генерации iPS клеток, форсировали экспрессию в кардиальных фибробластах трех генов-GATA4, MEF2C и TBX5-вызывая экспрессию специфичного для кардиальных миоцитов промотора myosin heavy chain 6 (Myh6) у приблизительно 20% клеток и к спонтанным биениям приблизительно у 1% репрограммированных клеток. Если изолированные кардиальные фибробласты инфицировали вирусами. несущими гены, кодирующие три репрограммирующих фактора и повторно вносили в сердце в течение 24 ч, то некоторые непосредственно трансформировались в кардиальные миоциты. Хотя этот подход пока в зачаточном состоянии, предполагается существование возможности, что фибробласты, многочисленные в постинфарктных рубцах будут трансформироваться в функциональный миокард посредством репрограммирования.

Наиболее реалистичной ближайшей целью может стать эксплуатация передачи паракринных, чтобы умножить существующую эндогенную регенеративную реакцию. Недавние эксперименты с трансплантациями клеток, проведенные в нашей лаб., с использованием индуцибельной cre-based генетической линии в качестве подхода картирования, проверили гипотезу, что клеточная терапия может оказывать про-регенеративные эффекты посредством паракринного механизма (Loffredo et al, 2011) (Fig 5). В соответствии с некоторыми предыдущими исследованиями (Balsam et al, 2004; Murry et al, 2004), мы не получили доказательств трансдифференцировки экзогенно вводимых клеток костного мозга в кардиальные миоциты. Однако мы установили повышенную генерацию кардиальных миоцитов из эндогенных источников у мышей, которым вводили c-kit⁺ клетки костного мозга, но не мезенхимные стволовые клетки. Эти находки подтверждают передачу паракринных сигналов между экзогенно введенными клетками и эндогенными резидентными предшественниками. Это кажется рациональным для терапевтического вмешательства с целью активации предшественников или рекрутирования их из их ниш к месту повреждения (Steinhauser & Lee, 2009). Один из таких подходов связан с использованием пептида thymosin ?4, который, по-видимому, индуцирует эпикардиальные клетки, экспрессирующие WT-1, к дифференцировке в кардиальные миоцитов de novo (Smart et al, 2011). Интересно, что WT-1⁺ клетки, по-видимому, не дифференцируются в кардиальные миоциты у взрослых мышей без предварительной обработки с помощью thymosin ?4, что указывает на вовлечение в механизм репрограммирования.

Альтернативой к генерации миоцитов с помощью фармакологических средств является использование стимуляции для вступления в клеточный цикл предсущестующих кардиальных миоцитов. Ингибирование p38 MAP киназы увеличивает митотическую активность кардиальных миоцитов (Engel et al, 2005), хотя одновременно необходим фактор роста (FGF1) для достижения заметного улучшения кардиальной функции (Engel et al, 2006). Применение ростового фактора neuregulin-1 стимулирует зрелые кардиальные миоциты к делениям in vitro, будучи трансплантированными вызывают скромное увеличение делений моноядерных кардиальных миоцитов in vivo после систематического введения neuregulin (Bersell et al, 2009). Сходное стимулирование митозов кардиальных миоцитов наблюдается после продолжительного введения periostin (Kuhn et al, 2007), сигнального белка внеклеточного матрикса; однако эффект не был воспроизведен на трансгенной модели с избыточной экспрессией periostin (Lorts et al, 2009).

Хотя область регенеративной кардиологии прежде всего фокусируется на клетках предшественниках, эти данные указывают на то, что контроль митотической активности моноядерных кардиальных миоцитов может предоставить дополнительный подход к пополнению кардиальных миоцитов. Основное беспокойство с терапией системными ростовыми факторами связано с потенциалом митогенных эффектов, которые могут повлиять на др. органы. Т.о., будущее фармакологической регенерации может заключаться в локальном введении сконструированных белков и малых молекул, которые затрагивают пути специфического выживания, роста и дифференцировки.

Future directions

In this review, we have described the current status of research on cardiac regeneration, highlighting important recent discoveries and ongoing controversies. The initial hope that a cell progenitor would emerge with the capacity to regenerate the injured mammalian heart in the same manner that bone marrow may be reconstituted has not been realized in animal studies or randomized clinical studies. Even if some studies have questioned the regenerative potency of various endogenous progenitor populations, it is clearly feasible to reprogramme many cell types to differentiate into cardiomyocytes. Interestingly, evolving notions of cellular plasticity may ultimately help to explain the frustration that many in the field have experienced when attempting to replicate the findings of landmark studies or when trying to demonstrate progenitor activity in vivo. It may well turn out that ex vivo progenitor cultures undergo epigenetic changes that affect cell fate, and that such modifications could account for some of the stem-like properties attributed to endogenous progenitors.

There is reason for optimism for a regenerative medicine approach to heart failure, given the intense research efforts and the capacity of higher organisms, including the neonatal mouse, to regenerate myocardium. Perhaps the most important issue in this field is identifying which findings are consistently supported by multiple experimental approaches. Ultimately, the findings that are easily reproduced by most or all laboratories will most likely benefit patients.

Pending issues

Dissect the mechanistic differences between adult mammals with limited regenerative capacity and organisms, such as neonatal mice, zebrafish and newts, that demonstrate unambiguous cardiac myocyte regeneration. Understanding these differences may reveal new pathways that can be therapeutically targeted to achieve more robust regeneration.

Complete molecular and functional characterization of endogenous cardiac myocyte progenitors. Multiple laboratories have isolated progenitors from the heart with different molecular characteristics. What are the in vivo functional roles of these progenitors? Do the observed molecular differences between these isolated cells represent functionally distinct cell types?

Identify paracrine signalling pathways responsible for activation and recruitment of endogenous cardiac myocyte progenitors. This may facilitate a pharmacoregenerative therapy, in which treatment with a protein or small molecule would hold the promise of amplifying endogenous regeneration.

Refine reprogramming strategies to more efficiently produce mature cardiac myocytes, both in vitro and in vivo. The ultimate bioengineering goal is to produce a pure population of mature, fully functional cardiac myocytes for ex vivo tissue engineering (or) to control the proliferation and differentiation of endogenous cell populations or exogenously delivered cell therapies such that scar tissue is replaced by myocardium. These different strategies are unified by an underlying requirement to understand the fundamental pathways involved in cardiac myocyte differentiation and

For more information

ISSCR Patient Handbook on Stem Cell Therapies
http://www.isscr.org/clinical_trans/pdfs/ISSCRPatientHandbook.pdf

Understanding Stem Cells: Overview from National Academy of Science
http://www.dels.nas.edu/bls/stemcells/

National Institutes of Health Stem Cell Information
http://stemcells.nih.gov/

Stem Cell Research and Applications
http://www.aaas.org/spp/sfrl/projects/stem/main.htm

Stem Cell Information
http://www.tellmeaboutstemcells.org/

Stem Cell Resources
http://www.stemcellresources.org/

Stem Cell Therapies
http://www.closerlookatstemcells.org/

Regeneration of the heartMatthew L. Steinhauser, Richard T. Lee EMBO Molecular Medicine Volume 3, Issue 12, pages 701–712, December 2011.

Regeneration of the heart
Matthew L. Steinhauser, Richard T. Lee
EMBO Molecular Medicine Volume 3, Issue 12, pages 701–712, December 2011.