Structure

Шпилечная структура является одним из наиболее распространенных вторичных структурных элементов РНК (ribonucleic acid), при этом шпильки РНК играют важную структурную и функциональную роль в обеспечении мест становления (nucleation) РНК для укладки, структурного каркаса и места распознавания как белков, так и нуклеиновых кислот. Tetraloops (из четырех нуклеотидов петли, часто появляются в молекулах РНК и объясняют приблизительно 55% всех шпилечных петель в рибосомальной РНК (rRNA) у Escherichia coli. Тетрапетли rRNA сильно ограничены в последовательностях и приблизительно 70% последовательностей петель из четырех нуклеотидов принадлежат семействам UNCG или GNRA, где N это любой нуклеотид, а R является пурином. Эти частоты появления из четырех нуклеотидов петель обнаруживают более высокую термальную стабильность, чем др. петли из 4-х нуклеотидов с тем же самым стволом (stem).

Большинство из четырех нуклеотидов петель РНК формирует компактные и стабильные структуры, которые участвуют в необычных взаимодействиях основание-основание основание-сахар, основание-фосфат и сахар-фосфат. Кроме того, сложение оснований (base stacking) расширяет область петли. Тетрапетли UUCG, GCAA и CUUG , напр., содержат U-G, G-A и C-G пары оснований. соотв., позволяя входить двум сильно ограниченным (constrained) нуклеотидам в петлю. Фактически эти петли следует рассматривать как мини петли, т.к. они имеют только два нуклеотида в петле, но мы будем называть их четвертичными петлями за их постоянство. Структурные характеристики из четырех нуклеотидов петель суммированы в Table 1.

Table 1. Structural characteristics of tetraloops

UNCG

Последовательность UNCG часто обнаруживается в петлях из четырех нуклеотидов РНК и может служить местом nucleation укладки РНК и в качестве сайта связывания белка. Шпильки, содержащие UNCG тетрапетли обладают чрезвычайно высокой термальной стабильностью. При высоком разрешении high-resolution nuclear magnetic resonance (NMR) структура UUCG шпильки (Cheong et al., 1990), обнаруживает необычные взаимодействия основание-основание, основание-сахар основание фосфат (Figure 1 и Figure 2a). Четвертый G находится в syn конформации. 3'-endo/syn конформация четвертого G подтверждена также с помощью Raman спектроскопии. Базируясь на идентификации 2'-OH первого U и нескольких nuclear Overhauser effects (NOEs), Allain and Varani (1995) предположили, что образуется водородный мостик между 2'-OH первого U и O₆ четвертого G (Figure 1g). Первое и четвертое основания взаимодействуют с раздвоенным водородным мостиком между первой U carbonyl группой и imino и amino группами четвертого G (Figure 1d). Существование этих водородных мостиков подтверждается данными по ultraviolet (UV) плавлению UNCG из четырех нуклеотидов петель, при этом присутствие 2'-OH групп в петле и NH2 группы в четвертом G необходимо для необычной стабильности. Однако , неограниченная стимуляция молекулярной динамики в водном боксе указывает, что предпочтительным акцептором водородного мостика для первой U 2'-OH группы является UpU остова атом кислорода (O5?) и в четвертом G O6 атом оказывается водородом связанным с молекулой воды. Изгиб остова, происходит между первым и вторым нуклеотидами и стабилизируется с помощью основание-фосфат водородного мостика между третьим C amino и вторым U 5;-phosphate (Figure 1k). Этот основание-фосфат водородный мостик делает третий C наложенным на первый U. Второй U и третий C принимают C2'-endo sugar конформацию, которая удлиняет фосфатный остов, чтобы помочь соединить его со стволом (stem). Второй U, по-видимому, неупорядочен и обнаруживает мало взаимодействий с др. нуклеотидами в петле.

Figure 1. Hydrogen bonds found in tetraloop structures. (a) and (b) Watson–Crick and (c) GU wobble base pairs drawn for comparison. (d) Bifurcated hydrogen bond between the first U and the fourth G in UUCG tetraloop. (e) Sheared base pair found in GNRA tetraloops. (f) G·A mismatch found in the GNRN-like structure of the AMP–aptamer complex. (g)–(i) Ribose–base hydrogen bonds. The hydrogen bonds between 2ў-OH of the first U and O6 of the fourth G in UUCG (g) and between 2ў-OH of the first G and N7 of the third A in GCAA (h) tetraloops stabilize the backbone turn. The amino group of the fourth A and O2ў of the first G also makes a hydrogen bond in the GCAA (i) tetraloop. (j) Ribose–phosphate hydrogen bond found in the UGAA tetraloop. (k)–(n) Base–phosphate hydrogen bonds found in the UUCG (k), GNRA (l) and (m) and UGAA (n) tetraloops

GNRA

Шпилечные петли GNRA часто обнаруживаются в каталитических, фаговых и signal-recognition particle (SRP) РНК, а также в рРНК. GNRA и UNCG шпилечные петли, как полагают, эволюционно равнозначны. Структура GNRA (Jucker et al., 1996) обнаруживает множество сходств с таковой UNCG (Figure 2). Первый G и четвертый A формируют урезанную пару оснований (Figure 1e), приводя к возникновению петли только из двух оснований как и в случае UNCG. Наложение оснований в петле вытягивает третий A в 3' сторону. GNRA шпильки меняют направление фосфатного остова между первым и вторым нуклеотидом и этот поворот стабилизируется водородными мостиками основание-фосфат (Figure 1l) и рибоза-основание (Figure 1h). Все нуклеотиды в стволе и петле обнаруживаю антиконформацию в противоположность UNCG, где четвертый G находится в syn конформации. В GCAA четвертичной петле второй C менее упорядочен, чем остальные нуклеотиды в петле и не состыкован (stacked). Но в GAAA четвертичной петле, второй A, по-видимому, накладывается (stacked) на третий A остаток. Конформация сахара второго и третьего нуклеотида в GNRA четвертичной петле обнаруживает динамические изменения междуC2'-endo и C3'-endo.

Состыкованная пара оснований G·A (Figure 1e) широко распространена в природе. Watson-Crick faces гуанина и аденина доступны для третичных контактов. Взаимодействие основание-триплет является одним из примеров. Хотя четвертый A участвует во взаимодействии основание-основание, как полагают, четвертый A выставляет химически изменяемый отросток на временной шкале от микро- до миллисекунд. Jucker et al. (1996) предположили существование динамической сети водородных мостиков в этом регионе четвертичной петли, чтобы объяснить наблюдаемые вариации в растворенных структурах из нескольких GNRA из четырех нуклеотидов петель. Динамическая модель согласуется с T1 relaxation NMR данными по C8 атому в четвертом A.

GNRA-like Structures

Растворенные структуры boxB шпилек РНК, содежащих GACAA (Cai et al., 1998) и GAAGA (Legault et al., 1998) пентапетлю, образуют комплексы с транскрипционным антитерминационным N-пептидом из P22 и l, соотв. Связывание пептида в каждом случае стабилизирует структуру boxB РНК также как в тетрапетле GNRA. В пентапетле GACAA из boxB шпилечной РНК первый G и последний A образуют состыкованную G·A пару оснований (Figure 1e), которая стабилизируется водородными связями, обнаруживаемыми и в GNRA петлях. Все аденины в петле сложены (stacked) и эта укладка (stacking) стабилизирует структуру петли. Конформация сахара второго A и третьего C является C2'-endo. Третий нуклеотид GACAA изогнут в петлю, что обеспечивает ему обширные гидрофобные взаимодействия со связанным пептидом. out to make an extensive hydrophobic interaction with the bound peptide. Остаток аргинина связывает пептид образует водородные мостики с гуанином и соседним фосфатом остова. GAAGA пентапетля также образует GNRA-подобную складку, в которой четвертый нуклеотид вытесняется из петли, тогда как третий нуклеотид внедряется в GACAA пентапетлю. Четвертый G принимает syn glycosidic конформацию и основание накладывается на рибозу третьего A. Предполагается, что GAAAA пентапетля также образует GNRA-подобную конформацию, т.к. она может замещать GAAA тетрапетлю из D5 домена в группе II интрона без нарушения ферментативной активности.

GNRA-подобные структуры были также обнаружены в adenosine triphosphate (ATФ)-связывающих аптамерах. В отсутствие АМФ внутренняя петля аптамера в основном не структуирована. После связывания АМФ аптамер приобретает L-образную структуру с двумя почти ортогональными стволами. В комплексе AMФ-аптамер, последовательность нуклеотидов в петле GAA образует U поворот (Figure 3) и взаимодействует с AMФ, чтобы создать структуру, подобную GNRA тетрапетле, где АМФ лиганд функционирует в качестве четвертого остатка. Нековалентно прикрепленный АМФ располагается (stacks) между третьим A и основанием G ствола. Однако поскольку ориентация АМФ параллельна первому G, то схема водородных связей между АМФ и первым G (Figure 1f) отличается от таковой, наблюдаемой в сложенной G·A паре оснований.

Other Tetraloops

Петля из четырех оснований CUUG часто обнаруживается в рРНК. Первый и четвертый нуклеотиды формируют стандартную Watson-Crick пару оснований, а второй нуклеотид петли взаимодействует непосредственно с закрытой парой оснований ствола путем укладки в минорную борозду (Jucker and Pardi, 1995). Плоскость основания первого и четвертого нуклеотидов до некоторой степени скреплена, хотя они наложены (stacked) на основания ствола. Позиция третьего U чётко не определена, хотя он частично накладывается на четвертый G. Тетрапетля CUUG резистентна к деградации, вызываемой Pb²⁺. Интересно, что в петле из пяти нуклеотидов с последовательностью CUUGU, только одно слабое расщепление происходит после избыточного U остатка, указывая, что первые четыре нуклеотида петли из 5 нуклеотидов формируют структуру, очень сходную с таковой CUUG тетрапетли.

SL3 ствол-петля из human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) packaging сигнал содержит GGAG тетрапетлю. NMR исследование показало, что GGAG тетрапетля, по-видимому, гибкая со вторым G и четвертым G основаниями непохожая на обычную stacking сборку (Pappalardo et al., 1998). Третий A занимает полость достаточно крупную, чтобы быстро перепрыгивать между stacking сайтами на первом G и на 3'-closing основании G. Водород связывающие локусы второго, третьего и четвёртого нуклеотидов доступны беспрепятственно. После связывания nucleocapsid белка, флексибельные РНК нуклеотиды становятся упорядоченными. Первый G накладывается на 5'-stem основание и образует водородный мостик с четвертым G. Второй и третий нуклеотиды выступают и взаимодействуют со связанным белком.

Последняя спираль в бактериальной 16S рРНК, спираль 45, отлавливается с помощью метилированной петли из четырех нуклеотидов, последовательность которых m2G-G-A-A. Конформация этой петли радикально отличается от таковой обычной GNRA тетрапетли (Rife and Moore, 1998). Вместо наложения на 5'-stem основание, метильная группа первого m2G накладывается на 3'-stem основание cross-strand образом. Кроме того, третий A и четвертый A накладываются на верхушку др. др. Второй нуклеотид находится в syn конформации, а второй, третий и четвертый нуклеотиды имеют C2'-endo конформацию сахара. Поворот остова происходит между четвертым нуклеотидом и 3'-stem нуклеотидом. Метильные группы запрещают возможные водородные связи, обнаруживаемые в GNRA тетрапетле, и вызывают стерические столкновения. Хотя метилирование предупреждает образование почти всех водородных связей, наложение (stacking) метилированных оснований повышает стабильность.

Тетрапетля UGAA, которая является законсервированным мотивом в 16S-подобных рибосомальных РНК эукариот, обладает новой складкой (Butcher et al., 1997a). Поворот остова происходит между вторым G и третьим A в петле. Ориентация syn второго G позволяет ему накладываться поверх первого U, тогда как аминогруппа образует водородный мостик со своим собственным O5' кислородом фосфата (Figure 1n). 2'-OH второго G лежит внутри области связывания водорода кислорода фосфата третьего A (Figure 1j) , а третий A накладывается поверх четвертого A. Первый U и четвертый A взаимодействуют др. с др. Аминогруппа четвертого A лежит внутри дистанции связывания водорода из O2, 2'-OH и O4' групп первого U. Уникальная складка тетрапетли UGAA стабилизируется с помощью наложения оснований и серии водородных мостиков.

мРНК бактериофага T4 содержит шпилечную структуру с 8 нуклеотидами в петле. Шпилька играет важную роль в репрессии трансляции путем связывания T4 ДНК полимеразы. Мутантная CAAC шпилька тетрапетли обладает тем же самым связывающим сродством к полимеразе. Хотя дикого типа и мутантные шпильки имеют разные вторичные структуры, трехмерные структуры очень сходны др. с др. (Mirmira and Tinoco, 1996). Тетрапетля стабилизируется водородными связями между O2 от первого C и аминогруппой от четвертого C. Поворот остова происходит на CpA ступени и наложение расширяется до второго A на 3'-стороне. Watson-Crick faces трех нуклеотидов, AAC, в тетрапетле, также как и в дикого типа октапетле экспозируется в solvent, предоставляя возможный сайт связывания для полимеразы (Mirmira and Tinoco, 1996).

Tetraloop-receptor motifs

РНК упаковка в основном иерархическая; вторичные структуры, такие как спирали и петли, формируются в то время как третичные структуры стабилизируются с помощью дальнодействующих взаимодействий. 11-nt GAAA tetraloop-receptor является одним из наиболее изученных третичных взаимодействий. Тетрапетля-рецепторы являются широко встречающимися мотивами, которые были найдены в группе I и группе II self-splicing интронов и RNase P, они играют критические роли в упаковке крупных РНК. Структуры из трех GAAA тетрапетель и трех рецепторов и комплекс tetraloop-receptor были установлены с помощью X-ray кристаллографии (Battle and Doudna, 2002) и NMR спектроскопии (Butcher et al., 1997b; Davis et al., 2005).

Структура взаимодействия тетрапетля-рецептор включает несколько мотивов структур РНК, такие как A-минорные взаимодействия, использующие контакты между адениновыми нуклеотидами тетрапетли и минорной бороздой пар оснований, что дает тройное основание (triple base), на платформе аденина (A-платформа) в рецепторе, который формирует stacking взаимодействия с 5'-аденином тетрапетли, мотивы рибозной застежки, в которых 2'-OH группы тетрапетли и рецептор формируют взаимопроникающие водородные мостики, и U поворот в GAAA тетрапетле. Взаимодействия тетрапетля-рецептор включают 10 межмолекулярных водородных связей и одно base stacking взаимодействие между 5'-adenine в тетрапетле и A-платформой.

Тетрапетля GAAA удерживает рецептор как относительно ригидное тело. Тетрапетля соединяется с рецептором путем наложения (stacking) на A-платформу и путем образования водородных мостиков с комплементарным карманом минорной борозды, формируя A-минорные взаимодействия и рибозные застежки. Однако рецептор подвергается довольно сильным конформационным изменениям в ответ на соединение с тетрапетлей. Несвязанный рецептор является A-застежкой с cross-strand наложением (stacking) трех аденинов и неканонической пары оснований. В связанном рецепторе два аденина образуют внутринитевую A-платформу, которая накладывается на 5'-аденин из тетрапетли, а уридин вспучивается. Ионы Mg²⁺ необходимы для стабильных взаимодействий тетрапетля-рецептор. В комплексе, Mg²⁺ скоординирован со многими функциональными группами внутри рецептора, но не скоординирован непосредственно в тетрапетлёй (Qin et al., 2005). Mg²⁺ стабилизирует состояние A-платформы в связанном рецепторе, но не вызывает конформационных изменений перед связыванием. Cobalt hexamine связывается с тандемными G-U колеблющимися парами в большой борозде ствола тетрапетли (Davis et al., 2007). Калий или марганец ассоциируют с A-платформой.

Тетрапетля GANC обнаружена внутри -? группы взаимодействия IIC интронов (Toor et al., 2008). Остов тетрапетли GANC это U turn-like конформация, как и в тетрапетле GNRN. Складка сахара в первом гуанозине GANC является 2'-endo, тогда как складка 3'-endo сахара присутствует в GNRA. Первый G выдвинут в направлении минорной борозды, а оставшиеся три основания наложены на закрытую пару оснований. Необычно, взаимодействие GANC tetraloop-receptor заключается только в наложении оснований между третьим N основанием тетрапетли и выпирающим пурином рецептора и не содержит A-платформы. Взаимодействие GANC tetraloop-receptor в группе IIC интронов вносит вклад в собственно ориентацию скорее, чем энергетическую стабилизацию (Keating et al., 2008).

Tetraloop-protein interactions

MS2 покровный белок соединяется с трансляционным оператором ствол-петля РНК бактериофага MS2, который содержит AUUA тетрапетлю и действует в качестве репрессора трансляции. В растворе РНК существует в качестве ансамбля состояний по-разному спаренных оснований и сложенных оснований в равновесии (Borer et al., 1995). структура обнаруживает сиквенс-специфические взаимодействия между консервативными основаниями РНК и белковыми остатками (Valegard et al., 1997). РНК взаимодействует с белком посредством фосфатных групп, рибозы и оснований нуклеотидов. третий U и четвертый A нуклеотиды образуют обширную сеть водородных связей с белком. Тритий U накладывается на боковую цепь тирозина белка.

Дрожжевая RNase III (Rnt1p) является двунитчатой РНК (dsRNA) эндонуклеазой. Rnt1p расщепляет сайты, находящиеся на stem-loops, которые залавливаются терминальной консервативной AGNN тетрапетлей, расположенной внутри 13-16 пар оснований сайта расщепления. Тетрапетля AGNN повышает шансы связывания Rnt1p и необходима для процессинга Rnt1p (Chanfreau et al., 2000). Rnt1p распознает складку AGNN тетрапетли скорее, чем консервативную последовательность (Wu et al., 2004). Структура Rnt1p в растворе и AGNN тетрапетли показывает, что N-терминальная спираль вставляется в минорную борозду тетрапетли РНК, а верхушка ствола с помощью nonsequence-specific контактов с остовом сахар-фосфат и двух неконсервативных нуклеотидов тетрапетли. Энзим действует как молекулярный правитель, который распознает AGNN тетрапетлю и расщепляет РНК субстрат на фиксированном расстоянии от места распознавания.

The sarcin/ricin loop (SRL) это высоко консервативная последовательность, найденная в РНК всех крупных рибосомальных субъединиц и является критической для функции рибосом, таких как инициация, элонгация и терминация рибосомами управляемого синтеза белка. SRL РНК является критическим компонентом сайта связывания для EFs (embryonic fibroblasts) и возможно для др. GTPase (guanosine triphosphatase) белковых факторов, таких как IF2. Структура SRL РНК содержит выпирающий G-мотив и GAGA тетрапетлю (Correll et al., 1998). Сайт-специфические, токсические sarcin и ricin семейства соединяются и ковалентно модифицируют SRL и инактивируют рибосомы. приводя к клеточной гибели. Ricin распознает только GAGA тетрапетлю и depurinates первый A. Glycosidic мостик первого A превращается скачком в syn из антиконформации после связывания рицина (Yang et al., 2001). Третий нуклеотид в GAGA петле также важен для распознавания рицина, поскольку рицин не распознает структурно похожую GAAA тетрапетлю. Sarcin прежде всего распознает выпирающий G-мотив, расположенный на фиксированном расстоянии (~11 A) от scissible мостика (Correll et al., 2004). Sarcin связывает SRL РНК неспецифически, благодаря распознанию SRL структуры выпирающего G-мотива и GAGA тетрапетли (Korennykh et al., 2007). После связывания sarcin, тетрапетля GAGA подвергается конформационному изменению в позиции nucleophile для развернутой атаки на scissible мостик. Структура ricin-SRL также подтверждает модель молекулярного правителя.

Base-Phosphate Bonds

Взаимодействия основание-фосфат обнаружены в UNCG, GNRA и UGAA тетрапетлях. водородные мостики между аминогруппой оснований и кислородом фосфата, по-видимому, стабилизируют резкий поворот остова этих тетрапетель.

В тетрапетле UUCG, NOEs от третьего ароматического C к первому и второму протонам U сахара предопределяет тесный контакт между цитозином экзоциклического амина и кислородом фосфата, соединяющим первый и второй нуклеотиды (Allain and Varani, 1995; Figure 1k). Эта водородная связь была идентифицирована с помощью резонанса амина цитозина при использовании 15N-меченной РНК (Allain and Varani, 1995). Сходное взаимодействие основание-фосфат наблюдалось в консервативной внутренней петле в SRP РНК E. coli 4.5S РНК. Тетрапетля UUUG значительно менее стабильна, чем тетрапетля UUCG, хотя структуры двух шпилек очень сходны. Это частично обусловлено потерей благоприятного взаимодействия основание-фосфат. Анализ компонентов свободной энергии при симуляции неограниченной молекулярной динамики показал, что фосфатная часть является единственным крупным энергетическим вкладчиком для обеспечение преференции цитозина над урацилом петли в петле, что согласуется с экспериментальными данными.

Мотив U поворота (Figure 3), обнаруженный в антикодоне и TC петлях transfer RNA (tRNA), наблюдается в каталитическом стержне в виде головки молотка рибозиме, GNRA тетрапетлях (Jucker et al., 1996), SRL петле (Correll et al., 1998) и АТФ-связывающем РНК аптамере. Три основания мотива U поворота (G/UNR) характеризуются поворотом остова после первого нуклеотида, это стабилизируется с помощью водородных связей рибоза-основание и основание-фосфат (Figure 3). Два водородных мостика между 2'-OH из G/U и N7 из R (Figure 1h) и amino/imino группы из G/U и N7 и 3'-фосфат из R (Figure 1l), стабилизируют конформацию. Две разные схемы водородных соединений были предположены для взаимодействий основание-фосфат GNRA тетрапетли (Figure 1l и m). После поворота остова следующие два основания накладываются один на другого и наложение продолжается на 3'-ствол в случае тетрапетель.

В тетрапетле UGAA, второй G в syn конформации накладывается поверх первого U. Предположено наличие мощного водородного мостика от 2'-OH второго G к кислороду фосфата третьего A (Figure 1j). Поворот остова происходит между вторым и третьим нуклеотидом и стабилизируется с помощью взаимодействия основание-фосфат между третьего A аминогруппой и фосфатом второго G (Figure 1n).

Stacking of the Third Base

Наложение третьего основания в терапетлях является распространенным признаком. Все структуры терапетель тщательно исследованные обнаруживают третье основание наложенным, хотя партнеры по stacking для третьего основания разные. Функциональное и структурное значение этого пока неизвестно. В тетрапетле UNCG третий C накладывается на U·G пару оснований. В тетрапетле GGAG третье основание перескакивает быстро между наложением на первый G и 3'-ствол. Для остальных терапетель (GNRA, CUUG, m2G-G-A-A, UGAA и CAAC) третье основание накладывается на четвертое основание. В противоположность третьему основанию второе основание не всегда оказывается наложенным (stacked). Наложение второго основания наблюдается только для GRRA (на третье основание), UGAA (первое) и CAAC (третье) тетрапетель.

Two-base Loop

Взаимодействия между основаниями первого и четвертого нуклеотидов обнаруживаются в большинстве тетрапетель (UNCG, GNRA, CUUG, UGAA и CAAC). Тетрапетли, имеющие такие взаимодействия д. рассматриваться как минипетли, имеющие только два нуклеотида в петле. Для этих терапетель обычно наблюдается вздутие между первым и четвертым основанием. Оба нуклеотида имеют одну или более C2'-endo конформацию сахаров, это помогает связать мостиком ствол. В отношении специфических схем водородных связей взаимодействий между основание-основание см. раздел Structure и Figure 1d.

Один или оба нуклеотидов из петли в два нуклеотида часто обнаруживают структурную динамику. Позиция второго нуклеотида в UNCG и GNRA петлях определена недостаточно четко по сравнению с др. нуклеотидами петель. Конформация сахара всех нуклеотидов петли UGAA обнаруживает динамику. В тетрапетле CUUG, второй U хорошо определен с помощью NOE данных и взаимодействует с петлей C·G и первой парой оснований ствола в малой борозде. Позиция третьего U установлена недостаточно четко, хотя он расположен в большой борозде. Неструктуированные нуклеотиды в петлях из двух нуклеотидов могут быть важны для распознавания и для взаимодействий РНК-белок.

RNA Structure: Tetraloops Chaejoon Cheong, Hae-Kap Cheong eLS Published Online: 15 FEB 2010 | DOI: 10.1002/9780470015902.a0003135.pub2

RNA Structure: Tetraloops
Chaejoon Cheong, Hae-Kap Cheong
eLS Published Online: 15 FEB 2010 | DOI: 10.1002/9780470015902.a0003135.pub2