Обычно считается, что сигнальная активность, осуществляемая семейством WNT гликолипопротеиновых факторов, передается отдельно с помощью каскадов сигнальных трансдукторов в β-catenin-зависимом (каноническом) или в β-catenin-независимым (неканоническим: WNT/planar cell polarity, WNT/Ca²⁺) пути, чтобы запустить специфические генетические реакции и клеточные активности. Однако недавние исследования показали, что эти два пути менее отличны, чем полагали. Активности большинства WNT лигандов, как было установлено, действуют посредством или пути, зависимого от их взаимодействий с рецепторами и растворимыми факторами, которые уникальны для специфических сигнальных каскадов. Селективные взаимодействия внеклеточных факторов, таких как Dickkopf-1 (DKK1) и Glypican, с Frizzled (Fz)/Low density lipoprotein receptor-related protein (LRP) комплексами также влияют на выбор молекулярного пути, посредством которого силналы WNT будут передаваться. Более того, β-catenin зависимый и независимый пути обладают некоторыми общими нижестоящими компонентами, включая Dishevelled (DVL), c-Jun N-terminal kinase (JNK) и Signal Transducers and Activators of Transcription (STAT) белок, это обеспечивает пересечение между разными путями сигнальной трансдукции к эффекторам (Logan & Nusse 2004; Gordon & Nusse 2006; Caneparo et al. 2007; Kikuchi et al. 2009; van Amerongen & Nusse 2009).

Сигнальная активность WNT используется для регуляции клеточных функций, таких как пролиферация, миграция, спецификация клеточных судеб и поддержание плюрипотентности и онкогенного потенциала. Здесь будут рассмотрены биологические эффекты передачи сигналов WNT/β-catenin на распределение и поддержание предшественников клонов, дифференцировку зародышевых слоёв у ранних эмбрионов мыши (Table 1) и поддержание, самообновление и дифференцировку стволовых клеток, происходящих из эмбрионов, in vitro (Table 2).

A primer on WNT/β-catenin signaling pathway

Общепринятая схема, подчеркивающая основные компоненты сигнального пути WNT изображает линейный каскад лигандов, рецепторов, внутриклеточных трансдукторов и транскрипционных мишеней, представлена в Box 1. Недавние находки добавили слои сложности в способ действия и регуляции сигнального процесса и в пересечение между каноническим и β-catenin независимым путем (Fig. 1 and reviews by Angers & Moon 2009; van Amerongen & Nusse 2009; Mcneill & Woodgett 2010).

Box 1

В каноническом пути передача сигналов с помощью WNT белков активирует внутриклеточный сигнальный каскад, обеспечиваемый с помощью β-catenin. WNT связывает рецептор (Frizzled: Fz) и корецептор (Low-density-lipoprotein receptor-related proteins 5 и 6: LRP5/6) , чтобы сформировать комплекс, который осуществляет рекрутирование нижестоящих сигнальных медиаторов Dishevelled (DVL/DSH) на Fz и Axin на LRP5/6. Это ведет к секвестрации комплекса деструкции β-catenin, который состоит из Axin, adenomatous polyposis coli (APC), glycogen synthase kinase 3? (GSK3?) и casein kinase 1 (CK1), прочь от β-catenin к месту активированных Fz-LRP рецепторов. Это обеспечивается с помощью взаимодействия между каркасным белком, Axin, и фосфобелком Dishevelled и впоследствии ведет к разборке комплекса деструкции. Отсутствие комплекса делает возможными стабилизацию и накопление β-catenin, и способствует транслокации в ядро β-catenin. В ядрах β-catenin действует совместно с T-cell factor (TCF)/Lymphoid enhancer factor (LEF) белком, чтобы активировать транскрипцию генов мишеней. β-catenin также должен взаимодействовать с др. кофакторами, чтобы репрессировать активность генов мишеней (Gordon & Nusse 2006). Модуляция сигнальной активности сопровождается действием антагонистов, которые являются в основном внеклеточными секретируемыми молекулами, такими как члены семейства секретируемых белков Frizzled-related protein family (SFRPs), WNT-inhibitory factor (WIF), Dickkopf-like proteins (DKK), WISE и SOST. SFRPs и WIF непосредственно связывают WNT лиганды, это прерывает активацию передачи сигналов WNT, тогда как DKK, WISE и SOST противодействуют передаче сигналов путем нарушения образования Fz-LRP5 комплекса (Macdonald et al. 2009). Это делает возможной сборку функционального комплекса деструкции в цитозоле. Ассоциация β-catenin с комплексом деструкции ведет к его фосфорилированию и деградации убиквитинированного β-catenin с помощью протеосом и приводит к инактивации сигнального пути. У мышей сигнальная активность WNT может быть визуализована экспрессией репортерной конструкции, такой как β-galactosidase, управляемой промотором, содержащим сайты связывания TCF/LEF, или с помощью иммуноокрашивания активного β-catenin (Maretto et al. 2003; Mohamed et al. 2004). Недавно создана новая трансгенная линия мышей, экспрессирующая флюоресцентный репортер передачи сигналов WNT/β-catenin (TCF/Lef:H2B-GFP). Такие мыши позволяют наблюдать вживую активность WNT/β-catenin с разрешением в одну клетку, чтобы отследить временной и пространственный паттерн активности WNT у эмбрионов и взрослых мышей (Ferrer-Vaquer et al. 2010).

Активность WNT/β-catenin зависимого пути может быть модулирована за счет активности независимого пути, обеспечиваемого с помощью подобного рецепторной тирозин киназе receptor 2 (ROR2), действующего с Fz рецептором, который может взаимодействовать как с каноническим WNT3A, так и неканоническим WNT5A лигандом. Активация ROR2-JNK сигнального каскада с помощью WNT5A может негативно регулировать активность β-catenin зависимого пути. Это, как полагают, обеспечивается взаимодействием LIM-доменового бклка из семейства Ajuba/Zyxin, WTIP, с C-терминальным регионом. богатым serine-proline-threonine в ROR2 (van Wijk et al. 2009). Однако точный механизм всё ещё не установлен. На уровне ко-рецептора WNT3 или WNT5A, связанные с Fz рецептором, могут взаимодействовать или с LRP5/6 или ROR2. реципрокное конкурентное связывание Fz с LRP5/6 и ROR2 ведет к избирательной активации одного из двух путей, посредством фосфорилирования специфического рецептора. Активация рецептора выявляет рекрутирование внутриклеточных компонентов, таких как Axin, Dishevelled и glycogen synthase kinase 3 (GSK3), которые являются общими как для β-catenin зависимого, так и независимого каскада и тем самым представляет ещё один способ перекрестной модуляции путей. Эта находка демонстрирует новую концепцию, что активация разных сигнальных путей WNT может сопровождаться связыванием и фосфорилированием рецепторов, обычно не связанных со специфическим путем, но которые могут быть активированы посредством некоторых общих факторов нижестоящего каскада (Grumolato et al. 2010).

Модуляция сигнальной активности WNT может быть достигнута путем регуляции внутриклеточной доставки WNT лиганда, Fz рецептора и β-catenin. Транспорт WNT лиганда из эндоплазматического ретикулума посредством Гольджи на поверхность клетки нуждается в транспортном кругообороте посредством Wntless/GPR177, многократно пронизывающего трансмембранного белка, в WNT-продуцирующих клетках (Fu et al. 2009). Интересно, что GPR177 является непосредственной WNT мишенью и его активация в клетках отвечает на передачу сигналов и тем самым создает механизм обратной связи, который облегчает сортировку и секрецию WNT факторов. В соответствии с этим мнением потеря функции GPR177 фенокопирует комбинированную потерю функции WNT1 и WNT3A (Fu et al. 2011). Передача сигналов WNT может быть ослаблена за счет снижения способности Fz рецептора и это достигается за счет удерживания его в эндоплазматическом ретикулуме с помощью белка Shisa (Yamamoto et al. 2005). Prorenin receptor (PRR), как было установлено, является компонентом WNT рецепторного комплекса у эмбрионов Xenopus (Cruciat et al. 2010). PRR действует renin-независимым способом в качестве адаптора между WNT рецепторами (такими как LRP6) и vacuolar H⁺-adenosine triphosphatase (V-ATPase) комплексом. Этот PRR-LRP6-V-ATPase комплекс эндоцитозируется после стимуляции WNT, а V-ATPase генерирует градиент протонов поперек везикулярной мембраны, это важно для фосфорилирования LRP6 и, следовательно, активации β-catenin (Cruciat et al. 2010). Эндоцитотический перенос WNT рецепторных комплексов, как известно, участвует в регуляции сигнальной активности WNT (Kikuchi et al. 2009). Дальнейшие исследования по взаимоотношениям между сигнальной трансдукцией WNT и эндоцитозом-обеспечиваемым трафиком поможет нашему пониманию избирательной регуляции сигнальной активности WNT.

Недавние исследования также открыли несколько новых игроков, противодействующих сигнальной активности WNT и это стало неожиданной функцией известного антагониста. Adenomatosis polyposis coli downregulated 1 (APCDD1) является связанным с мембраной гликопротеином, который взаимодействует in vitro с WNT3A и LRP5 и ингибирует передачу сигналов WNT клеточно-автономным способом путем действия выше β-catenin в WNT/β-catenin сигнальном каскаде (Enshell-Seijffers et al. 2010; Shimomura et al. 2010). Мутация (Leu9Arg) в сигнальном пептиде из APCDD1, обнаруженая у пациентов с наследственным hypotrichosis simplex, нарушает его экспорт из эндоплазматического ретикулума на плазматическую мембрану. Этот мутантный белок, скорее всего, действует доминантно-негативным способом с нарушенными стабильностью и мембранной локализацией, устраняет его ингибирующую функцию на передачу сигналов WNT (Shimomura et al. 2010). В противовес распознанной антагонистической роли секретируемых extracellular cysteine-rich domains of the Fz receptor proteins (SFRPs) белков, которые секвестрируют WNT лиганд, недавние находки показали, что у Xenopus, SFRP3 (FRZB) может усиливать скорее, чем ингибировать передачу сигналов WNT благодаря облегчению диффузии лиганда во внеклеточное пространство (Mii & Taira 2009).

Инактивация GSK3, которая устраняет функцию комплекса деструкции в отношении β-catenin, является ключевой ступенью в активации передачи сигналов. Однако молекулярный механизм, с помощью которого передача сигналов WNT ингибирует активность GSK3, неизвестен. Недавно выявлена регуляция паттерна субклеточной локализации GSK3 с помощью активации передачи сигналов WNT более детально. Два белка, HRS/VPS27 и VPS4, которые важны для образования multivesicular bodies (MVB), влияют на сигнальную активность WNT. Передача сигналов WNT запускает секвестрацию цитозольной GSK3 в эндосомы, которые сливаются. чтобы сформировать MVBs, приводя тем самым к снижению активности цитозольной GSK3, а также к защите GSK3 внутри MVBs от деградации протеазами. Снижение активности цитозольной GSK3 удлиняет период полу-жизни β-catenin и др. белков, которые содержат сайты фосфорилирования с помощью GSK3 (Taelman et al. 2010). Поскольку доставка WNT и мембранных рецепторов в MVBs и лизосомы негативно регулирует сигнальную активность, то секвестрация GSK3 в MVBs усиливает передачу сигналов WNT. Мультивезикулярные эндосомы поэтому являются важным компонентом пути передачи сигналов WNT.

Регуляция активности передачи сигналов WNT/β-catenin может быть достигнута путем контроля доступности активного β-catenin. Дефицит ядерной ламины, как известно, ингибирует реакцию на WNT сигналы. Мутация в гене Lmna, которая вызывает пропуск экзона 9, дает укороченную форму Lamin A во внеклеточном матриксе (ECM) и ингибирует каноническую передачу сигналов WNT, выявляемую по уменьшению ядерной локализации и транскрипционной активности LEF1 (Hernandez et al. 2010). Пока функциональная ассоциация между факторами ECM и передачей сигналов WNT остается неясной, предполагается, что ядерный lamin играет критическую роль в переносе из цитоплазмы в ядро β-catenin и LEF1. Альтернативно, аномальная продукция ECM затрагивает организацию цитоскелета и изменяет взаимодействие β-catenin с цитоскелетным компонентом E-cadherin, который косвенно влияет на способность β-catenin к сигнальной трансдукции. Сигнальная активность может быть подавлена путем связывания каркасного домена Caveolin-1 (который играет ключевую роль в везикулярном транспорте) с мотивом связывания Caveolin-1 в β-catenin, и тем самым предупреждает его транслокацию в ядро (Mo et al. 2010). Кроме того, tetraspanin трансмембранные белки (CD9 и CD82) усиливают внеклеточное высвобождение β-catenin из экзосом, происходящих из MVBs. Это в свою очередь снижает способность цитозольного β-catenin к передаче сигналов (Chairoungdua et al. 2010). Возникающий в результате этих исследований пример, указывает, что использование β-catenin из разных внутриклеточных источников, из органелл или из β-catenin, ассоциированного с цитоскелетным E-cadherin, с TCF/LEF факторами или Axin-APC-GSK3 комплексов, является центральным контролем уровня активности передачи сигналов WNT/β-catenin.

WNT signal and blastocyst development

Биологический эффект передачи сигналов WNT на клеточную дифференцировку зависит критически от временного и пространственного паттерна использования выходного сигнала, также как и от интенсивности сигналов, воспринимаемых соотв. клетками, которая модулируется внеклеточными и внутриклеточными агонистическими и антагонистическими факторами и механизмами обратной связи. Транскрипты большинства лигандов и антагонистов пути передачи сигналов WNT экспрессируются, некоторые с определенным регионализованным доменом экспрессии, в бластоцисте мыши и эмбрионе от стадии перед имплантацией до стадии гаструляции (Kemp et al. 2005; Pfister et al. 2007). Поскольку большинство WNT лигандов экспрессируется во внутренней клеточной массе (ICM), и только WNT9A экспрессируется преимущественно в трофэктодерме. Если стабилизированная форма β-catenin, которая резистентна к деградации с помощью GSK3β-обеспечиваемого протеосомного пути, избыточно экспрессируется в развивающемся ооците, то ядерная локализация и функция передачи сигналов β-catenin не наблюдается в эмбрионе стадии дробления. Такие эмбрионы первоначально развиваются до стадии бластоцита нормально, хотя они были дефектны по образованию эпибласта (происходящему из ICM) на ранних пост-имплантационных стадиях (Kemler et al. 2004). Эти находки указывают на то, что ядерная локализация и функция β-catenin не связаны с GSK3β-обеспечиваемой деградацией у преимплантационных эмбрионов мыши. Хотя замалчивание передачи сигналов WNT/β-catenin не влияет на развитие до образования бластоциста, оно блокирует имплантацию бластоциста (Xie et al. 2008). Эмбриональные стволовые (ES) клетки, в ответ на WNT3A посредством активации LEF1, индуцируются к дифференцировке в трофэктодерму, что сопровождается активацией Cdx2 (He et al. 2008). Передача сигналов WNT может, следовательно, быть необходима для собственно дифференцировки клеток трофобласта, способных к имплантации.

Спецификация примитивной энтодермы в ICM сопровождается последовательной активацией GATA6, SOX17, GATA4 и SOX7 в её предшественниках в бластоцисте (Artus et al. 2011). Это вызывается активацией передачи сигналов fibroblast growth factor (FGF)/mitogen-activated protein kinase (MAPK) в бластоцисте (Yamanaka et al. 2010). В ICM бластоциста обнаруживаются немногие клетки, экспрессирующие β-catenin, но биологическое значение этого неясно (Chazaud & Rossant 2006). Недавно было предположено возможное участие канонической передачи сигналов WNT в дифференцировке энтодермы. Анализ proximal epiblast enhancer (PEE) в Nodal цис-регуляторной области выявил, что активность трансгена PEE-GFP маркирует субнабор клеток ICM и эпибласта, но не клеток примитивной энтодермы у трансгенных эмбрионов. Специфичная для эпибласта экспрессия трансгена у Apc^Min/Min мутантных эмбрионов, у которых сигнал WNT/β-catenin активируется благодаря нонсенс мутации в Apc, дифференциально индуцируется в эпибласте, но репрессирована в примитивной энтодерме. Более того, экспрессия PEE-GFP теряется у Ctnnb1^-/- эмбрионов (ген Ctnnb1 кодирует β-catenin) и Apc^Min/Min эмбрионов (Granier et al. 2011), это согласуется с мнением, что PEE активность зависит от канонической передачи сигналов WNT/β-catenin, а дифференцировка энтодермы облегчается при низкой сигнальной активности WNT.

WNT signaling in embryonic stem cells

Роль передачи сигналов WNT для поддержания и дифференцировки ES клеток спорна. Мыши с нулевой мутацией лигандов и рецепторов WNT не обнаруживают каких-либо дефектов в поддержании или дифференцировке ICM бластоциста или эпибласта у ранних пост-имплантационных эмбрионов (rev. van Amerongen & Berns 2006). Отсутствие фенотипического проявления потери функции WNT может быть обусловлено функциональной перекрываемостью компонентов передачи сигналов WNT, но данная находка также ставит вопрос о роли передачи сигналов WNT для поддержания эмбриональных клеток, которые являются источником ES клеток и эпибластных стволовых клеток мыши.

Активация передачи сигналов WNT/β-catenin в ES клетках человека и мыши усиливает экспрессию генов плюрипотентности и может облегчать самообновление стволовых клеток (Dravid et al. 2005; Lu et al. 2006; Miyabayashi et al. 2007). Однако необходимо отметить, что в этих исследованиях ES клетки культивировали на питающих клетках, так что неясно, действительно ли активность WNT действует непосредственно на ES клетки или косвенно посредством питающих. ES клетки человека не поддерживаются путем добавления WNT3A в отсутствии питающих клеток (Dravid et al. 2005), возникает возможность, что питающие клетки продуцируют факторы, которые действуют синергично с WNT сигналами, чт обы поддерживать самообновление. Передача сигналов WNT оказывает другой эффект на ES клетки мыши. Будучи культивированы в WNT3A кондиционированной среде, ES клетки подвергаются мезодермальной дифференцировке (Bakre et al. 2007). Когда активность β-catenin повышена, то ES клетки мыши, культивируемые при высокой плотности, испытывают нейральную дифференцировку (Otero et al. 2004). Напротив, ингибирование GSK3β с помощью малых молекул BIO, которые повышают стабильность и накопление цитозольного β-catenin, временно усиливает поддержание ES клеток мыши и человека (Sato et al. 2004). Комбинированные Gsk3β::Gsk3β нокаутные ES клетки были использованы для тестирования эффекта "off target" малых молекул ингибиторов (Doble et al. 2007). Такие клетки сохраняли экспрессию маркеров плюрипотентности и не дифференцировались собственно in vitro (напр., не возникали контрактильные кардиомиоциты) и in vivo в виде тератом (напр., оставались недифференцированными и обнаруживали злокачественный фенотип). В ES клетках мышей, bone morphogenetic protein (BMP) или FGF активируют PI3K/AKT, чтобы ингибировать GSK3β и облегчить β-catenin/TCF3 поддержание плюрипотентности (Watanabe et al. 2006; Storm et al. 2007; Lee et al. 2009). В ES клетках человека, усиление самообновления путем ингибирования GSK3β обеспечивается за счет активации PI3K/AKT. В присутствии FGF2, активация PI3K/AKT ингибирует GSK3? и способствует транслокации в ядро β-catenin. Действие GSK3β , однако, не затрагивается с помощью DKK1 (Ding et al. 2010), указывая тем самым, что ингибирование GSK3β не обязательно соответствует активации передачи сигналов WNT. Эти находки подчеркивают важность нижестоящей активности GSK3, которая может быть не связана с передачей сигналов WNT для поддержания ES клеток.

В ES клетках мыши потеря функции TCF3 способствует самообновлению в отсутствие leukemia inhibitory factor (LIF), но такие клетки не могут формировать эмбриоидные тела (Tam et al. 2008; Yi et al. 2008). Каноническая передача сигналов WNT/β-catenin, как полагают, регулирует экспрессию ядерного орфанового рецептора Nr5a2 (известен также как liver receptor homologue-1, Lrh-1). Показано, что β-catenin и TCF3 нацелены на Nr5a2 и NR5A2, чтобы, в свою очередь, непосредственно активировать экспрессию Tbx3, Nanog и Oct3/4, которые являются компонентами основной сети плюрипотентности (Fig. 2; Wagner et al. 2010). Индуцированная экспрессия Nr5a2 в мышиных EpiSCs позволяет клеткам приобретать подобное ES клеткам стандартное состояние плюрипотентности (Guo & Smith 2010). NR5A2 может также замещать OCT3/4 при репрограммировании мышиных соматических клеток (Heng et al. 2010). Эти исследования показывают, что активация мишеней β-catenin может поддерживать плюрипотентность и усиливать репрограммирование клеток (Lluis et al. 2008; Marson et al. 2008). Недавнее исследование Gsk3?::Gsk3? двойных нокаутных ES клеток показало дифференциальную функцию β-catenin в поддержании плюрипотентности и блокировании нейральной дифференцировки стволовых клеток (Kelly et al. 2011). На базовых уровнях сигнальной активности, β-catenin инкорпорируется в cadherin-содержащие комплексы и не обнаруживает усиливающего эффекта на фенотип ES клеток. Однако, когда передача сигналов WNT усиливается, β-catenin может связываться с OCT3/4 и усиливать активность Nanog и Tbx3, ключевых факторов плюрипотентности. Тогда как подавление активности OCT3/4 ведет к повышению передачи сигналов WNT благодаря накоплению β-catenin, взаимодействие между OCT3/4 и ядерным β-catenin способствует протеосомной деградации β-catenin в качестве способа контроля негативной обратной связью (Abu-Remaileh et al. 2010). Эти находки показывают, что поскольку нормальный уровень передачи сигналов WNT/β-catenin не оказывает заметного воздействия на ES клетки, то повышенный уровень передачи сигналов WNT может способствовать поддержанию плюрипотентности.

WNT signal and germ layer formation

Анализ экспрессии генов с помощью reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) и гибридизации in situ выявил сложные пространственно-временной паттерн экспрессии WNT лигандов, антагонистов и рецепторов в эпибласте и висцеральной энтодерме у пре-гаструляционных эмбрионов и в зародышевом слое и первичной полоске у эмбрионов на стадии гаструлы (Kemp et al. 2005, 2007; Pfister et al. 2007). В общем, WNT лиганды экспрессируются в основном в задне-проксимальном домене эмбриона (где располагаются предшественники мезэнтодермы и первичная полоска), тогда как антагонисты (и SFRPs) и Fz рецепторы экспрессируются широко или в основном ограничены передней или дистальной областями эмбриона.

Активность по передаче сигналов WNT, по-видимому, не существенна для приобретения эпибластом плюрипотентности, но в её отсутствии может быть нарушена его дифференцировка. Клетки эпибласта у Wnt3-^/- эмбрионов обнаруживают персистирующую экспрессию Oct3/4(Liu et al. 1999), и клетки эпибласта с усиленной локализацией цитоплазматического β-catenin, которая индуцируется с помощью экспрессии стабилизированной формы β-catenin, остаются позитивными по экспрессии Oct3/4 (Kemler et al. 2004). Экспрессия Sox2 также может регулироваться с помощью сигнальной активности WNT. Анализ тканеспецифичных Sox2 enhancer регионов выявил, что передача сигналов WNT и FGF конвергирует, чтобы активировать экспрессию Sox2 в нервной пластинке эмбрионов кур (Takemoto et al. 2006). У мышей экспрессия Sox2 в передней части нейроэктодермы усиливается с помощью FGF8B, но репрессируется с помощью WNT3A (Dang & Tropepe 2010). Когда сигнальная активность WNT сокращается благодаря потере Mesd, который кодирует шапероновый белок, который способствует локализации на мембране LRP рецептора, экспрессия Sox2 сохраняется в мутантном эпибласте. Эти результаты указывают на то, что передача сигналов WNT может быть необходима для репрессии экспрессии Sox2 в эпибласте мыши (Lighthouse et al. 2011).

Образование зародышевых слоёв в первичной полоске сопровождается регионализованной канонической WNT/β-catenin сигнальной активностью в задней части эпибласта. Некоторые WNT лиганды экспрессируются преимущественно в первичной полоске, как показывает активация β-catenin и экспрессия TCF-репортера (Maretto et al. 2003; Mohamed et al. 2004; Kemp et al. 2005). Эмбрионы. лишенные WNT3, β-catenin или WNT ко-рецепторов (LRP5 и LRP6) не образуют первичной полоски (Liu et al. 1999; Huelsken et al. 2000; Kelly et al. 2004; Mohamed et al. 2004). Потеря Mesd также продуцирует сходный фенотип (Hsieh et al. 2003). Недавно сообщалось, что MESD облегчает локализацию LRP2 на апикальном домене висцеральном энтодермы и было предположено, что отсутствие MESD может влиять не только на мембранную локализацию LRP рецепторов, но и также на эндоцитическую функцию множественных LRP рецепторов (Lighthouse et al. 2011). Напротив, потеря Axin2, внутриклеточного негативного регулятора пути WNT или неправильная экспрессия Wnt8c у эмбрионов кур ведет к индукции эктопической первичной полоски (Popperl et al. 1997; Zeng et al. 1997). Далее, экспрессия стабилизированной формы β-catenin в эпибласте индуцирует преждевременный эпителиально-мезенхимный переход, который характеризуется образованием первичной полоски (Kemler et al. 2004). Блокирование передачи сигналов WNT в ES клетках устраняет дифференцировку FLK1-позитивной мезодермы и SOX17-позитивных энтодермальных клеток (Lindsley et al. 2006), снова в соответствии с ролью передачи сигналов WNT в генерации мезодермальных клеток. Перед образованием первичной полоски экспрессия Wnt3 в заднем регионе эмбриона активируется с помощью непреобразованной формы Nodal, возможно посредством передачи сигналов BMP4 во внеэмбриональной эктодерме, а WNT3 активирует петлю обратной связи, которая поддерживает экспрессию Nodal в эпибласте (Brennan et al. 2001; Ben-Haim et al. 2006).

Cell migration in the early embryo: the uncertain role of WNT/β-catenin activity

Транслокация популяции клеток висцеральной энтодермы из дистальной в переднюю область эмбрионов мыши на стадии пре-гаструлы является критической ступенью в генерации передне-задней асимметрии. У эмбрионов мыши, у которых предшественники AVE неспособны перемещаться из-за отсутствия Otx2, экспрессия WNT антагониста, Dkk1, также сокращается (Perea-Gomez et al. 2001; Kimura-Yoshida et al. 2005). Принужденная экспрессия Dkk1 кДНК с локуса Otx2 или удаление одной копии Ctnnb1^+/- (чтобы снизить уровень активности WNT) может корректировать дефекты миграции висцеральной энтодермы. Клетки висцеральной энтодермы, по-видимому, могут отвечать на дифференциальные WNT сигнальные активности путем перемещения в направлении источника DKK1 и напротив прочь от источника WNT3 (Kimura-Yoshida et al. 2005). Сходная потеря экспрессии DKK1 и дефекты миграции висцеральной энтодермы обнаружена у Bmpr1a-нулевых эмбрионов, которые также лишены функции WNT3 и WNT3A (Miura et al. 2010). DKK1 и WNT не оказывают эффекта на пролиферацию висцеральной энтодермы, показывая тем самым, что движения клеток не управляются силами, генерируемыми за счет региональных различий в скорости прироста клеток. У рыбок данио, нокдаун Dkk1 ускоряет гаструляционные движения и интернализацию мезэнтодермы, а Dkk1-дефицитные клетки менее слипчивы. Эти фенотипические эффекты не обнаруживаются у эмбрионов, лишенных функции Axin1/MBL или TCF3 или у тех, что экспрессируют доминантно негативный (не реагирующий на DKK1) Wnt8, указывая тем самым, что эффект на клеточную миграцию может не зависеть от WNT/β-catenin. Предполагается, что отсутствие DKK1 для взаимодействия с агонистом WNT/PCP, Glypican 4/5, может поддерживать поведение Dkk1-дефицитных клеток. Подобно стимуляции сигнальной активности WNT5A-JNK путем связывания Glypican 3 с WNT, предпочтительное образование Glypican 4/5-Fz рецепторного комплекса в отсутствие DKK1 может усиливать нижестоящую активность, обусловленную Dishevelled, которая влияет на клеточную адгезию и миграцию Dkk1-дефицитных клеток (Caneparo et al. 2007).

WNT/β-catenin dependent signaling activity and lineage differentiation

The primordial germ cells

Предшественники зародышевых клеток первыми распознаются в проксимальной части эпибласта у эмбрионов мыши на стадии пре-гаструлы по экспрессии ими Prdm1 (также известного как Blimp1) и Prdm14 (Ohinata et al. 2005; Yamaji et al. 2008), оба кодируют транскрипционные факторы с Zn-пальчиками. Эти клетки также экспрессируют Ifitm3 (fragilis/mil-1) и Ifitm1 (fragilis2/mil-2), которые кодируют интерфероном индуцируемые трансмембранные белки (Saitou et al. 2002; Tanaka & Matsui 2002). Ifitm1 является нижестоящим геном в канонической передаче сигналов WNT/β-catenin у эмбрионов (Lickert et al. 2005), тогда как Ifitm3, по-видимому, нижестоящая мишень для BMP (Saitou et al. 2002).

Передача сигналов WNT может вносить вклад в спецификацию клона зародышевых клеток в дифференцирующихся ES клетках и эпибласте. WNT3A способствует образованию Stella-EGFP позитивных клеток в эмбриоидных телах (Wei et al. 2008). У мутантных эмбрионов мыши, которые лишены активности WNT3, не образуются примордиальные зародышевые клетки (PGCs), несмотря на экспрессию BMP4 во внеэмбриональной эктодерме. В эксплантах эпибласта, BMP и WNT кооперируются, чтобы индуцировать образование PGCs (Ohinata et al. 2009). Рекомбинантный WNT3A сам по себе не индуцирует образования PGC в отсутствии BMP (Ohinata et al. 2009). Следовательно, передача сигналов WNT облегчает реакцию эпибласта на BMP, но сама по себе недостаточна, чтобы индуцировать PGCs. Хотя добавление лиганда WNT способствует образованию PGC, не обнаруживается достоверного увеличения ядерной локализации активированного β-catenin в IFITM3-позитивных клетках (S. S. Tanaka et al., pers. obs.), указывая тем самым, что эффект WNT может не зависеть от β-catenin или он неавтономен в зародышевых клетках.

Cardiomyocytes

В противоположность неспособности мезодермы к образованию эмбрионов с полным отсутствием активности WNT3 или β-catenin (Liu et al. 1999; Huelsken et al. 2000), условно выраженная делеция Ctnnb1 с помощью cytokeratin 19 (Krt19)-Cre ведет к образованию эктопической сердечной ткани в энтодерме (Lickert et al. 2002), предполагая, что подавление активности β-catenin способствует кардиальной дифференцировке. Однако избыточная экспрессия Wnt1 у эмбрионов Xenopus не влияет на развитие сердца (Martin et al. 2011). Большинство WNT лигандов экспрессируются в эмбрионах мышей, когда происходит кардиальная спецификация (Kemp et al. 2005), но роль этих факторов в кардиогенезе известна недостаточно. Исходя из мнения межвидовых различий в паттерне экспрессии WNT во время кардиогенеза (Garriock et al. 2007), необходимо предпринять сравнительное исследование у разных видов, чтобы протестировать, влияет ли передача сигналов WNT на дифференцировку кардиальных клеток in vivo.

In vitro дифференцировка ES клеток выявляет, что кардиальная дифференцировка облегчается с помощью двуфазной регуляции передачи сигналов WNT/β-catenin: активации пути WNT/β-catenin в ранней фазе и ингибирование этого пути и активация неканонического пути в поздних фазах (Naito et al. 2006; Ueno et al. 2007; Paige et al. 2010). Прежде очевидной кардиальной дифференцировки зарождающаяся мезодерма эмбрионов на стадии гаструлы экспрессирует basic helix-loop-helix транскрипционный фактор MESP1 (Saga et al. 2000), а добавление DKK1 к клетками избыточно экспрессирующим Mesp1, может индуцировать кардиальную дифференцировку (Lindsley et al. 2008). Первоначально, MESP1, как полагают, регулирует транскрипцию WNT антагониста DKK1 непосредственно (David et al. 2008), но последующие исследования не подтвердили это предположение, показав, что Dkk1 не является непосредственно ранним отвечающим геном на Mesp1 (Lindsley et al. 2008) или MESP1 ChIP мишенью (Bondue et al. 2008). Вместо этого, MESP1 способствует экспрессии Lef1 и Wnt5a, в то же время репрессирует экспрессию while Wnt3a (Lindsley et al. 2008). Эти находки указывают на то, что активность MESP1 способствует активации неканонического WNT пути в противовес каноническому пути. Однако, WNT5A, который способствует деградации β-catenin независимо от GSK3β активности (Topol et al. 2003; Nemeth et al. 2007), безразличен для кардиогенеза in vivo (Yamaguchi et al. 1999), тогда как WNT11, который активирует Caspase 3/8, чтобы деградировать β-catenin и тем самым ингибирует каноническую передачу сигналов WNT, необходим на поздних стадиях кардиальной дифференцировки (Eisenberg & Eisenberg 1999; Pandur et al. 2002; Abdul-Ghani et al. 2011). Интересно, что DKK1 может ингибировать передачу сигналов WNTв эмбриональном сердце посредством N-терминального домена, который действует назависимо от C-терминального домена, который взаимодействует с LRP5/6 и Kremlin (Korol et al. 2008). Эти данные указывают на то, что множественные молекулярные механизмы контролируют супрессию передачи сигналов WNT/β-catenin во время кардиогенеза.

Conclusion

Functions of canonical WNT/β-catenin signaling, such as the posterior specification of body plan, are conserved among animal species (Petersen & Reddien 2009). WNT/β-catenin signaling often acts in conjunction with other signaling activities and plays a permissive role in the cell fate determination and differentiation, as exemplified by the ontogeny of germ cells and cardiac mesoderm. In embryonic stem cells, WNT signaling supplies regulatory input to the core genetic network of pluripotency. Modulation of WNT/β-catenin signaling activity can be achieved at several steps in the pathway: WNT ligand secretion and modification, ligand-receptor interaction and internalization of the signals, stabilization of the signal transduction molecules and/or their enzymatic activity and downstream transcription regulation. Signaling activity is also regulated by the feedback loops connecting the function of ligands, agonists and antagonists. Additionally, the cross-talk with β-catenin independent pathway and the availability of intracellular pools of active β-catenin engender additional tuning of the level of WNT/β-catenin signaling activity. Current strategies of investigating WNT signaling function are primarily based on analyzing the impact of altered WNT pathway activity on cellular differentiation and tissue morphogenesis. Further understanding of the dynamics of the signaling activity would have to be gleaned by tracking the spatial and temporal pattern of signal production, perception and response in live cells and embryos.