Предложенная Тюрингом концепция "морфогена" в качестве субстанции, которая предоставляет позиционную информацию в процессе развития путем формирования концентрационного градиент (Turing 1952). Затем понятие морфоген оказалось привлекательным не только для экспериментальных, но и теоретических биологов разных областей (Wolpert 1969; Tabata & Takei 2004; Zhu & Scott 2004; Ben-Zvi & Barkai 2010). Кстати, молекуля некоторых типов были постулированы как морфогены. Напр., транскрипционные факторы, подобные Bicoid у Drosophila на ст. синцитиальной бластодермы, и пептиды ростовых факторов, подобные Sonic hedgehog и малые соединения, подобные ретиноевой кислоте (RA) у эмбрионов позвоночных являются хорошо известными морфогенами (Ephrussi & St Johnston 2004; Campo-Paysaa et al. 2008). Здесь мы сфокусируемся на секретируемых сигнальных белках Wingless and int-1 family protein (Wnt) (Logan & Nusse 2004; Clevers 2006) т. наз. секретируемых ингибиторах, secreted Frizzled-related proteins (sFRPs) (Kawano & Kypta 2003; Bovolenta et al. 2008). Мы также коснёмся bone morphogenetic protein (BMP), которй, как полагают, действует как морфоген (De Robertis & Kuroda 2004).

Developmental model systems for studying morphogens

Ранние работы по морфогенам был в основном проделаны на Drosophila. Хотя Bicoid не является секретируемым белком, а транскрипционным фактором, он наиболее изучен из морфогенов (Kugler & Lasko 2009). Многие ведущие исследования секретируемых морфогенов проведены с использованием крыловых дисков Drosophila, в основном из-за простой структуры, составляющей слои клеток и её существенно продвинутой генетике. Напр., Wingless (Wg) градиент в крыловом диске формируется путем диффузии (Strigini & Cohen 2000). Hedgehog (Hh) и Decapentaplegic (Dpp) также действуют как ключевые морфогены в крыловом диске(Tabata & Takei 2004). Их гомологи у позвоночных, Sonic hedgehog (Shh) (Chiang et al. 1996), bone morphogenetic proteins (BMPs) (De Robertis & Kuroda 2004) и Wnts (Kiecker & Niehrs 2001) также, как полагают, выполняют важные роли в различных онтогенетических процессах в качестве морфогенов.

По сравнению с крыловым диском Drosophila исследования морфогенов у эмбрионов позвоночных, по-видимому, имеют большой простор для исследований. Среди позвоночных эмбрионы рыбок данио и Xenopus а также зачатки конечностей кур, были использованы в качестве популярных модельных систем для изучения морфогенов. Исследования на зачатках конечностей кур выявили fibroblast growth factors (FGFs) (Martin 1998), Shh (Riddle et al. 1993) и RA (Thaller & Eichele 1987) в качестве молекулярных субстанций морфогенов для формирования паттерна пальцев. Анимальная шапочка Xenopus была использована для изучения Activin и BMP в качестве морфогенов, поскольку её простая структура и удобство для эктопической экспрессии с помощью инъекций mRNA (Smith 2009). Gurdon с коллегами показали, что пассивная диффузия Activin и transforming growth factor-β1 (TGF-β1) непосредственно вызывает зависимую от концентрации активацию нижестоящих генов мишеней (Gurdon et al. 1994; Dyson & Gurdon 1998; McDowell et al. 2001).

Regulation of Wnt signaling area by sFRPs

Overview of Wnt and sFRP

Wnts образуют семейство секретируемых сигнальных белков и, как полагают, участвовали в становлении Metazoa после отхождения от choanoflagellates (Adamska et al. 2007). Передача сигналов Wnt исследовалась наиболее интенсивно из-за важности для развития животных, напр., формирования дорсовентральной оси (Tao et al. 2005; Cha et al. 2009) и канцерогенеза (Bienz & Clevers 2000). Передача сигналов Wnt может быть подразделена на канонический путь (Clevers 2006) и не канонические пути (Veeman et al. 2003). У ранних эмбрионов пх каноническая передача сигналов Wnt участвует. напр., в формирования переднезаднего паттерна (AP) путем генерации задне-переднего градиента ядерного β-catenin (Kiecker & Niehrs 2001). Сопутствующая неканоническая передача сигналов Wnt, особенно путь планарной клеточной полярности (PCP) регулирует морфогенетические клеточные перемещения, включая convergent extension movements (CEMs) в заднем регионе (Keller 2002).

Отражением важности передачи сигналов Wnt является наличие нескольких типов секретируемых регуляторных белков для передачи сигналов Wnt, таких как sFRPs (напр., Frzb и Crescent) (Leyns et al. 1997; Wang et al. 1997; Pera & De Robertis 2000; Shibata et al. 2000), Cerberus (Bouwmeester et al. 1996; Piccolo et al. 1999), Dickkopf (Dkk) (Niehrs 2006) и Wnt-inhibitory factor (WIF) (Hsieh et al. 1999a). Из них sFRPs, Cerberus и Dkk экспрессируются в передней части Spemann-Mangold организатора, наз. головным организатором (Niehrs 2004), и предположительно препятствуют постериоризации передней области с помощью передачи сигналов Wnt (Kawano & Kypta 2003). Среди этих Wnt ингибирующих белков, Frzb был идентифицирован как первый секретируемый ингибитор Wnt (Leyns et al. 1997; Wang et al. 1997). Frzb (Hoang et al. 1996), также как и SDF5 (stromal cell-derived factor 5, синоним sFRP2) (Shirozu et al. 1996) был описан как секретируемый белок, который обладает гомологией с Wnt рецептором Frizzled (Schulte 2010). Общий домен между sFRPs и Frizzled назван cysteine rich domain (CRD) (Banyai & Patthy 1999). sFRPs также обладает Netrin (NTR) доменом, общим с Netrins и др. семействами белков, такими как белки комплемента, C3, C4 и C5, и type I procollagen C-proteinase enhancer белки (Banyai & Patthy 1999; Chong et al. 2002).

Хорошо известной функцией sFRPs является ингибирование лигандов Wnt путем непосредственного связывания. Некоторые sFRP члены играют такую ингибирующую роль для Wnt в эмбриогенезе. Напр., Frzb, который экспрессируется в головном организаторе Xenopus, ингибирует Wnt8, канонический Wnt лиганд, как постериоризующий фактор (Leyns et al. 1997; Wang et al. 1997). В соответствии с фенотипами нокаутных мышей, sFRP1, sFRP2 и sFRP5, которые обнаруживают некоторую перекрываемость своей функции, как полагают, участвуют в формировании АР паттерна позвоночных посредством канонического Wnt пути и в морфогенетических перемещениях клеток посредством Wnt PCP пути (Satoh et al. 2006, 2008; Warr et al. 2009). Также Crescent и sFRP5, как полагают, регулирует CEMs или морфогенетические перемещения клеток как антагонист Wnt лигандов, которые стимулируют PCP путь. Crescent экспрессируется в головном организаторе и связывает не только Wnt3a и Wnt8, которые в основном активируют канонический путь, но и также Wnt4, Wnt5a и Wnt11, которые в основном активируют неканонические пути, участвуя в основном в регуляции CEMs в задней области (Pera & De Robertis 2000; Shibata et al. 2005). Подобно Crescent, sFRP5 может связывать и противодействовать Wnt5a и Wnt11 при спецификации и морфогенезе кишечника, при этом Wnt11 активирует как каноническую, так и не каноническую передачу сигналов (Li et al. 2008). Т.о., sFRPs как было установлено, действуют как копии Wnts в экспериментах по избыточной или недостаточной функции. Более того, необходимо отметить, что были описаны и др. функции некоторых sFRPs, такие как регуляция ведния аксонов путем соединения с Frizzled рецепторами, вмешательство в передачу сигналов BMP путем действия как proteinase ингибиторы (see below for Sizzled and Crescent) и ингибирование апоптоза путем взаимодействия с integrin-fibronectin комплексом (rev. [Bovolenta et al. 2008]). Т.о., sFRPs обладают разными и множественными функциями в зависимости от контекста.

Signaling area of Wnt expanded by sFRPs

Несмотря на важность Wnt белков как морфогенов в формировании паттерна в крыловых дисках Drosophila и в формировании АР паттерна AP в раннем эмбриогенезе позвоночных, известны лишь немногие сообщения о регуляторных механизмах в пределах передачи сигналов Wnt. Для выяснения механизма формирования АР паттерна, диффузные свойства Wnt и sFRP, которые экспрессируются сзади или спереди, соотв., должны быть ключевым фактором. Поэтому была начата визуализация Wnt лигандов. Была сконструирована простая система для проверки диапазона распределения секретируемых белков (Fig. 1A,B). В такой системе можно легко наблюдать Venus-нагуруженные белки во внеклеточном пространстве, секретируемые их клетками источником. С помощью этого метода мы установили, что Frzb и Crescent распределяются по всему эмбриону, тогда как Wnt8 и Wnt11 не распространялись или едва обнаруживались в области удаленной от области источника (Fig. 1C) (Mii & Taira 2009). Такое значительное различие в диапазонах между sFRPs и Wnts подвигло нас на исследование диапазона распределения Wnt лигандов с ко-экспрессируемыми sFRPs. Интересно, что пределы распределения Wnt8 и Wnt11 расширялись при совместной экспрессии с Frzb и Crescent (see Fig. 1C for the combination of Wnt8 and Frzb), за исключением комбинации Wnt11 и Frzb, которая обнаруживала слабое взаимодействие (Shibata et al. 2005). Важно, мы также показали, что sFRPs могут также расширять пределы Wnt8, несмотря на свою функцию как ингибиторов Wnt, указывая на др. регуляторную систему для передачи сигналов Wnt (Mii & Taira 2009).

Хотя молекулярный механизм диапазона экспансии остается неясным, мы предполагаем следующий механизм (Fig. 2). Wnt лиганды, как полагают, взаимодействуют с heparan sulfate proteoglycans (HSPGs) (Lin & Perrimon 1999; Tsuda et al. 1999; Ohkawara et al. 2003) и Frizzled рецепторами (Bhanot et al. 1996; Hsieh et al. 1999b). Wnts также модифицируются липидами (Willert et al. 2003; Takada et al. 2006) и возможно взаимодействуют с плазматической мембраной. Благодаря таким взаимодействиям Wnt лиганды обнаруживают тенденцию оставаться вблизи области источника. Если сосуществуют sFRPs, то Wnts становятся более диффузионными, возможно связывание с sFRPs ингибирует взаимодействия между Wnt лигандами и HSPGs и/или с плазматической мембраной. Как результат Wnt-sFRP комплекс становиться более диффузионным, это ведет к более широкому распределению. Поскольку межбелковые взаимодействия обычно обратимы, то пределы передачи сигналов Wnt могут быть расширены с помощью sFRPs.

Анализ паттернов генной экспрессии у ранних эмбрионов кур и мышей показывает, что Wnts экспрессируются в заднем регионе, а sFRPs экспрессируются в переднем регионе, (Chapman et al. 2004; Kemp et al. 2005), как было установлено, у Xenopus (see Fig. 2). Исследования с использованием amphioxus и асцидий показали, что такое распределение Wnts и sFRPs в основном законсервировано у хордовых (Sasakura et al. 1998; Holland 2002; Lamy et al. 2006; Yu et al. 2007). Поскольку Wnts и sFRPs оба секретируются, то было предположено, что они формируют "противоположные градиенты", задне-передний и передне-задний, соотв. Пока противоположные градиенты Wnts и sFRPs понимались как постулат, что sFRPs являются не более чем ингибиторами передачи сигналов Wnt. Однако наши находки указывают на то, что они могут расширять пределы Wnt для формирования АР паттерна (Fig. 2).

Интересно, что Wg у Drosophila, как полагают, является долгоживущим морфогеном (Neumann & Cohen 1997), в противовес нашим результатам для Xenopus. Поскольку Drosophila, по-видимому, потеряла sfrp гены (Lee et al. 2006b; Bovolenta et al. 2008), она могла выработать специальные механизмы вместо использования sFRPs (обсудим его позже).

Помимо формирования АР паттерна у позвоночных, существует множество Wnt лигандов и множество sFRPs, экспрессирующихся в разных частях эмбриона. Хотя всесторонние специфичности связывания Wnts и sFRPs пока не исследованы, могут существовать различные комбинации между Wnt лигандом и sFRP с разным сродством связывания и с разными эффектами на передачу сигналов Wnt. Напр., sFRP3 (синоним Frzb) соединяется с Wnt3a, но не ингибирует каноническую передачу сигналов Wnt, активируемую с помощью Wnt3a (Galli et al. 2006). Сд возможно. что sFRP3/Frzb функционирует как транспортер Wnt3a, как показано в нашем исследовании. Помимо формирования АР паттерна AP различные Wnt лиганды играют разнообразные роли в эмбриогенезе. Привлекательна идея, что поскольку Wnt сам по себе является морфогеном на короткие расстояния, с помощью sFRPs в качестве модуляторов пределов, область передачи сигналов Wnt оказывается контролируемой.

"More or less" sFRPs in cancer

Т.к. int-1, первое название гена wnt1, был первоначально идентифицирован как онкоген, то избыточная передача сигналов Wnt/β-catenin может приводить к туморогенезу (Nusse & Varmus 1982; Rubinfeld et al. 1993; Su et al. 1993). Как ожидается, исходя из того факта, что sFRPs могут модулировать передачу сигналов Wnt, пертурбации sfrp генов также приводили к туморогенезу (Table 1). Интересно, что как усиление, так и подавлении экспрессии sfrp ассоциирует с туморогенезом. Подавление sfrp генов и последующая активация β-catenin предсказуемы, учитывая, что они являются ингибиторами Wnt. Однако в некоторых случаях усиление активности sfrp генов сопровождается накоплением в ядре β-catenin. Одной из возможностей является то, что sFRPs усиливают диффузию и доступность Wnt лигандов, как мы продемонстрировали на эмбрионах Xenopus (Mii & Taira 2009), это усиливает каноническую передачу сигналов Wnt, приводя к туморогенезу.

Table 1. Secreted Frizzled-related proteins (sFRPs) in cancer

Gene Kind of cancer Species Up- or downregulation of sfrp expression Reference sfrp1 Colorectal cancer Human Down Caldwell et al. 2004 Renal cell carcinoma Human Down Dahl et al. 2007 Hepatocellular carcinoma Human Down Huang et al. 2007 sfrp2 Mammary gland tumors Dog Up Lee et al. 2004 Renal cell carcinoma Human Up Yamamura et al. 2010 sfrp3/frzb Renal cell carcinoma Human Both up and down Hirata et al. 2010 sfrp4 Osteomalacia Rat Up (inhibits Wnt/?-catenin signaling) Berndt et al. 2003 Colorectal carcinoma Human Up Feng Han et al. 2006 sfrp5 Renal cell carcinoma Human Down Kawakami et al. 2011

Филогенетический анализ sfrp генов позвоночных включает вновь обнаруженные паралоги

Чтобы понять, как sfrp взаимодействуют с wnt генами, мы рассмотрим эволюционное происхождение sfrp генов (see reviews [Guder et al. 2006; Lee et al. 2006b] for the evolution of wnt genes). Существование секретируемых белков, названных "SFRPs", также как и тех из Wnts, было описано у demosponge Amphimedon queenslandica, но эти белки были лишены NTR домена. "Настоящие sFRPs," которые имели как CRD, так и NTR домен, обнаружены у др. губки demosponge, Lubomirskia baicalensis (Adell et al. 2007; Adamska et al. 2010), подтвердив, что sFRPs регулируют передачу сигналов Wnt , начиная с ранней истории Wnt. В геноме морских анемон Nematostella vectensis, имеется два sfrp гена, которые содержат и CRD и NTR домен (Adamska et al. 2010). Принимая во внимание, что появление губок было paraphyletic, было предположено, что общий родоначальник eumetazoans развился из одной из губок, которая имела "настоящие sFRPs." Учитывая этот эволюционный сценарий интересно отметить, что Drosophila, по-видимому, потеряла sfrp гены во время эволюции, поскольку др. protostomes, включая Caenorhabditis elegans и планарии, содержат sfrp гены (Gurley et al. 2010; Harterink et al. 2011).

Существуют три группы паралогов sfrp и от пяти до восьми sfrp паралогов в геноме позвоночных. Эти количества меньше числа членов семейства Wnt, которое содержит 12 групп паралогов у eumetazoan и в целом 19 паралогов в геноме мыши ([Garriock et al. 2007], see also the Wnt homepage: http://www.stanford.edu/group/nusselab/cgi-bin/wnt/). Мышь и человек, как полагают, содержат пять sfrp генов, sfrp1 sfrp2, frzb (sfrp3), sfrp4 и sfrp5. Здесь мы опишем crescent ген в геноме человека и опоссума, который не был описан ранее. Помимо этих генов имеют на два sfrp гена больше, sizzled и один недавно обнаруженный экспрессирующимся в sequence tags (ESTs) у Xenopus laevis и Silurana tropicalis (обычно наз. Xenopus tropicalis), названный sfrp2-like 1 (sfrp2l1). Представляемые нами гены в Table 2.

Table 2. Newly annotated sfrp genes

 
Gene              Species             Accession number                     Notes    *Ensemble peptide ID.
crescent          Human            XM_003120401           Annotated as sfrp5-like
crescent           Opossum        Not assigned
sfrp2-like 1       Xenopus laevis        NM_001105267        sfrpx (provisional)
sfrp2-like 1       Xenopus tropicalis        NM_001097341        sfrpx (provisional)
sfrp2-like 1       Stickleback                                                                          *ENSGACP00000010386
sfrp2-like 1       Medaka                                                                         *ENSORLP00000013980

Проявления такого генетического разнообразия в этом семействе и их множественные функции, упомянутые выше, по-видимому, являются характерным признаком семейства sFRP. Хотя филогенетические взаимоотношения sFRPs позвоночных и описаны (Jones & Jomary 2002; Kawano & Kypta 2003), синтенические взаимоотношения пока не описаны (see a reference [Garriock et al. 2007] for syntenic analysis of wnt genes). Поэтому мы осуществили всесторонний анализ для всех позвоночных sFRPs с их картами синтении (Fig. 3) и было сформировано филогенетическое древо с помощью ClustalW alignment инструмента и метода neighbor-joining (Fig. 4). Как сообщалось ранее (Bovolenta et al. 2008), гены sfrp позвоночных классифицируются на три подсемейства, sfrp1/2/5, frzb/sfrp4 и crescent/sizzled (Figs 3, 4). Мы установили, что помимо этих членов паралогов имеются видо-специфичные sfrp у рыб и лягушек.

sfrp2 и sfrp2-like 1 in fishes and frogs

Мы установили, что рыбы и лягушки имеют др. sfrp2 паралог, наз. sfrp2-like 1 (sfrp2l1), в их геноме, тогда как амниоты, по-видимому, имеют единственный sfrp2 ген, поскольку BLAST поиск не выявил sfrp2l1 в геномах кур, мышей и человека. Анализ синтении показал, что синтения sfrp2l1 законсервирована у рыб и лягушек, подтверждая, что амниоты утеряли sfrp2l1.

crescent but not sizzled in mammals

Два близко родственных гена, crescent и sizzled, как было установлено, присутствуют у позвоночных за исключением млекопитающих. Однако, мы установили, что ген crescent в геноме человека и опоссума находятся в одном и том же синтеничном регионе как и у др. позвоночных (Figs 3, 4), используя National Center for Biotechnology Information (NCBI) и Metazome tblastn программы с белковыми последовательностями куринного Crescent в качестве образца. Мы также обнаружили следы гена crescent в соотв. регионе генома мыши (в интроне 2 гена P4htm млекопитающих); однако, кодирующая последовательность прерывается множественными стоп кодонами, указывая, что мыши теряют ген crescent. Мы не нашли генов sizzled в геномах млекопитающих с помощью BLAST поиска.

Nomenclature of sfrp genes

Предлагается номенклатура генов sfrp. (i) Независимо идентифицированные SARPs (secreted apoptosis-related proteins) Sarp1, Sarp2 и Sarp3, исключенные из семейства sFRP (Melkonyan et al. 1997); Однако отметим, что нумерация не согласуется с той, что в табл. 3. (ii) frza др. название sfrp1. (iii) sfrp3 др. название frzb. X. laevis имеет два frzb гена, frzb и frzb-1. Мы сравнили кодирующие последовательности этих X. laevis frzb (Wang et al. 1997) и frzb-1 (Leyns et al. 1997) генов и X. tropicalis frzb, используя ClustalW (data not shown), и установили, что frzb и frzb-1 являются ортолагами X. tropicalis. X. laevis является аллотетраплоидным или амфидиплоидным и, следовательно, обычно имеет два родственных гена, наз. homoeologues. Следовательно, frzb и frzb-1 , скоре всего, являются "homoeologues" у X. laevis. (iv) frzb-2 др. название crescent; Однако это название довольно спорно, поскольку crescent не является близким родственником frzb. Ещё более спорно, frzb-2однажды стал использоваться как sfrp4 человека (James et al. 2000). (v) У X. laevis описаны два sizzled гена, названные sizzled и sizzled2 (Salic et al. 1997; Bradley et al. 2000). Мы сравнили кодирующие последовательности этих двух X. laevis sizzled генов с X. tropicalis sizzled (data not shown), и установили. что sizzled и sizzled2 , скорее всего, являются homoeologues. В целом мы выявили исчерпывающую информацию о sfrp генах позвоночных.

Table 3. Nomenclature of sfrp genes in vertebrates

 
Approved names        Provisional name        Suggested name        Also known as

sfrp1 (Mmu)                          sarp2 (Mmu, Hsa)        frza (Bta)
sfrp2 (Mmu)                          sarp1(Mmu, Hsa)        sdf5 (Mmu)
frzb (Mmu)                          sfrp3 (Mmu, Hsa)        frzb-1 (Xla; homoeologue)
sfrp4 (Mmu)                          frzb-2 (Hsa)        ddc-4 (Rno)
sfrp5 (Mmu)                          sarp3 (Mmu, Hsa)
crescent (Gga)        frzb2 (Xtr)        crescent        frzb-2 (Xla)        sfrp5-like (Hsa)
sizzled (Xtr)                          sizzled2 (Xla; homoeologue)
         sfrpx (Xtr)        sfrp2-like 1
tlc (Dre)

Abbreviations for species names are as follows: Hsa, Homo sapiens; Mmu, Mus musculus; Rno, Rattus norvegicus; Gga, Gallus gallus; Xla, Xenopus laevis; Xtr, Xenopus tropicalis; Dre, Danio rerio. Approved names are according to Mouse Genome Informatics for sfrp1, sfrp2, frzb, sfrp4, and sfrp5, Xenopus laevis and Xenopus tropicalis biology and genomics resource for sizzled and sfrp2l1, and The Zebrafish Model Organism Database for tlc.

Regulation of BMP signaling range by binding proteins

Регуляция формирования паттерна с помощью BMP/Dpp и его антагониста Chordin (Chd)/Short gastrulation (Sog) наиболее активно исследуемая система морфогенов на молекулярном уровне. Эта ситуация сходна с таковой для Wnts и sFRPs, поэтому заслуживает обсуждения здесь. Drosophila и позвоночные используют BMP/Sog системы для создания градиента морфогена для формирования дорсовентрального паттерна (DV) в раннем эмбриогенезе, включая нейральную индукцию у позвоночных (De Robertis & Kuroda 2004). По сравнению с системой Wnt-sFRP, система BMP-Chd (Dpp-Sog у Drosophila), по-видимому, сложнее, поскольку эта система использует дополнительные факторы, такие как Twisted gastrulation (Tsg) и Tolloid (Tld). Tld и родственные ей протеазы необходимы для расщепления Chordin, чтобы высвободить BMP лиганды (Blader et al. 1997; Marques et al. 1997; Piccolo et al. 1997). Sog и Tsg облегчают диффузионную способность Dpp (Eldar et al. 2002). Shimmi et al. (2005) показали, что облегчение диффузии Dpp и Screw (Scw) гетеродимера к дорсальной срединной линии путем образования совместного комплекса Sog и Tsg, приводя к устойчивости формирования DV паттерна у Drosophila. Др. BMP типа лиганд, ADMP (anti-dorsalizing morphogenetic protein) экспрессируется на дорсальной стороне эмбрионов Xenopus, он противостоит вентральной экспрессии др. BMP лигандов (BMP2/4/7), и тем самым регулирует общую передачу сигналов BMP посредством петель обратной связи (Reversade & De Robertis 2005). Sizzled, член sFRPs, ингибирует протеазную активность Tld (Lee et al. 2006a; Muraoka et al. 2006). Недавно было установлено, что Crescent ингибирует Tld (Ploper et al. 2011), это разумно, поскольку crescent является ближайшим паралогом sizzled , как упоминалось выше. Принимая во внимание облегчение транспорта BMP лиганда и его регуляторных факторов, Ben-Zvi et al. (2008) предпложили "shuttling" BMP лиганда и "scaling" формирования DV паттерна вместе с увеличением размера тела эмбриона. Кроме того, недавнее исследование выявило др. секретируемый белок ONT1 (Olfactomedin-Noelin-Tiarin protein 1), также вносящий вклад в устойчивость формирования DV в качестве каркаса для деградации Chordin (Inomata et al. 2008). Эти исследования продемонстрировали впечатляющее множественное участие в устойчивости и автономности формирования DV паттерна у Xenopus и Drosophila. По сравнению с BMP-Chd системой, система Wnt-sFRP значительно проще. Однако без др. регуляторных белков, равновесие связывания Wnt с Frizzled и sFRP может происходить в сходном порядке, поскольку sFRPs содержат CRD также как и Frizzled рецептор, а описанное сродство Wnt-Frizzled и Wnt-sFRP одного и того же порядка (Hsieh et al. 1999b; Wawrzak et al. 2007). Альтернативно, др. факторы, которые участуют в системе Wnt-sFRP, еще ожидают своего открытия. Тем не менее имеется общее между Wnt-sFRP и BMP-Chd системами, в том, что т. наз. связывание "inhibitors" усиливает диффузию лигандов, указывая тем самым, что эти системы обладают некоторыми преимуществами, включая устойчивость или гибкость или оба, в целом.

Mechanisms proposed for morphogen gradient formation

Хотя идея морфогенов широко принята, несколько механизмов предложено для формирования градиентов или транспортирования морфогенов, особенно у Drosophila (see a review [Zhu & Scott 2004]).Мы сконцентрируемся на внеклеточной регуляции образования градиента. В крыловом диске Drosophila существуют разнообразные механизмы, включая пассивную диффузию (Strigini & Cohen 2000), "argosomes/lipoprotein particles" (Greco et al. 2001; Panakova et al. 2005), "cytonames" (Roy et al. 2011) и "transcytosis" (Entchev et al. 2000). Даже в ситуации, где доминирует пассивная диффузия, всё оказывается не столь уж простым, поскольку существуют разнообразные молекулы, которые обнаруживают взаимодействия с Wg/Wnt, Dpp/BMP и Hh лигандами. Интересно, что несколько групп сообщили, что мутации синтеза сахарной цепи или модифицирующих энзимов или мутации heparan sulfate proteoglycans (HSPGs), такие как Dally и Dally-like сильно снижают внеклеточные уровни лигандов (Dpp, Wg, and Hh) в крыловых дисках дрозофилы (Kirkpatrick et al. 2004; Takei et al. 2004; Han et al. 2005). Этот феномен указывает на то, что эти морфогены основательно связаны HSPGs во внеклеточных пространствах и могут распространяться в тканях посредством "ограниченной диффузии", при которой2 лиганд диффундирует только, когда он высвобождается от HSPGs или др. компонентов extracellular matrix (ECM). Следовательно, ECMs (особенно HSPGs), по-видимому, важны для определения поля диффузии морфогена , или матрикс может быть основной потребностью для формирования градиента (see reviews [Yan & Lin 2009; Nishihara 2010]). С этой точки зрения, HSPGs, как полагают, удерживают соотв. концентрации для взаимодействий лиганд-рецептор помимо их функций в качестве корецепторов (rev. [Bernfield et al. 1999]).

Рецепторы не только передают сигналы, но и также могут влиять на распределение лиганда, как показывает Patched, активность которого усиливается с помощью Hh, путем регуляции негативной обратной связи (Chen & Struhl 1996) и избыточной экспрессии Fz2 у эмбрионов Drosophila (Cadigan et al. 1998). Однако в др. ситуациях рецепторы косвенно влияют на образование градиента. Напр., удаление и Fz и Fz2, или их корецептора Arrow (LRP5 и LRP6 у позвоночных) усиливает активность Dally-like и, следовательно, повышает уровень внеклеточного Wg (Han et al. 2005). Более того, некоторые лиганды, такие как Wnt и Hh, как было установлено, модифицируются липидами (Porter et al. 1996; Pepinsky et al. 1998; Willert et al. 2003; Takada et al. 2006). Путем гидрофобдных взаимодействий лигандов с плазматической мембраной, липидные модификации могут регулировать концентрации лиганда и области передач сигналов, как это наблюдается для HSPGs (rev. [Miura & Treisman 2006]). Помимо этих внеклеточных регуляций, упомянутых выше, внутриклеточные процессы, такие как интернализация лигандов с помощью эндоцитоза, может влиять на градиенты морфогена (Dubois et al. 2001; Le Roy & Wrana 2005). Т.о., многие факторы могут прямо или косвенно участвовать во внеклеточном распределении лигандов.

Хотя существуют различные механизмы, участвующие в формировании градиентов морфогенов у Drosophila, пассивная диффузия, по-видимому, доминирует у эмбрионов позвоночных, как видно на примере Activin и Nodal белков (McDowell et al. 2001; Williams et al. 2004). По сравнению с Drosophila, имеется не столь много исследоваий морфогена и heparan sulfate в эмбриогенезе позвоночных; однако необходимо отметить две замечательные работы. Используя анимальную шапочку Xenopus , Ohkawara et al. (2002) показали, что диапазон передачи сигналов BMP4, который действует на короткое расстояние, определяется его N-терминальной базовой аминокислотной сердцевиной, которая, как полагают, соединяется с HSPGs. Harada et al. (2009) предложили модель, согласно которой сродство FGF9 к HSPGs регулирует диапазон распределения и передачи сигналов у мышей. Т.о., сродство связывания лигандов с ECM или клеточной мембраной, по-видимому, являются важными факторами для определения пределов диффузии и передачи сигналов.

Итак, градиенты морфогенов формируются разными механизмами с вовлечением различных молекул и их взаимодействий. Однако анализ формирования градиента морфогена с использованием животных моделей позвоночных всё ещё ограничен.

Quantitative and theoretical ways to analyze gradient formation

Среди множества процессов эмбриогенеза диффузия морфогена и последующее формирование паттерна обнаруживает тесное взаимоотношение с количественной биологией и теоретической биологией со времен Тьюринга. Во многих публикациях пределы передачи сигналов морфогена часто описывают как "длинные" или "короткие" (Williams et al. 2004; Clevers 2006). Очевидно, что пределы передачи сигналов являются важным фактором для понимания формирования паттерна, управляемого морфогеном, и, по-видимому, соответствует пределам распространения лиганда (Takei et al. 2004; Mii & Taira 2009). Поэтому визуализация лиганда с помощью флюоресцентного белка или эпитопных меток является информативным способом исследования пределов передачи сигналов. Однако пределы распределения лиганда самого по себе определяется многими параметрами. Напр., "медленная диффузия и медленная деградация" и "быстрая диффузия и быстрая деградация" могут давать сходные пределы распределения. Поэтому более важно описать природу морфогена количественным способом. На молекулярном уровне распределение лиганда может быть предопределено комбинацией врожденных диффузионных свойств, скоростью продукции и деградации, формой внеклеточного пространства и сродством связывания ECM и плазматической мембраны. Эти феномены могут быть описаны в некоторых физических или химических константах или коэффициентах. С развитием техники изображений в живую становится возможным влиять на динамическое поведение формирования градиента морфогена (Mavrakis et al. 2010).

Кстати, fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) является стандартной техникой для анализа коэффициента диффузии и родственных свойств интересующих белков (Sprague & McNally 2005), но большинство исследований использует анализ белков внутри клетки. Среди прочих, Kicheva et al. (2007) впервые применили FRAP метод для анализа формирования внeклеточного градиента морфогена в крыловом диске мух, показали, что FRAP является пригодным методом для анализа динамики градиента Dpp. Альтернативно, time-lapse imaging экзогенных меченных белков может быть использовано для измерения коэффициента диффузии. Thorne et al. (2008) измеряли коэффициент диффузии меченного lactoferrin в ткани головного мозга, который был инъецирован с помощью микропипетки. Их количественный анализ показал, что heparan sulfate обладает высокой ёмкостью и низким сродством связывания лигандов, тогда как рецепторы имеют низкую ёмкость и высокое сродство во внеклеточном пространстве.

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) является ещё одним методом анализа диффузии белка. Используя FCS, коэффициент диффузии FGF8 был недавно измерен у эмбрионов рыбок данио (Yu et al. 2009). Они сообщили, что большая часть лиганда свободно диффундирует, а коэффициент диффузии FGF8, измеряемый с помощью FCS значительно выше, чем таковой для Dpp и Wg, измеренный у эмбрионов Drosophila с помощью FRAP (Kicheva et al. 2007). Учитывая эффект эндоцитоза на формирование градиента, они предположили "source-sink" механизм, согласно которому свободно диффундирующий морфоген и деградация с помощью эндоцитоза определяют форму градиента. Это исследование ставит интересный вопрос, что делает измеренный коэффициент диффузии FGF8 столь отличным от таковых для Dpp и Wg (Schier & Needleman 2009). Такого типа исследования важны, поскольку они предоставляют параметры, которые могут быть использованы для конструирования моделей и моделирования теоретических исследований. Также как и Ben-Zvi et al. (2008) была предложена модель BMP-Chd кругооборота (shuttling) на комбинации экспериментальных и теоретических подходов. Эти подходы только что разработаны, но вскоре станут более популярными и более важными в области биологии развития.

Conclusions and perspectives

Intracellular signal transduction after the reception of a signaling ligand/morphogen has been intensively studied, thanks to molecular biology and biochemistry. On the other hand, extracellular regulation for morphogens has remained relatively unexplored. To date, various extracellular behaviors of secreted proteins have been reported as we reviewed above. However, we have not fully understood the relationship among “molecular movement”, “affinity to ECM or cell surface”, and “signaling range.” For investigating this attractive field, new methods, technologies, and ways of thinking will be required. Especially, live-imaging using fluorescence, quantitative analysis and physical or mathematical analyses will become more and more important. To understand extracellular events, computational simulation and mathematical modeling will be also necessary. With combination of “wet” experiments and “dry” analyses will solve problems outside the cell.

Secreted Wnt “inhibitors” are not just inhibitors: Regulation of extracellular Wnt by secreted Frizzled-related proteins Yusuke Mii, Masanori Taira Development, Growth & Differentiation Volume 53, Issue 8, pages 911–923, October 2011 | DOI: 10.1111/j.1440-169X.2011.01299.x

Secreted Wnt “inhibitors” are not just inhibitors: Regulation of extracellular Wnt by secreted Frizzled-related proteins
Yusuke Mii, Masanori Taira
Development, Growth & Differentiation Volume 53, Issue 8, pages 911–923, October 2011 | DOI: 10.1111/j.1440-169X.2011.01299.x